PEMBUATAN ANTIGEN KOKTO UNTUK SERUM ASCOLI Koko Barkah Balai Penelitian Veteriner, Jalan R.E. Martadinata 30, Bogor 11614 PENDAHULUAN Antraks atau radang limpa adalah penyakit menular pada hewan yang disebabkan oleh bakteri Bacillus anthracis. Penyakit ini bisa menular pada manusia dan dikelompokkan ke dalam penyakit zoonosis yang sangat berbahaya. Di Indonesia, penyakit ini telah diketahui sejak tahun 1885 (Soemanagara, 1958) dan hingga kini kejadian antraks sering dilaporkan di beberapa daerah yang dikenal sebagai daerah endemik (Ditkeswan, 1992 ; Hardjoutomo, 1996). Peneguhan diagnostik antraks di laboratorium dilakukan dengan cara kultur bakteriologik, uji biologik dengan menggunakan hewan percobaan dan pengujian serologik dengan uji ascoli. Peneguhan antraks di laboratorium Balitvet dilakukan dengan cara menggabungkan hasil dari ketiga pengujian tersebut dimaksudkan untuk meyakinkan bahwa penyebab kematian hewan yang diduga antraks disebabkan oleh B. anthracis. Dari ketiga pengujian yang dilakukan, uji ascoli merupakan teknik pengujian yang Iebih cepat dilakukan dalam peneguhan antraks. Sebagai gambaran, bahwa penetapan diagnosis antraks di laboratorium dengan pemeriksaan mikroskopik, bakteriologik dan biologik paling cepat berlangsung sampai 72 jam. Metode ascoli dapat menghemat waktu dari pada teknik lainnya, dengan uji ascoli hanya diperlukan waktu 4-6 jam Prinsip metode pengujian ascoli sangat sederhana yaitu reaksi antara presipitinogen yang terdapat pada suspensi spesimen yang mengandung sel bakteri antraks sebagai antigen dengan presipitin yang terdapat pada antiserum ascoli sebagai antibodi dan membentuk satu ikatan komplek. Hasil dari reaksi presipitasi dapat dilihat secara makroskopik. Dalam rangkaian uji ascoli ini diperlukan serum hiperimun antraks yang dibuat pada hewan percobaan kelinci. Untuk memperoleh serum hiper imun antraks tersebut diperlukan antigen kokto yang terbuat dari sel B. anthracis. Tulisan ini bertujuan untuk memberi informasi tentang teknik pembuatan antigen kokto yang diperlukan untuk memperoleh serum ascoli. BAHAN DAN ALAT Dalam pembuatan antigen kokto untuk serum ascoli di laboratorium bakteriologi Balai Penelitian Veteriner Bogor (Balitvet) menggunakan metode 237
Kudrjawzow dan Rumanow (1928) yang telah dimodifikasi oleh Hardjoutomo dan Sri Poernomo (1976). Untuk pembuatan antigen kokto tersebut dikerjakan seperti urutan sebagai berikut : 1. Penyiapan kuman B. anthracis Isolat biakan kuman B. anthracis umur 24 jam ditanam pada media agar alkalis dalam cawan petri yang mempunyai garis tengah 90 mm, kemudian dieramkan dalam inkubator dengan suhu 37 C selama 24 jam. Koloni terpilih diambil untuk ditanam ulang pada media air kaldu alkalis dalam tabung reaksi dan diinkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam. Biakan-biakan diamati kemurniannya dengan membuat sediaan di atas kaca preparat yang diwarnai menggunakan pewarnaan cepat (Giemsa) dan diperiksa di bawah mikroskop. 2. Penyiapan bahan dan alat Bahan dan alat yang dipergunakan dalam pembuatan antigen kokto antara lain : Botol yang berbentuk gepeng dengan volume 100 ml dalam keadaan steril diisi dengan butiran gelas (beads glas) dan air kaldu alkalis (ph 7,2) sebanyak lebih kurang 30 ml dan disterilkan menggunakan autoklaf (121 C, 15 Ibs). Botol Roux yang berukuran 18x18 cm dengan luas permukaan 198 cm diisi dengan media agar alkalis sebanyak 125 ml dan disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit. Bersamaan dengan itu, butiran gelas untuk panenan biakan antraks disterilkan dalam tabung reaksi atau botol. Peralatan lainnya, labu erlenmeyer ukuran 2 liter, corong gelas dan kertas sering disterilisasi kering menggunakan oven. Bahan-bahan lain yang diperlukan adalah air suling (aquadest), larutan garam NaCI dan asam cuka 50%. bahan-bahan tersebut masing-masing secara terpisah dimasukkan ke dalam botol berukuran 250 ml dan disterilkan menggunakan autoklaf. TEKNIK PENGERJAAN PEMBUATAN ANTIGEN KOKTO 1. Penumbuhan kuman antraks Biakan murni kuman antraks yang berumur 24 jam pada media agar alkalis miring dalam tabung dipindahkan kedalam media cair kaldu alkalis dalam botol gepeng dan dieramkan dalam inkubator pada suhu 37 C selama 32 jam sambil dikocok. Selanjutnya sebanyak 0,5 ml suspensi kuman dari 238
biakan media cair tersebut ditumbuhkan kembali pada media agar alkalis dalam botol Roux dan diinkubasikan selama 14-15 jam. Penamanan suspensi antraks dari media cair pada media agar dalam botol Roux dilakukan dengan menggoyangkan sehingga suspensi menutupi seluruh permukaan media agar secara merata. 2. Pemanenan kuman antraks Biakan antraks murni yang tumbuh dalam media agar botol Roux dipanen dengan cara menambahkan larutan garam faal steril sebagai pembilas dengan volume yang disesuaikan dengan pertumbuhan kuman. Untuk pertumbuhan kuman yang balk, larutan garam faal ditambahkan sebanyak 30 ml setiap botol Roux. Untuk pertumbuhan yang kurang balk sebanyak 25 ml, sedangkan untuk biakan kuman yang mempunyai pertumbuhannya jelek tidak dipakai. Untuk memisahkan biakan antraks dari media agar roux digunakan butiran gelas steril untuk mendapatkan seluruh koloni kuman dapat terambil. Kemurnian suspensi kuman antraks hasil panenan dari media agar botol roux dibuat sediaan preparat kaca dengan pewarnaan Giemsa dan dilihat di bawah mikroskop. Koloni kuman antraks murni dari botol roux dituangkan ke dalam labu erlenmeyer ukuran 2-3 liter menggunakan corong gelas yang berlapiskan kertas saring yang diberi tutup di atasnya, dengan cawan petri ukuran besar, untuk menghindari adanya pencemaran. 3. Penambahan bahan campuran antigen kokto Pada suspensi kuman antraks tersebut ditambahkan bahan-bahan lainnya. Penambahan bahan-bahan diperhitungkan dengan menggunakan faktor penghitung (sebagai faktor P). Sebagai faktor penghitungan yang digunakan adalah jumlah larutan garam faali yang ditambahkan pada perlakuan awal yaitu 25-30 ml setiap botol roux. Selanjutnya ke dalam labu erlenmeyer ditambahkan bahan-bahan sebagai berikut : - Air suling steril sebanyak 5 kali dari jumlah larutan garam faali yang dipakai (5 kali faktor P). - Larutan NaCl jenuh sebanyak 1 tetes untuk setiap 20 ml suspensi sesudah penambahan larutan terakhir yaitu (P+5P+1,2P) ml, sehingga volume larutan asam yang dibutuhkan dihitung menjadi (P+5P+1,2P)/20 x 1 tetes = 36 P tetes. Setelah penambahan seluruh bahan tersebut di atas, volume suspensi menjadi (P+5P+1,2P+0,36P) ml dan suspensi ini dimasak dengan menggunakan alat pemanas Koch pada suhu 100 C selama 45 menit. 2 39
Lokakarya Fungsional Non Peneli6 1997 4. Uji pertumbuhan dan pembuatan serbuk antigen kokto Untuk mengetahui adanya kuman antraks atau spora dari suspensi biakan antraks yang sudah dimasak tersebut. Contoh suspensi biakan tersebut diambil dan ditanam pada media agar alkalis dan dieramkan pada suhu 37 C selama 24 jam untuk diperiksa pertumbuhannya. Bila tidak ada pertumbuhan kuman antraks, suspensi dipindahkan ke dalam tabung pemusing dan diputar pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Pemusingan dimaksudkan untuk mendapatkan endapan sel kuman antraks (sedimen) secara cepat. Selanjutnya endapan sel kuman antraks tadi dicuci dengan air suling dan diputar ulang pada kecepatan dan waktu yang sama. Endapan kuman, dari hasil pencucian, yang terdapat dalam tabung pemusing dikeringkan dengan alat freeze dryer. Setelah dikeringkan endapan sel kuman antraks tersebut dikeluarkan dari tabung dan digerus menggunakan penggerusan mortir steril sehingga menjadi serbuk kering yang disebut antigen kokto. TEKNIK PENYIMPANAN ANTIGEN KOKTO Serbuk antigen kokto dimasukkan ke dalam botol-botol atau erlenmeyer yang berukuran kecil dan ditutup rapat. Jumlah serbuk antigen dari setiap botol beratnya diketahui. Gambar 1. Penyimpanan antigen kokto dalam botol-botol erlenmeyer dan dimasukkan dalam benjana eksikator yang berisi CaCI 2 240
Penyimpanan serbuk antigen kokto tersebut dimasukkan ke dalam eksikator yang berisi serbuk CaCI 2 untuk disimpan dalam waktu lama sampai dipergunakan. Antigen kokto tersebut digunakan dalam pembuatan serum ascoli. Bentuk serbuk kering antigen kokto tersebut dilarutan dalam larutan garam faal untuk pembuatan serum ascoli dengan menyuntikan antigen tersebut pada hewan percobaan kelinci. HASIL DAN PEMBAHASAN Antigen kokto yang diperoleh dari serangkaian proses pembuatan antigen tersebut di atas menunjukkan bentuk serbuk keabu-abuan. Endapan kuman sesudah dikeringkan biasanya berkonsistensi keras dan berakibat sulit untuk dijadikan bentuk serbuk. Hal ini mungkin disebabkan oleh terjadinya pemampatan sewaktu sel-sel kuman dipusingkan. Pengerasan yang terjadi selama proses pengeringan ini dapat diatasi dengan cara meluaskan permukaan lapisan endapan kuman pada cawan petri sehingga dibuat menjadi tipis dan mudah untuk dikeringkan. Waktu pengeringan mempengaruhi wama dan konsistensi antigen kokto kering yang diperoleh. Semakin lama waktu pengeringan warna antigen yang diperoleh menjadi semakin kelabu dengan konsistensi semakin keras. Pengeringan dengan menggunakan alat pengering memiliki keunggulan daripada pengeringan dengan menggunakan kertas saring. Dengan alat pengering sterilitas serbuk antigen kokto Iebih baik dan murni dibandingkan dengan menggunakan kertas saring. Gambar 2. Serbuk antigen kokto yang sudah dikeringkan dan sudah diketahui beratnya tiap dipergunakan untuk pembuatan serum ascoli 2 4 1
Lokakarya Fungsional Non Penelfi 1997 KESIMPULAN Antigen kokto terbuat dari biakan muda kuman B. anthracis yang dibunuh dengan cara perebusan dan dikeringkan dalam bentuk serbuk. Proses pengeringan dalam pembuatan antigen kokto mempengaruhi konsistensi dan warna antigen yang diperoleh. Teknik pengeringan antigen dengan menggunakan alat pengering memberikan hasil yang lebih baik dan murni dibandingkan dengan menggunakan kertas saring. Antigen kokto dapat disimpan lama dalam eksikator yang berisi serbuk CaC12. DAFTAR BACAAN Hardjoutomo, S. dan Poerwadikarta, M.B. 1995. Anthraks. Petunjuk Teknis Penyakit Hewan. Hardjoutomo, S. dan Sri Pornomo. 1976. Reaksi Presipitasi Metoda Ascoli Disederhanakan Untuk Mendiagnosa Anthrax I. Pembuatan Antigen Kokto. Bulletin LPPH. VIII (11-12) : 15-23. Kudrjawzow, G. and D. Romanow. 1928. Zur frage der Serodiagnostik bei Milzbrand. Zeitstier. f. inf. Krankh. Soemanegara, R. Md.T. 1958. Ikhtisar singkat dari penyakit radang limpa, penyakit ngorok dan radang paha di Indonesia. Hemera Zoa, LXV, no. 7-8. Sri Poemomo, Hardjoutomo, S. dan Sutarma. 1982. Reaksi Presipitasi Metode Ascoli Disederhanakan untuk Mendiagnosa Anthrax II. Pembuatan Serum Kebal Ascoli pada kelinci, Penyakit.Hewan XIV (23) : 1-4. 24 2