III. METODOLOGI A. BAHAN DAN ALAT Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah saus sambal dan minuman dalam kemasan untuk analisis kualitatif, sedangkan untuk analisis kuantitatif digunakan natrium benzoat dengan kemurnian 99 % dan saus sambal. Bahan-bahan kimia untuk analisis meliputi NaOH 10 %, HCl (1+3), eter, NH 3, FeCl 3 0.5 %, NaCl powder, kloroform, aquades, NaOH 0.05 N, H 2 SO 4, indikator PP, alkohol, dan kertas saring. Peralatan yang digunakan untuk penelitian ini antara lain blender, labu pemisah, plateform shaker, hot plate, labu takar, gelas pengaduk, pipet tetes, pipet volumetrik, desikator, buret, gelas piala, erlenmeyer, neraca analitik, rotavapor, dan ph-meter. B. METODE 1. Analisis Kualitatif Natrium Benzoat (AOAC 910.02B 1999) Persiapan Sampel a. Padatan atau semi padatan : Sampel sebanyak 50-100 g ditambah dengan 300-400 ml air. Kemudian dihancurkan dengan menggunakan waring blender. Selanjutnya campuran ditambah dengan NaOH 10 % hingga alkalis dan dibiarkan selama + 2 jam, setelah itu disaring. b. Cairan Sampel sebanyak 50-100 ml dibuat menjadi alkalis dengan penambahan NaOH 10 %. Kemudian disaring dengan kapas. Jika sampel berkadar gula tinggi, maka harus diencerkan sampai total padatan terlarut 10-15 %. Pengujian Sebanyak 100 ml atau lebih filtrat dari persiapan sampel dimasukkan ke dalam labu pemisah. Kemudian ditambahkan HCl (1+3) sampai asam
21 (gunakan kertas litmus sebagai indikator) dan ditambahkan lagi 5-10 ml HCl (1+3). Setelah itu, larutan tadi diekstrak dengan 75-100 ml eter. Jika perlu lapisan air diekstrak kembali dengan eter. Ekstrak eter dicuci sebanyak 3 kali, masing-masing dengan 5 ml air. Ekstrak eter yang telah dicuci dimasukkan ke dalam pinggan porselin dan diuapkan ke dalam penangas air. Residu yang dihasilkan mengandung asam benzoat atau eternya, asam salisilat, sakarin, dulsin, dan atau bahan terekstrak lainnya. Residu yang diperoleh dilarutkan dalam air. Jika perlu dipanaskan sampai 80-85 o C selama 10 menit. Larutan tersebut ditambahkan dengan beberapa tetes NH 3 sampai larutan menjadi basa. Kemudian larutan diuapkan untuk menghilangkan kelebihan NH 3. Residu yang tersisa dilarutkan kembali dengan air panas. Setelah itu, larutan disaring jika perlu. Ke dalam larutan ditambahkan beberapa tetes FeCl 3 netral 0.5 %. Terbentuknya endapan Ferribenzoat yang berwarna salmon menunjukkan adanya asam benzoat. Diagram alir prosedur analisis kualitatif benzoat dapat dilihat pada Lampiran 5. 2. Analisis Kuantitatif Natrium Benzoat a. Penentuan Penggunaan Pereaksi Pada tahap ini dilakukan analisis larutan natrium benzoat +1000 ppm dengan tiga perlakuan. Perlakuan 1 digunakan bahan kimia yang semuanya pro analysis (p.a) yang terdiri dari NaCl, kloroform, dan alkohol. Perlakuan 2 digunakan kloroform teknis dan alkohol teknis. Perlakuan 3 digunakan NaCl teknis, kloroform teknis, dan alkohol teknis. Analisis dilakukan secara duplo. Hasil yang didapat kemudian dilakukan uji t, uji F, dan ANOVA untuk membandingkan apakah ketiga perlakuan tersebut berbeda nyata atau tidak. Berdasarkan uji statistik yang dilakukan dan pertimbangan biaya analisis, akan dipilih satu perlakuan untuk digunakan pada analisis selanjutnya.
22 Larutan Na-benzoat 1000 ppm Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3 ppm Na-benzoat ppm Na-benzoat ppm Na-benzoat Uji t, F, dan ANOVA b. Analisis Saus Sambal Saus Sambal Dianalisis 7 kali (ekstraksi dengan labu pemisah) Dianalisis 7 kali (ekstraksi dengan shaker) Presisi Presisi Uji t, F, dan ANOVA c. Uji Banding Antar Laboratorium Saus Sambal Dianalisis di laboratorium yang telah terakreditasi Uji t, F,dan ANOVA dengan hasil yang didapat dari metode titrimetri
23 d. Prosedur Analisis Kuantitatif Natrium Benzoat Secara Titrimetri (AOAC 963.19 1999) Persiapan Sampel a. Prosedur Umum Sampel dihomogenkan, jika sampel berupa padatan atau semi padat maka harus dihaluskan. Sebanyak 150 ml atau 150 g sampel dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml. Kemudian ditambahkan NaCl powder secukupnya untuk menjenuhkan air dalam sampel. Sampel dibuat menjadi alkalis (periksa dengan kertas lakmus) dengan penambahan NaOH 10 % atau dengan suspensi Ca(OH) 2 (satu bagian Ca(OH) 2 disuspensikan dalam tiga bagian air). Setelah itu, campuran tersebut diencerkan sampai tanda batas dengan larutan NaCl jenuh dan dikocok berulang kali. Larutan dibiarkan selama + 2 jam, dikocok berulang kali, dan disaring. Jika contoh mengandung banyak lemak, bagian yang saringannya terkontaminasi oleh lemak ditambahkan beberapa ml larutan NaOH 10 % ke dalam saringan, kemudian diekstrak dengan eter sebelum penetapan selanjutnya. Jika sampel mengandung alkohol, perlakuan seperti cara d. Jika sampel mengandung sejumlah bahan yang dapat diendapkan oleh larutan NaCl, perlakuan seperti cara e b. Sampel Saus Tomat Ke dalam 100 g sampel ditambahkan 15 g NaCl powder dan campuran dipindahkan ke dalam labu takar 500 ml kemudian dicuci wadah semula dengan +150 ml larutan NaCl jenuh. Larutan dibuat menjadi alkalis dengan NaOH 10 % dan diencerkan dengan larutan NaCl jenuh sampai tanda tera. Larutan dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok setiap selang waktu tertentu, disentrifuse jika perlu, kemudian disaring.
24 c. Sampel Jeli, Jam, dan Marmalades Dihancurkan 150 g sampel di dalam 300 ml larutan NaCl jenuh kemudian ditambahkan 15 g NaCl dan dibuat menjadi alkali dengan suspensi Ca(OH) 2. Selanjutnya dipindahkan larutan tersebut ke dalam labu takar 500 ml dan diencerkan dengan larutan NaCl jenuh sampai tanda tera. Larutan dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok berulang kali, disentrifuse jika perlu, kemudian disaring. d. Sampel Cider yang mengandung alkohol dan produk sejenisnya Ke dalam 250 ml sampel ditambahkan NaOH 10 % sampai alkalis, kemudian diuapkan pada penangas uap sampai volume larutan menjadi100 ml. Dipindahkan sampel ke dalam labu takar 250 ml, ditambahkan 30 g NaCl powder dan dikocok sampai larut. Selanjutnya diencerkan sampai tanda tera dengan larutan NaCl jenuh. Larutan dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok berulang kali, kemudian disaring. e. Sampel Ikan asin atau Ikan yang Dikeringkan Dicuci 50 g sampel yang telah dihaluskan dalam labu takar 500 ml dengan H 2 O. Sampel dibuat menjadi alkalis dengan NaOH 10 % dan ditepatkan sampai tanda tera dengan H 2 O. Dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok secara teratur, dan disaring. Lalu dipipet sebanyak mungkin filtrat (>300 ml), dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml kedua dan ditambahkan 30 gram NaCl untuk setiap 100 ml larutan. Kemudian larutan dikocok sampai NaCl larut. Larutan tersebut diencerkan sampai tanda tera dengan larutan NaCl jenuh, dikocok sampai homogen dan disaring protein/bahan lain yang mengendap. Penetapan Sampel Sebanyak 100-200 ml filtrat sampel dipipet dan di masukkan ke dalam labu pemisah. Filtrat dinetralkan dengan penambahan HCl (1 + 3) dan ditambahkan lagi 5 ml HCl sesudah netral. Filtrat yang telah diasamkan, diekstrak dengan menggunakan kloroform (CHCl 3 ) beberapa
25 kali dengan volume kloroform 70, 50, 40, dan 30 ml. Untuk mencegah pembentukan emulsi, digoyang-goyang secara kontinyu setiap kali ekstraksi dengan gerakan rotasi. Lapisan kloroform biasanya memisah dengan mudah sesudah dibiarkan beberapa menit. Jika emulsi terbentuk, emulsi dihilangkan dengan mengocok lapisan CHCl 3 menggunakan gelas pengaduk, dengan memindahkan dan memisahkan emulsi dengan menggunakan labu pemisah lain atau dengan sentrifusa beberapa menit. Setiap kali ekstraksi selesai, diambil bagian jernih lapisan kloroform sebanyak mungkin, diusahakan jangan tercampur dengan emulsi. Jika lapisan kloroform yang diperoleh kurang jernih maka perlu dicuci dengan akuades sampai jernih. Selanjutnya seluruh ekstrak kloroform dipindahkan ke dalam cawan penguap porselen, dibilas wadah beberapa kali dengan beberapa ml CHCl 3 dan diuapkan sampai kering pada suhu kamar dalam aliran udara kering. Hasil ekstraksi dapat juga dipindahkan dari labu pemisah ke dalam erlenmeyer 300 ml dan bilas labu pemisah dengan 5-10 ml CHCl 3 tiga kali. Ekstrak tersebut didistilasi dengan lambat pada suhu rendah sampai volume ekstrak seperempat dari volume semula, kemudian diuapkan sampai kering pada suhu kamar di atas penangas air sampai tinggal beberapa tetes cairan saja yang tinggal. Selanjutnya residu dikeringkan semalaman (atau sampai tidak tercium bau asam asetat bila sampelnya adalah saus tomat) dalam desikator yang mengandung H 2 SO4 pekat. Kemudian residu asam benzoat dilarutkan dalam 30-50 ml alkohol, ditambahkan 12-15 ml air dan 1 atau 2 tetes. Diagram alir prosedur analisis kuantitatif benzoat dapat dilihat pada Lampiran 6. Perhitungan : Volume larutan ppm Na Titer x N NaOH x 144 x yang dibuat pada x 10 6 benzoat = persiapan sampel anhidrat Volume yang diambil x berat sampel x 1000 untuk penetapan