BAB II METODOLOGI PENELITIAN Penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Metode penelitian meliputi penyiapan bahan tumbuhan, penetapan kadar air, penetapan kadar minyak atsiri, isolasi minyak atsiri, formulasi sediaan, uji formulasi sediaan losion dan uji penolak nyamuk minyak atsiri dalam losion. 2.1. Alat - Alat Neraca analitik (Mettler Toledo), neraca kasar, Viskometer Stromer (Stromer Scientific), seperangkat alat penetapan kadar air, seperangkat alat stahl, seperangkat alat destilasi uap (Steam Destillation), Refraktometer Abbe, alat piknometer, lumpang porselin, stamper, alat-alat gelas, penangas air, ph meter, stopwatch, mikroskop, objek glass, deck glass, kotak untuk pengujian terhadap nyamuk. 2.2. Bahan - Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tumbuhan sereh wangi (Cymbopogon nardus (L.) Rendle), aquades, setil alkohol, asam stearat, lanolin, gliserin, metil paraben, trietanolamin, natrium sulfat anhidrat, sudan III, kloralhidrat. 2.3. Penyiapan Bahan Tumbuhan Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengambilan bahan tumbuhan, identifikasi tumbuhan, dan pengolahan bahan tumbuhan. 2.3.1. Pengambilan bahan tumbuhan Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu diambil dari satu daerah saja tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama di daerah lain. Bahan tumbuhan diperoleh di sebuah pekarangan rumah yang berada di
Jalan BrigJen Zein Hamid Gg. Kasih, Kecamatan Delitua, Kabupaten Deli Serdang Provinsi Sumatera Utara. 2.3.2. Identifikasi tumbuhan Identifikasi/determinasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor Jl. Raya Jakarta - Bogor KM 46 Cibinong, Indonesia. 2.3.3. Pengolahan bahan tumbuhan Bagian yang digunakan adalah daun sereh wangi. Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam pengambilan daun sereh wangi antara lain: 1. Pemanenan perdana dilakukan pada tumbuhan sereh wangi yang telah berumur 6-8 bulan. 2. Setiap pelepah daun memiliki 6 lembar daun tua, sedangkan daun ketujuh masih dalam keadaan menguncup. 3. Waktu pemanenan daun sereh wangi dilakukan pada pagi hari. 4. Pemotongan daun sereh wangi 5 cm di atas pelepah daun (Santoso, 1992). Daun Sereh wangi yang telah dipangkas kemudian dipilah, daun yang kering dan yang masih muda tidak di destilasi, daun sereh wangi yang dipilih adalah daun sereh wangi yang tidak kering dan sudah cukup tua. Daun sereh wangi yang sudah terkumpul, kemudian dibersihkan dari kotoran mekanis, sisasisa serangga, atau bagian tanaman lain. Jika ada bagian tanaman lain yang terikut maka akan menganggu komposisi minyak atsiri yang terisolasi (Koensoemardiyah, 2010), kemudian ditimbang. Sesudah ditimbang daun sereh wangi dikeringkan selama 3-4 jam (Santoso, 1992), selama pengeringan daun
dibolak balik untuk mencegah terjadinya fermentasi dan tumbuhnya jamur, kemudian ditimbang kembali. 2.4. Pemeriksaan Makroskopik dan Mikroskopik Daun Tumbuhan Sereh Wangi 2.4.1. Pemeriksaan makroskopik daun tumbuhan sereh wangi Pemeriksaan makroskopik meliputi pemeriksaan secara organoleptis dan visual, organoleptis meliputi pemeriksaan bentuk dan warna, sedangkan secara organoleptis meliputi pemeriksaan bau, dan rasa dari daun tumbuhan sereh wangi. 2.4.2. Pemeriksaan mikroskopik daun tumbuhan sereh wangi Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun sereh wangi yang masih segar. Daun segar diiris tipis secara melintang, hasil irisan daun sereh wangi kemudian diletakkan di atas kaca objek, lalu diteteskan kloralhidrat, dipanaskan dengan lampu spiritus dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Pemeriksaan minyak atsiri dilakukan terhadap daun sereh wangi yang dipotong melintang kemudian diteteskan dengan sudan III, ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati dibawah mikroskop dengan berbagai perbesaran. Pemeriksaan minyak atsiri dilakukan terhadap serbuk daun sereh wangi ditaburkan di atas kaca objek yang sudah diteteskan dengan sudan III, ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati di bawah mikroskop dengan berbagai perbesaran. 2.5. Penetapan Kadar Air a. Penjenuhan toluen Penjenuhan toluen menggunakan metode azeotropi. Sebanyak 200 ml toluen dimasukkan ke dalam labu alas bulat, lalu ditambahkan 2 ml air suling,
kemudian alat dipasang dan dilakukan destilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama ± 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. b. Penetapan kadar air daun sereh wangi Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g daun sereh wangi yang telah ditimbang seksama, dipanaskan hati hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kadar air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (WHO, 1998). Gambar alat dapat dilihat pada lampiran 4. Halaman 51 2.6. Penetapan Kadar Minyak Atsiri Penetapan kadar minyak atsiri dilakukan dengan menggunakan alat Stahl. Caranya: sebanyak lebih kurang 15 g daun sereh wangi dimasukkan ke dalam labu alas bulat berleher pendek, lalu ditambahkan aquades sebanyak 300 ml. Labu diletakkan di atas pemanas listrik, lalu dihubungkan dengan pendingin dan alat penampung berskala. Buret diisi penuh dengan air, selanjutnya dilakukan destilasi hingga selesai, biarkan selama tidak kurang 15 menit, catat volume minyak atsiri pada buret. Hitung kadar minyak minyak atsiri dalam % v/b (Depkes RI, 1978). Gambar alat dapat dilihat pada lampiran 4. Halaman 52
2.7. Isolasi Minyak Atsiri Isolasi minyak atsiri dari daun sereh wangi (Cymbopogon nardus (L.) Rendle) yang telah dikeringkan 3-4 jam menggunakan metode destilasi uap. Caranya: sebanyak 100 g daun sereh wangi dimasukkan ke dalam labu alas I, kemudian labu alas II diisi aquades sebanyak 1L, kedua labu alas dirangkai. Antara labu yang berisi aquades dengan labu yang berisi daun sereh wangi terpisah. Labu yang berisi air dipanaskan, lalu uapnya dialirkan ke labu yang berisi daun sereh wangi, labu yang berisi daun sereh wangi juga dipanaskan juga. Partikel-partikel minyak pada daun sereh wangi terbawa bersama uap dan dialirkan kealat pendingin, sehingga uap air yang bercampur minyak akan mengembun dan mencair kembali, selanjutnya dialirkan kealat pemisah yang akan memisahkan minyak atsiri dari air (Santoso, 1992). Kemudian minyak atsiri yang diperoleh ditampung didalam vial yang berwarna gelap, kemudian ditambahkan natrium sulfat anhidrat secukupnya, dikocok dan dibiarkan selama semalaman. Minyak atsiri dipipet dan disimpan kembali kedalam wadah gelap yang baru. Gambar alat dapat dilihat pada lampiran 4. Halaman 51 2.8. Identifikasi Minyak Atsiri 2.8.1. Pemeriksaan visual dan organoleptis Pemeriksaan visual dilakukan dengan mengamati warna minyak atsiri dan Pemeriksaan secara organoleptis dengan memeriksa bau dan rasanya. 2.8.2. Penetapan parameter fisika 2.8.2.1. Penentuan indeks bias Penentuan indeks bias dilakukan menggunakan alat Refraktometer Abbe.
Caranya: Alat dihidupkan, prisma atas dan prisma bawah dipisahkan dengan membuka klem dan dibersihkan dengan mengoleskan kapas yang telah dibasahi dengan alkohol. Cuplikan minyak diteteskan ke prisma bawah lalu ditutup. Melalui teleskop dapat dilihat adanya bidang terang dan bidang gelap lalu skrup pemutar prisma diputar sedemikian rupa, sehingga bidang terang dan gelap terbagi atas dua bagian yang sama secara vertikal. Dengan melihat skala dapat dibaca indeks biasnya. Gambar alat dapat dilihat pada lampiran 4. Halaman 52 2.8.2.2. Penentuan bobot jenis Penentuan bobot jenis dilakukan dengan menggunakan alat Piknometer. Caranya: piknometer kosong ditimbang dengan seksama, lalu diisi dengan air suling dan ditimbang. Kemudian piknometer dikosongkan dan dibilas beberapa kali dengan alkohol dan dikeringkan dengan bantuan hair dryer. Piknometer diisi dengan minyak selanjutnya dilakukan seperti pengerjaan pada air suling. Hasil bobot minyak atsiri diperoleh dengan mengurangkan bobot piknometer yang diisi minyak atsiri dengan bobot piknometer kosong. Bobot jenis minyak atsiri adalah hasil yang diperoleh dengan membagi bobot minyak atsiri dengan bobot air suling dalam piknometer (Ditjen POM, 1995). Gambar alat dapat dilihat pada lampiran 4. Halaman 53 2.9. Formulasi Sediaan Losion Konsentrasi minyak sereh wangi yang digunakan dalam penelitian ini adalah 0% (dasar losion); 0,25%; 0,5%; 0,75; 1%; 1,5%; dan 2%. Formula yang digunakan adalah:
A. Formulasi dasar losion Setil alkohol 0,5 Asam stearat 3 Lanolin 1 Gliserin 2 Metil paraben 0,10 Trietanolamin 0,75 Aquades ad 100 Cara pembuatan: Ditimbang semua bahan yang diperlukan, setil alkohol, asam stearat, lanolin dimasukkan kedalam cawan porselen (bagian I), dilebur diatas penangas air hingga suhu 75 o C, metil paraben dilarutkan kedalam aquades panas, lalu ditambah gliserin, trietanolamin (T.E.A) (bagian II). Kemudian dimasukkan bagian I kedalam lumpang porselen panas, lalu ditambahkan bagian II, diaduk sampai homogen (Balsam, 1972) B. Formulasi losion minyak sereh wangi Tabel 2.1. Komposisi losion minyak sereh wangi Sediaan Minyak sereh wangi (g) Dasar losion (g) B C D E F G 0,25 0,5 0,75 1 1,5 Keterangan : B : losion minyak sereh wangi 0,25% C : losion minyak sereh wangi 0,5% D : losion minyak sereh wangi 0,75% 2 99,75 99,5 99,25 99 98,5 98
E : losion minyak sereh wangi 1% F : losion minyak sereh wangi 1,5% G : losion minyak sereh wangi 2% Cara pembuatan : ditimbang minyak sereh wangi sesuai formula, kemudian ditambahkan dasar losion hingga mencapai 100 g, aduk homogen dan masukkan kedalam wadah yang sesuai. 2.10. Pemeriksaan Sediaan 2.10.1. Penentuan ph sediaan Penentuan ph sediaan dilakukan dengan menggunakan alat ph meter. Caranya: Alat terlebih dahulu dikalibrasi dengan menggunakan larutan dapar standar ph netral ph 7 hingga alat menunjukkan harga ph tersebut. Kemudian elektroda dicuci dengan aquades, lalu dikeringkan dengan tissue. Sampel dibuat dengan konsentrasi 1% yaitu ditimbang 1 gram sediaan dan dilarutkan dalam 100 ml aquades. Kemudian elektroda dicelupkan dalam larutan tersebut, dibiarkan alat menunjukkan harga ph sampai konstan. Angka yang ditunjukkan ph meter merupakan harga ph sediaan (Rawlins, 2003). 2.10.2 Penentuan tipe emulsi Menggunakan metode zat warna. Sejumlah tertentu sediaan diletakkan di atas objek gelas, ditambahkan 1 tetes metil biru, di aduk dengan batang pengaduk. Tutup dengan kaca penutup dan di amati dibawah mikroskop. Bila metil biru tesebar merata berarti sediaan tersebut tipe emulsi m/a, tetapi bila hanya bintikbintik biru berarti sediaan tersebut tipe emulsi a/m (Ditjen POM, 1979). 2.10.3. Penentuan sifat alir sediaan Sistem yang diuji ditempatkan dalam ruang antara mangkuk dan rotor. Sebuah beban ditempatkan pada penggantungnya dan waktu yang dibutuhkan
oleh rotor untuk berputar 100 kali dicatat. Data ini kemudian diubah menjadi rpm (rotation per minute = putaran per menit). Beban ditambah dan seluruh prosedur tersebut diulangi. Dengan cara ini dapat digambarkan suatu rheogram dengan jalan memplot rpm terhadap beban yang ditambahkan (Martin, 1993). 2.10.4. Pengamatan stabilitas sediaan Masing-masing formula dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditutup bagian atasnya dengan plastik. Selanjutnya pengamatan dilakukan pada saat sediaan selesai dibuat, dan setiap minggu selama 3 bulan dan dilakukan pada temperatur kamar. Bagian yang diamati meliputi pecah atau tidaknya emulsi dan pemisahan fase, perubahan warna dan perubahan bau dari sediaan. 2.10.5. Pemeriksaan homogenitas Sejumlah tertentu sediaan dioleskan pada kaca transparan. Sediaan harus menunjukkan susunan yang homogen yang tidak terlihat adanya butir-butir kasar (Ditjen POM, 1979). 2.10.6. Uji iritasi Uji iritasi dilakukan terhadap sediaan losion minyak sereh wangi, dengan maksud untuk mengetahui bahwa losion yang dibuat dapat menimbulkan iritasi pada kulit atau tidak. Teknik yang digunakan pada uji iritasi ini adalah uji tempel terbuka pada lengan bawah bagian dalam terhadap 10 orang sukarelawan. Kriteria sukarelawan yaitu : pria/wanita sehat, usia 20-30 tahun, tidak ada riwayat penyakit alergi, bersedia menjadi sukarelawan. Uji tempel terbuka dilakukan dengan mengoleskan sediaan yang dibuat sebanyak 0,5 g (Tranggono, 2007), dibiarkan terbuka dan diamati apa yang terjadi. Uji ini tiga hari berturut-turut untuk setiap sediaan losion minyak sereh wangi.
2.11 Uji Kesukaan (Hedonic Test) Uji kesukaan ini dilakukan untuk mengetahui tingkat kesukaan sukarelawan terhadap sediaan yang dibuat dengan sediaan yang beredar dipasaran (menggunakan DEET) Uji kesukaan ini dilakukan secara visual terhadap 30 orang sukarelawan. Setiap sukarelawan diminta untuk mengoleskan setiap sediaan pada kulit punggung tangannya. Kemudian sukarelawan memilih sediaan losion mana yang paling disukainya. Sukarelawan menuliskan S bila suka dan TS bila tidak suka. Parameter pengamatan pada uji kesukaan adalah kemudahan dituang dari wadah, lengket atau tidaknya sediaan pada kulit, homogenitas dan wangi yang dihasilkan saat dioleskan pada kulit punggung tangan. 2.11. Pembiakan Nyamuk Kotak yang disediakan untuk pembiakan nyamuk berukuran 45x30x30 cm. Nyamuk yang digunakan untuk pengujiaan dibiakkan dalam kotak. Pembiakan dilakukan dengan cara memasukkan jentik-jentik nyamuk dalam wadah berisi air sebagai media. Dibiarkan 2 sampai 3 hari hingga jentik-jentik berubah menjadi nyamuk. 2.11. Uji Daya Tolak Terhadap Nyamuk Uji dilakukan pada tangan 10 orang sukarelawan, umurnya sekitar 18-56 tahun. Tangan yang satu diolesi dengan losion minyak sereh wangi hingga siku dan yang satu lagi tidak di olesi. Kemudian dimasukkan ke dalam kotak berisi nyamuk, biarkan selama 2 jam untuk konsentrasi minyak sereh 0%; 0,25%; 0,5%; 0,75%; 3 jam untuk konsentrasi minyak sereh 1%, 4 jam untuk konsentrasi minyak sereh 1,5% dan 5 jam untuk konsentrasi minyak sereh 2%. Lalu di amati gigitan nyamuk dan dihitung jumlahnya.