18 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilakukan pada bulan September 2011 sampai Desember 2011 bertempat di Laboratorium Atsiri, Pusat Penelitian Kimia, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Kawasan PUSPIPTEK, Serpong, Propinsi Banten; Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium Kimia Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian; dan Laboratorium Terpadu, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan adalah minyak ikan hasil samping dari pengalengan lemuru yang berasal dari perusahaan pengalengan ikan PT. X, di Banyuwangi-Jawa Timur yang diambil pada bulan Oktober. Bahan-bahan dalam ekstraksi meliputi pelarut gas CO 2 teknis dengan kemurnian 90%. Bahan untuk penyaringan minyak ikan, yaitu kertas Whatman 40. Bahan-bahan untuk analisis asam lemak, yang meliputi 1 ml larutan standar, 1 ml 0,5 N NaOH dalam methanol, 2 ml BF 3 20%, 2 ml NaCl, 1 ml isooctane, dan 0,1 g Na 2 SO 4 anhidrat. Bahan-bahan untuk analisis bilangan asam dan kadar asam lemak bebas meliputi KOH 0,1 N, 25 ml alkohol netral 96%, indikator fenolftalein. Bahan-bahan untuk analisis bilangan penyabunan adalah 50 ml KOH, indikator fenolftalein, aquades, HCl 0,1 N. Bahan-bahan untuk analisis bilangan peroksida adalah 30 ml pelarut (60% asam asetat dan 40% pelarut), 30 ml aquades, Natriumthiosulfat 0,02 N, 1 gram KI. Alat utama dalam proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan adalah satu unit Supercritical Fluid Extraction (SFE) Model 46-19360 dari Superspressure-hydrodynamics, Newport Scientific Inc.AMINCO, USA dengan kapasitas ekstraktor 0,845 liter dan separator 0,3 liter, serta tekanan maksimum 9200 psi yang berada di Pusat Penelitian Kimia, LIPI, Serpong (spesifikasi lengkap pada Lampiran 1). Alat untuk analisis lemak berupa Gas Chromatography (GC) Shimadzu Model GC 2010 plus dengan kolom 18
19 cyanopropil methyl sil (capillary column), dimensi kolom p = 60 m, Ø dalam = 0,25 mm, 0,25 µm film thickness, laju alir N 2 20 ml/menit, dan laju alir H 2 30 ml/menit. Alat untuk penyaringan minyak ikan sebelum dilakukan ekstraksi berupa vakum Buchner. Peralatan untuk analisis lainnya antara lain neraca analitik, erlenmeyer, tabung reaksi, hot plate, buret, pipet gondok, pipet tetes, bulb. 3.3 Metode Penelitian Tahapan pelaksanaan penelitian dilakukan meliputi, (1) preparasi sampel minyak ikan hasil samping pengalengan lemuru mengacu pada penelitian Setha (1996) dan Boran et al. (2006), (2) analisis mutu minyak ikan sebelum ekstraksi dengan fluida CO 2 superkritik, dengan parameter uji yang mengacu pada Celik (2002) tentang minyak ikan komersial, IFOMA (International Fishmeal and Oil Manufacturers Association) tentang standar minyak ikan untuk konsumsi, serta penelitian Dewi (1996) dan Estiasih et al. (2005) untuk perbandingan hasil ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan, (3) proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO 2 superkritik mengacu pada penelitian Lopes et al. (2011) dengan modifikasi, (4) analisis konsentrat asam lemak omega-3 beserta kandungan asam lemak omega-3, dengan parameter uji mengacu pada IFOMA. 3.3.1 Preparasi sampel minyak ikan hasil samping pengalengan lemuru Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan minyak ikan hasil samping pengalengan ikan lemuru yang baru diambil dari proses pengalengan tahapan pre-cooking pada bulan Oktober. Minyak ikan dimasukkan dalam wadah (jerigent) yang tidak tembus cahaya dan tertutup rapat, lalu dimasukkan dalam boks sterofoam. Minyak ikan sebelum digunakan disaring menggunakan kertas Whatman 40 dengan vakum Buchner. Hasil saringan, kemudian ditaruh pada wadah yang tidak tembus cahaya. Ketentuan preparasi sampel mengacu pada penelitian Setha (1996). Sedangkan pencegahan terhadap oksidasi dilakukan penyimpanan sampel minyak ikan dengan cara menyimpan sampel di freezer (atau suhu di bawah 0 o C) (Boran et al. 2006). 19
20 3.3.2 Analisis mutu minyak ikan sebelum ekstraksi dengan fluida CO 2 superkritik Analisis mutu minyak ikan dilakukan untuk mengetahui kondisi awal bahan baku minyak ikan hasil samping pengalengan ikan lemuru yang akan digunakan dalam proses ekstraksi dengan teknologi fluida CO 2 superkritik. Analisis yang dilakukan meliputi bilangan asam dan asam lemak bebas (AOAC 1995), bilangan penyabunan (AOCS Cd 3-25 1997), dan bilangan peroksida (AOAC 1995). Parameter yang dianalisis ini mengacu pada Celik (2000), yaitu bilangan asam (10,15 mg KOH/gr), asam lemak bebas (4,6%), bilangan penyabunan (187,4 mg KOH/gr), serta mengacu pada IFOMA (International Fishmeal and Oil Manufacturers Association), yaitu asam lemak bebas (1-7%), dan bilangan peroksida (3-20 meq/kg). Kandungan asam lemak omega-3 yang terdapat dalam minyak ikan sebelum diekstraksi dilakukan analisis asam lemak omega-3 menggunakan Gas Chromatography (GC) (AOAC 1984 butir 28.060/GC). Hasil analisis asam lemak yang diperoleh dibandingkan dengan penelitian Dewi (1996), yaitu kandungan omega-3 (29,68%) dengan EPA (15,15%) dan DHA (11,36%), serta penelitian Estiasih et al. (2005) dengan EPA (11,71%) dan DHA (9,11%). 3.3.3 Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO 2 superkritik Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO 2 superkritik dilakukan dengan tahapan sebagai berikut : 1. Kondisi sampel sebelum ekstraksi Sampel yang akan digunakan untuk proses ekstraksi, yaitu minyak ikan yang sudah disaring dengan kertas Whatman 40 (Setha 1996), dan disimpan pada wadah yang tidak tembus cahaya dengan suhu di bawah 0 o C (Boran et al. 2006). 2. Penentuan tekanan dan suhu ekstraksi Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru dengan fluida CO 2 superkritik terdiri dari tiga tahap, yaitu tahap persiapan, tahap proses dan tahap flushing. Skema unit alat ekstraksi fluida CO 2 superkritik terdapat pada Lampiran 2. Prosedur operasional standar ekstraksi dengan fluida CO 2 superkritik dapat dilihat pada Lampiran 3. Jumlah bahan baku minyak ikan yang dimasukkan 20
21 setiap ekstraksi sebanyak 200 gram. Kondisi proses ekstraksi dijaga kestabilannya dan dicatat setiap 15 menit. Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO 2 superkritik dilakukan dengan 2 variasi tekanan dan suhu ekstraksi, yaitu tekanan 3500 psi dan 4000 psi serta suhu 40 o C dan 50 o C yang mengacu pada penelitian Lopes et al. (2011) dengan modifikasi. Tekanan dan suhu pemisahan atau separasi setelah proses ekstraksi adalah tekanan 500 psi dan suhu 30 o C. Lama proses berlangsung 4 jam, pada laju alir 5,5 liter/menit yang mengacu pada penelitian Rizvi (1999) dan Utami (2004). Kondisi proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru dengan fluida CO 2 superkritik dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7 Kondisi proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru dengan fluida CO 2 superkritik PE (psi) TE ( o C) 40 50 PS (psi) TS ( o C) Laju alir CO 2 Waktu Proses 3500 U 1 U 2 U 1 U 2 500 30 5,5 liter/menit 4 jam 4000 U 1 U 2 U 1 U 2 Keterangan PE : Tekanan Ekstraktor TE : Suhu Ekstraktor PS : Tekanan Separator TS : Suhu Separator U : Ulangan Konsentrat asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru hasil ekstraksi dimasukkan dalam wadah botol gelap yang tidak tembus cahaya dan tertutup rapat. Kemudian disimpan pada suhu di bawah 0 o C sampai dilakukannya analisis. 3.3.4 Analisis konsentrat asam lemak omega-3 beserta kandungan asam lemak omega-3 Analisis konsentrat asam lemak omega-3 meliputi analisis asam lemak dengan Gas Chromatography (GC) (AOAC 1984 butir 28.060/GC) untuk mengetahui kandungan asam lemak omega-3, analisis asam lemak bebas (AOAC 1995), dan bilangan peroksida (AOAC 1995). Parameter yang dianalisis mengacu pada IFOMA (International Fishmeal and Oil Manufacturers Association) tentang standar minyak ikan konsumsi. 21
22 3.4 Prosedur Pengujian Pengujian yang dilakukan pada penelitian ini untuk menguji mutu minyak ikan sebelum ekstraksi dengan fluida CO 2 superkritik dan analisis konsentrat asam lemak omega-3 minyak ikan hasil ekstraksi dengan fluida CO 2 superkritik. Analisis mutu minyak ikan hasil samping pengalengan lemuru meliputi analisis asam lemak, analisis bilangan asam dan asam lemak bebas, analisis penyabunan, dan analisis bilangan peroksida. Analisis konsentrat asam lemak omega-3 minyak ikan hasil ekstraksi meliputi analisis asam lemak, analisis asam lemak bebas dan analisis bilangan peroksida. Selain itu juga dilakukan perhitungan rendemen dan solubilitas konsentrat asam lemak omega-3 minyak ikan hasil ekstraksi. 3.4.1 Rendemen (Sahena et al. 2010) Rendemen konsentrat asam lemak omega-3 ditentukan dengan membandingkan bobot (g) hasil ekstraksi yang diperoleh terhadap bobot (g) minyak ikan yang digunakan dikalikan 100%. Rendemen (%) = 3.4.2 Solubilitas (Sahena et al. 2010) Solubilitas konsentrat asam lemak omega-3 dalam CO 2 ditentukan dengan rumus sebagai berikut : Solubilitas (g/kg CO 2 ) = 3.4.3 Analisis total asam lemak omega-3 (AOAC 1984 butir 28.060/GC) Sebanyak 20-30 mg contoh minyak ditimbang dalam tabung bertutup teflon. Lalu ditambahkan 1 ml NaOH 0,5 N dalam metanol dan dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Selanjutnya ditambahkan 2 ml BF 3 20%, dipanaskan lagi selama 20 menit. Setelah dingin, kemudian ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan 1 ml isooctane dikocok dengan baik. Lapisan isooctane dipindahkan dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi sekitar 0,1 g Na 2 SO 4 anhidrat, dibiarkan 15 menit. Fase cair dipisahkan dan selanjutnya diinjeksikan ke kromatografi gas. 22
23 Kandungan komponen asam lemak (%) = A x x C standar x V contoh x 100 % A s 100 gram contoh 3.4.4 Bilangan asam dan kadar asam lemak bebas (AOAC 1995) Prinsip bilangan asam dan asam lemak bebas adalah pelarutan contoh lemak atau minyak dalam pelarut organik tertentu (alkohol netral 96%) dilanjutkan dengan penitaran dengan basa (NaOH atau KOH). Contoh yang akan diuji, ditimbang sebanyak 5-10 gram di dalam erlenmeyer 250 ml, lalu ke dalam contoh ditambahkan alkohol netral 96% sebanyak 25 ml dan dipanaskan sampai mendidih. Larutan ditambahkan 2 tetes indikator PP, kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,1 N hingga berwarna merah muda (konstan selama 15 detik). Bilangan asam (mg KOH/gram sampel) = Kadar asam lemak bebas (%) = Keterangan : V = Volume KOH untuk titrasi contoh (ml) T = Normalitas larutan KOH M = Bobot molekul asam dominan (asam oleat 282) m = Bobot contoh (gram) 56,1 = Bobot molekul KOH 3.4.5 Bilangan penyabunan (AOCS Cd 3-25 1997) Prinsip bilangan penyabunan adalah asam lemak terikat (trigliserida) dan asam lemak bebas (FFA) bereaksi dengan basa (KOH/NaOH) membentuk sabun, gliserol dan air. a. Timbang sampel minyak sebanyak 1-2 g. Tambahkan 50 ml KOH beralkohol dengan menggunakan pipet kering b. Siapkan blanko dengan cara yang sama, tetapi tidak menggunakan lemak atau minyak 23
24 c. Sambungkan ke kondensator dan didihkan dengan perlahan hingga seluruh sampel tersaponifikasi. Untuk sampel yang bersifat formal biasanya proses ini membutuhkan waktu selama 1 jam. d. Setelah labu dan kondensor mendingin, tetapi belum berubah bentuk menjadi gel, cuci bagian dalam kondensor dengan menggunakan akuades. Lepaskan kondensor, tambahkan 1 ml indikator fenolftalein dan titrasi dengan menggunakan HCL 0,5 N sampai warna merah muda menghilang. Tulis volume HCL 0,5 N yang dibutuhkan untuk titrasi. Bilangan penyabunan (mg KOH/g sampel) = Keterangan : B S N W = Volume HCL 0,5 N untuk titrasi blanko (ml) = Volume HCL 0,5 N untuk titrasi contoh (ml) = Normalitas larutan HCL = Bobot sampel 3.4.6 Bilangan peroksida (AOAC 1995) Analisis bilangan peroksida dilakukan dengan menimbang 5 gram contoh dalam Erlenmeyer 250 ml kemudian ditambahkan 30 ml pelarut (60% asam asetat dan 40% kloroform) dan dikocok sampai sampel larut. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml KI jenuh kemudian didiamkan selama 2 menit di ruang gelap sambil sekali-kali dikocok. Tambahkan 30 ml aquades, kemudian titrasi dengan Natriumthiosulfat 0,01 N. Perhitungkan sebagai berikut : Bilangan peroksida (meq/kg) = Analisis terhadap blanko dilakukan dengan cara yang sama. Sampel diganti dengan akuades sebagai blanko. 3.5 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial, yakni menunjukkan pengaruh perlakuan tekanan dan suhu ekstraksi, 24
25 serta interaksi keterkaitan antara tekanan dan suhu ekstraksi. Setiap interaksi perlakuan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2 kali ulangan. Model Rancangan Acak Lengkap Faktorial adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie 1991) : Keterangan : Y ijk =µ + α i + β j + (αβ) ij + ɛ ijk Y ij = Pengamatan pada satuan percobaan ke k yang memperoleh kombinasi perlakuan taraf ke i dari faktor α dan taraf ke j dari faktor ß. µ = Mean populasi α i β j (αβ) ij Ɛ ijk = Pengaruh taraf ke i dari faktor α = Pengaruh taraf ke j dari faktor ß = Pengaruh taraf ke i dari faktor α dan taraf ke j dari faktor ß = Pengaruh acak satuan ke k yang memperoleh kombinasi perlakuan Data dianalisis dengan menggunakan analisis ragam oneway ANOVA untuk melihat pengaruh terhadap paramater yang diuji. Apabila hasil analisis ragam memberikan pengaruh yang nyata (tolak Ho), maka dilakukan dengan uji lanjut Beda Nyata Terkecil (BNT), untuk melihat adanya perbedaan dari masingmasing perlakuan yang diberikan. Rumus pengujian dengan Uji BNT adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie 1991): BNT = t α (dbs) Keterangan : n = Ulangan dbs = Derajat bebas sisa α = 0,05 kts = Kuadrat tengah sisa Data hasil rendemen dan solubilitas konsentrat asam lemak omega-3 minyak ikan, kandungan asam lemak omega-3 (EPA dan DHA), kadar asam lemak bebas, dan bilangan peroksida dianalisis menggunakan program Microsoft Excel 2007 dan SPSS versi 13.0. 25