UJI STERILITAS Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB
Pembuatan produk farmasi steril >>> perlu diuji sterilitas
Tujuan uji sterilitas: Untuk menetapkan apakah bahan farmakope yang harus steril memenuhi syarat berkenaan dengan uji sterilitas seperti yang tertera pada masing-masing monografi
PEMBANDINGAN UJI STERILITAS (FARMAKOPE INDONESIA IV/1995) GUIDELINES FOR STERILITY TESTING OF THERAPEUTIC GOODS (THERAPEUTIC GOODS ADMINISTRATION/ TGA 2006)
Suatu produk dikatakan STERIL Bila memenuhi persyaratan dalam uji sterilitas Kemungkinan hasil positif dapat terjadi karena teknik yang salah atau kontaminasi lingkungan pada waktu pengujian.
Mikroba yang Digunakan: (1) Bacillus subtilis (ATCC No. 6633) (2) Candida albicans (ATCC No. 10321) (3) Bacteroides vulgatus (ATCC No. 8482)
PRECAUTIONS AGAINST MICROBIAL CONTAMINATION Tests for sterility are to be carried out by trained personnel Conducted in a clean-room environment the standard of clean-room Personnel should wear sterilized over-garments All equipment may come into contact in the course of the testing should be sterilized prior to use. All substances added to the goods tested, should be sterilized prior to use by heat All vessels, substances or outer clothing to be used should be appropriately packaged or closed, The outer surfaces of all packages of equipment which are introduced into the aseptic testing environment should be free of contamination
TEST METHODS VALIDATION (TGA 2006) Test method validation Before tests for sterility for any product are initially carried out, it is necessary to demonstrate the validity of the test method used Validation should mimic the test proper in every detail Validation is to be performed when the test for sterility has to be carried out on reformulated or new product All validation procedures should be carried out by personnel who are responsible for the routine testing of the product
Ketentuan hasil: Jika terdapat kontaminasi mikroba dengan menggunakan prosedur farmakope, maka ditentukan bahwa bahan tersebut tidak memenuhi syarat. Jika terdapat kegagalan menunjukkan adanya kontaminasi mikroba dengan menggunakan prosedur dalam farmakope, maka ditentukan bahwa bahan tersebut memenuhi syarat.
Media yang digunakan : Media yang digunakan mempunyai sifat merangsang pertumbuhan bagi mikroba yaitu: Fluid Thioglycolate Medium (FTM) dan / atau Alternative Thioglycolate Medium (ATM) Soybean-Casein Digest Medium (SCDM) Cairan Pengencer dan pembilas : Cairan A Cairan D = Cairan A + 1mL polisorbat 80/L Cairan K
MEDIA (FI IV/TGA 2006) Medium 1 (Fluid Thioglycollate Medium) Pancreatic Digest of Casein 15.0 g Yeast Extract (water soluble) 5.0 g Glucose monohydrate/anhydrous 5.5 g/5.0 g Sodium chloride 2.5 g L Cystine 0.5 g Sodium thioglycollate 0.5 g 0.1% Resazurin Sodium Solution (freshly prepared) 1.0 ml Granulated Agar (moisture not more than 15%) 0.75 g Purified Water 1000 ml Polysorbate 80 (optional) 5.0 ml ph after sterilisation (measured at room temperature): 7.1± 0.2
MEDIA (FI IV) Media Tioglikolat Alternatif (untuk alat yang mempunyai lumen kecil) : Pancreatic Digest of Casein 15.0 g Yeast Extract (water soluble) 5.0 g Glucose monohydrate/anhydrous 5.5 g/5.0 g Sodium chloride 2.5 g L Cystine 0.5 g Sodium thioglycollate 0.5 g Purified Water 1000 ml ph after sterilization (measured at room temperature): 7.1± 0.2
MEDIA (FI IV/TGA 2006) Medium 2 (Soybean Casein Digest Medium) Pancreatic Digest of Casein 17.0 g Papain Digest of Soybean Meal 3.0 g Glucose monohydrate/anhydrous 2.5 g/2.3 g Sodium chloride 5.0 g Dipotassium hydrogen phosphate 2.5 g Purified Water 1000 ml Polysorbate 80 (optional) 5.0 ml ph after sterilisation (measured at room temperature): 7.3±0.2
Cairan A 1 gram jaringan hewan yg telah diuraikan oleh enzim pepsin, dilarutkan dlm air smp 1 liter, saring atau sentrifuga, ph diatur 7,1 Jika akan digunakan untuk uji sediaan yang mengandung senyawa gol.penisilin/sefalosporin (beta laktam), maka media tsb harus ditambahkan enzim penisilinase utk proses inaktivasi
Cairan D Adalah 1 L Cairan A + 1 ml Tween 80 Digunakan bila sediaan mengandung lesitin, atau minyak Atau utk uji peralatan steril dengan menggunakan penyaring membran
Cairan K Cairan yang mengandung Jaringan hewan yg telah diuraikan oleh enzim lambung (peptic digest), beef extract, dan Tween 80 Semua cairan pembilas harus disterilkan dengan otoklaf
Prosedur penambahan penisilinase: Tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan dengan menggunakan sediaan penisilinase yang sebelumnya telah diuji daya penginaktif penisilin atau sefalosporin atau tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan dengan menambahkannya ke dalam tabung FTM dan sejumlah antibiotik dalam spesimen uji 1. Inokulasi media dengan 1 ml pengenceran (1 : 1000) biakan 18 jam-24 jam Staphylococcus aureus (ATCC 29737) dalam FTM. 2. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 30 o 35 o
Pada saat tersebut harus teramati pertumbuhan mikroba yang spesifik. Lakukan uji konfirmasi di daerah yang benar-benar terpisah dari tempat uji sterilitas.
Uji fertilitas Tujuan? Untuk memastikan bahwa media yang digunakan dapat menumbuhkan mikroba uji sampai waktu 7 hari Dilakukan sebelum uji sterilitas thp sampel
Uji Fertilitas Tabel 1 Media Fluid Tioglikolat Medium Tioglikolat alternative Mikroba Uji (1) Bacillus subtilis (ATCC 6633) (2) Candida albicans (ATCC10321) (3) Bacteroides vulgatus (ATCC8482) (1) Bacteroides vulgatus (ATCC8482) Inkubasi Suhu ( o C) Kondisi 30 35 Aerobik 30 35 30 35 30 35 Anaerobik Soybean casein digest (1) Bacillus subtilis (ATCC 6633) (2) Candida albicans (ATCC No. 10321) 20 25 20 25 Aerobik
Prosedur Inokulasi duplo wadah tiap media secara terpisah dengan 10 hingga 100 mikroba viabel dari tiap galur pada tabel. Media uji memenuhi syarat jika terjadi pertumbuhan yang nyata dalam semua wadah media yang diinokulasikan dalam kurun waktu 7 hari.
METODE UJI STERILITAS INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI TEKNIK PENYARINGAN MEMBRAN
Prosedur Inokulasi langsung: Uji aktivitas bakteriostatik dan Fungistatik Prosedur: 1. Encerkan biakan bakteri dan jamur tidak kurang dari galur mikroba seperti pada uji fertilitas. 2. Inokulasi media dengan uji sterilitas dengan 10 mikroba hingga 100 mikroba viabel, gunakan volume media seperti yang tertera dalam Tabel Jumlah untuk bahan cair pada pemilihan spesimen uji dan masa inkubasi. 3. Tambahkan sejumlah tertentu bahan ke dalam setengah dari jumlah wadah yang mengandung inokulum dan media. 4. Inkubasi wadah pada suhu dan kondisi seperti yang tertera dalam tabel selama tidak kurang dari 7 hari.
Tabel 2 Jumlah untuk bahan cair Volume minimum tiap media Isi wadah (ml) Volume minimum diambil dari wadah untuk tiap media Digunakan untuk inokulasi langsung ke volume yang diambil dari tiap wadah (ml) Digunakan untuk membrane atau setengah bagian membrane yang mewakili volume total dari jumlah wadah yang sesuai (ml) Jumlah wadah per media Kurang dari 10 1mL, atau seluruh isi jika kurang dari 1mL 15 100 20 (40 jika volume tiap wadah tidak cukup untuk kedua media) 10 sampai kurang dari 50 50 sampai kurang dari 100 50 sampai kurang dari 100 dimaksudkan untuk pemberian intravena 5mL 40 100 20 10mL 80 100 20 Seluruh isi - 100 20 100 sampai 500 Seluruh isi - 100 10 Di atas 500 500mL - 100 10
Jika pertumbuhan mikroba uji dalam campuran media bahan secara visual sebanding dengan pertumbuhan dalam tabung kontrol, gunakan jumlah bahan dan media seperti yang tertera pada Tabel jumlah untuk bahan cair dalam pemilihan spesimen uji dan masa inkubasi.
Penetapan perbandingan bahan dan media yang tidak merugikan pertumbuhan mikroba uji. Prosedur yang digunakan sama dengan uji aktivitas bakteriostatik dan fungistatik, tetapi digunakan sejumlah tertentu bahan dan volume media yang lebih besar.
Ketentuan Penambahan atau pengurangan dalam menentukan perbandingan bahan dan media Jika sejumlah tertentu bahan dalam 250mL media masih mempunyai daya bakteriostatik atau fungistatik, kurangi jumlah bahan hingga diperoleh jumlah maksimum yang tidak menghambat pertumbuhan uji dalam 250mL media. Untuk cairan dan suspensi yang jumlahnya kurang dari 1mL, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan dan mencegah hambatan pertumbuhan. Untuk bahan padat yang tidak segera larut atau dapat terdispersi, jika jumlahnya kurang dari 50mg, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan untuk mencegah hambatan pertumbuhan.
PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI Untuk: Cairan Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat Zat padat Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah dan bahan sejenisnya Alat kesehatan steril Alat suntik kosong atau terisi steril
Prinsip pengujian: Bahan uji Bahan uji + media Inkubasi minimal 14 hari dengan pengamatan pada hari ke 3,4,atau 5, hari ke 7 atau 8, dan pada hari terakhir pengujian. Catatan: Perlakuan awal berbeda untuk masing-masing produk farmasi dan kesehatan. Bahan uji merupakan larutan yang pada produk farmasi dan kesehatan kecuali yang berbentuk cairan digunakan untuk membilas atau mendispersi produk tersebut.
Perlakuan awal untuk berbagai sediaan Cairan 1. Pindahkan cairan dari wadah uji menggunakan pipet atau jarum suntik steril. 2. Secara aseptik inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah uji ke dalam tabung media. 3. Campur cairan dengan media tanpa aerasi berlebihan. Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat Pilih 20 wadah yang mewakili, dibagi atas 2 kelompok terdiri dari 10 wadah, dan diperlakukan tiap kelompok sebagai berikut: 1. Secara aseptik pindahkan 100mg dari tiap wadah dari 10 wadah ke dalam labu berisi 100mL pembawa air steril yang dapat mendispersi homogen bahan uji dalam seluruh campuran cairan. 2. Campur 10mL alikot dari campuran cairan yang diperoleh dengan 80mL tiap media.
Zat padat Ambil sejumlah tertentu produk dalam bentuk padat kering (atau yang sudah dibuat larutan atau suspensi dalam cairan pengencer steril) tidak kurang dari 300mg tiap wadah atau seluruh isi wadah jika tiap isi kurang dari 300mg. Inokulasikan ke dalam masing-masing tidak kurang dari 40mL FTM dan SCDM. Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah dan bahan sejenisnya Dari setiap kemasan, ambil secara aseptik 2 bagian atau lebih masing-masing 100 sampai 500mg dari bagian paling dalam. Secara aseptik pindahkan bagian bahan uji ini ke dalam sejumlah tertentu wadah media yang sesuai dan inkubasi. Alat kesehatan steril Untuk alat yang bentuk dan ukurannya memungkinkan dicelupkan keseluruhan ke dalam tidak lebih dari 1000mL media, uji alat utuh menggunakan media yang sesuai.
Untuk alat yang mempunyai pipa/saluran berlubang seperti alat transfusi atau infus atau yang ukurannya menyebabkan pencelupan tidak dapat dilakukan dan hanya saluran cairannya yang harus steril, 1. Bilas lumen masing-masing dengan sejumlah FTM dan SCDM hingga diperoleh kembali tidak kurang dari 15mL setiap media. 2. Inkubasi dengan tidak kurang dari 100mL masingmasing media.
Untuk alat dengan lumen yang sangat kecil sehingga FTM tidak mengalir, gunakan ATM, tetapi inkubasi dilakukan secara anaerob. Jika karena ukuran dan bentuk alat tidak dapat diuji dengan cara pencelupan keseluruhannya ke dalam tidak lebih dari 1000mL media: Uji bagian alat yang paling sulit disterilisasi dan jika mungkin lepaskan 2 atau lebih bagian yang paling dalam dari alat. Secara aseptik pindahkan bagian tersebut ke dalam sejumlah tertentu tabung berisi tidak kurang dari 1000mL media yang sesuai, inkubasikan. Amati pertumbuhan pada media secara visual sesering mungkin sekurangnya pada hari ke-3 atau ke-4 atau ke-5, pada hari ke-7 atau ke-8 dan pada hari terakhir dari masa uji.
Catatan: jika spesimen uji dalam media mempengaruhi uji karena kerja bakteriostatik atau fungistatik, bilas seksama alat dengan cairan pembilas sesedikit mungkin seperti yang tertera pada cairan pengencer dan pembilas. Peroleh kembali cairan bilasan dan uji menggunakan teknik penyaringan membran
Prosedur untuk: Alat suntik kosong atau terisi steril Uji dilakukan sama seperti uji untuk produk steril dalam ampul atau vial. Cara inokulasi langsung dapat dilakukan jika penetapan bakteriostatik dan fungistatik telah menunjukkan aktivitas yang tidak merugikan dalam kondisi pengujian.
UJI STERILITAS DENGAN TEKNIK PENYARINGAN MEMBRAN
Kegunaan uji sterilitas dengan teknik penyaringan membran Berguna untuk cairan dan serbuk yang dapat larut yang bersifat bakteriostatik atau fungistatik, untuk memisahkan mikroba kontaminan dari penghambat pertumbuhan. Berguna untuk bahan seperti minyak, salep atau krem yang dapat melarut ke dalam larutan pengencer bukan bakteriostatik atau bukan fungistatik. Berguna untuk uji sterilitas permukaan atau lumen kritis alat-alat kesehatan.
Prosedur awal: Buat perbandingan yang sama menggunakan sejumlah tertentu bahan uji dan cairan pengencer dan pembilas yang sesuai. Bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL cairan pengencer dan pembilas. Pertumbuhan mikroba uji dari membran yang digunakan untuk menyaring bahan diikuti cairan pengencer dan pembilas yang telah diinokulasi secara visual sebanding dengan pertumbuhan dari membran yang hanya digunakan untuk menyaring cairan pengencer dan pembilas yang telah diinokulasi.
Cara membuka wadah: Bersihkan permukaan luar ampul dan tutup vial dan tutup botol menggunakan bahan dekontaminasi yang sesuai dan ambil secara aseptik. Jika isi vial dikemas dalam hampa udara, masukkan udara steril dengan alat steril yang sesuai, seperti alat suntik dengan jarum yang dilengkapi bahan penyaring untuk sterilisasi. Untuk kapas murni, perban, pembalut, benang bedah dan bahan farmakope sejenis, buka kemasan atau wadah secara aseptik.
Pemilihan spesimen uji dan masa inkubasi Untuk bahan cair: Gunakan volume bahan dan media untuk setiap unit dan jumlah wadah per media tidak kurang dari seperti yang tertera pada Tabel jumlah untuk bahan cair. Jika volume setiap wadah sejumlah tidak cukup untuk kedua media, gunakan wadah sejumlah dua kali. Untuk bahan selain cairan: Uji 20 unit bahan dengan masing-masing media. Untuk bahan yang hanya lumennya harus steril, bilas lumen dengan sejumlah media yang sesuai hingga diperoleh kembali tidak kurang dari 15mL media. Catatan: Jika tidak dinyatakan lain di dalam monografi atau bab ini, inkubasi campuran uji dengan FTM (atau ATM) selama pada suhu 20 o C - 25 o C.
PROSEDUR UJI MENGGUNAKAN PENYARINGAN MEMBRAN Untuk: Cairan yang dapat bercampur dengan pembawa air Cairan yang tidak bercampur dengan pembawa air (kurang dari 100mL per wadah) Zat padat yang dapat disaring Salep dan minyak yang larut dalam Isopropil Miristat Zat padat yang tak dapat disaring Alat kesehatan Peralatan: porositas 0,45µm, diameter ±47mm, kecepatan penyaringan 55mL-75mL/mnt pada tekanan 70cmHg.
Prosedur untuk: Cairan yang dapat bercampur dengan pembawa air Secara aseptik pindahkan sejumlah volume tertentu yang dibutuhkan untuk kedua media seperti yang tertera pada tabel 2, langsung ke dalam satu atau dua corong penyaring membran terpisah, atau ke dalam tabung penampung steril terpisah sebelum dipindahkan.
Jika volume cairan dalam wadah kurang dari 50mL, atau 50mL smp <100mL dan tidak dimaksudkan untuk pemberian intravena, diperlukan volume tidak kurang dari 20 wadah diwakili satu membran atau setengah bagian membran yang dipindahkan ke dalam media. Jika volume cairan 50mL, 50mL smp <100mL per wadah dan dimaksudkan untuk pemberian intravena, atau 100mL 500mL, secara aseptik tidak kurang dari 10 wadah melalui tiap penyaring dari 2 rakitan penyaring, atau tidak kurang dari 20 wadah jika hanya digunakan satu rakitan penyaring. Lewatkan segera tiap spesimen melalui penyaring dengan bantuan pompa vakum atau tekanan.
Jika cairan sangat kental dan tidak mudah disaring melalui 1 atau 2 membran maka diperlukan lebih dari 2 rakitan penyaring. Setengah jumlah membran diinkubasi dalam masing-masing media asalkan volume dan jumlah wadah per media memenuhi syarat. Jika produk bersifat bakteriostatik atau fungistatik bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL cairan A.
Secara aseptik pindahkan membran dari alat pemegang, potong membran menjadi setengah bagian (jika digunakan hanya 1), celupkan membran atau setengah bagian membran, ke dalam 100mL SCDM dan inkubasi pada suhu 20 o -25 o dan ke dalam FTM dengan suhu inkubasi 30 o -35 o selama min.7hari. Catatan: jika contoh yang diuji bersifat bakteriostatik, gunakan cakram membran penyaring hidrofobik atau setelah spesimen disaring, potong cakram lebih kurang setengah daerah penyaringan dari pusat membran menggunakan alat pemotong steril, secara aseptik pindahkan potongan setengah cakram membran ke dalam FTM dan sisa potongan cakram ke dalam SCDM
Prosedur untuk: Cairan yang tidak bercampur dengan pembawa air (kurang dari 100mL per wadah) 1. Pindahkan volume yang diinginkan untuk ke dua media, seperti yang tertera pada tabel 2 langsung ke dalam 1 atau 2 corong penyaring membran terpisah atau ke dalam tabung penampung steril sebelum dipindahkan. 2. Lewatkan segera tiap spesimen melalui penyaring dengan bantuan pompa vakum atau tekanan.
Jika bahan uji berupa cairan kental atau suspensi dan tidak sesuai untuk penyaringan cepat, secara aseptik tambahkan cairan pengencer secukupnya ke dalam kumpulan spesimen yang akan disaring untuk menambahkan kecepatan aliran. Jika produk uji bersifat bakteriostatik atau fungistatik atau mengandung pengawet, bilas membran 1-3 kali dengan 100mL cairan A. Jika bahan uji mengandung lesitin atau minyak, gunakan cairan D sebagai cairan A.
Catatan : Setelah penyaringan dan pencucian secara aseptik pindahkan membran dari alat pemegang, potong membran menjadi setengah bagian (jika digunakan hanya 1), celupkan membran atau setengah bagian membran, ke dalam 100mL SCDM dan inkubasi pada suhu 20 o -25 o dan ke dalam FTM dengan suhu inkubasi 30 o -35 o selama min.7hari.
Prosedur untuk: Zat Padat yang tidak dapat disaring 1. Ambil ±6g produk dalam bentuk padat kering, atau tidak kurang dari 300mg tiap wadah yang akan diuji, atau seluruhnya jika isi tiap wadah kurang dari 300mg bahan padat. 2. Secara aseptik masukkan spesimen uji ke dalam tabung berisi 200mL cairan A, dan aduk hingga larut. Jika spesimen tidak larut sempurna, gunakan 400mL cairan A, atau secara aseptik bagi spesimen ke dalam 2 bagian, dan uji tiap bagian dengan 200mL cairan A.
3. Setelah penyaringan dan pembilasan secara aseptik pindahkan membran dari alat pemegang, potong membran menjadi setengah bagian (jika digunakan hanya 1), celupkan membran atau setengah bagian membran, ke dalam 100mL SCDM dan inkubasi pada suhu 20 o -25 o dan ke dalam FTM dengan suhu inkubasi 30 o -35 o selama min.7hari. Jika contoh uji bersifat bakteriostatik atau fungistatik, bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL cairan A.
Prosedur untuk: Salep dan minyak yang larut dalam isopropil miristat 1. Larutkan tidak kurang dari 100mg dari tiap isi wadah, tidak kurang dari 20 wadah dalam tidak kurang dari 100mL isopropil miristat dengan ph ekstrak air tidak kurang dari 6,5. 2. Goyang labu untuk melarutkan salep atau minyak. 3. Saring segera salep yang dilarutkan. 4. Secara aseptis pindahkan campuran ke dalam 1 atau 2 corong penyaring membran dengan bantuan pompa vakum atau tekanan. 5. Setelah penyaringan spesimen, bilas membran 2 kali dengan 200mL cairan D, kemudian cuci dengan 100mL cairan A. 6. Secara aseptik pindahkan membran dari alat pemegang, potong membran menjadi setengah bagian (jika digunakan hanya 1), celupkan membran atau setengah bagian membran, ke dalam 100mL SCDM dan inkubasi pada suhu 20 o -25 o dan ke dalam FTM dengan suhu inkubasi 30 o -35 o selama min.7hari.
Jika zat yang diuji mengandung petrolatum, gunakan cairan K. Basahi membran dengan ±200µL media pembilas sebelum penyaringan dimulai. Setelah penyaringan spesimen, bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL media pembilas. Catatan: Untuk salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat lakukan penetapan seperti tertera pada salep dan minyak tidak larut dalam isopropil miristat dalam prosedur uji inokulasi langsung ke dalam media uji.
Prosedur untuk: Zat padat yang tak dapat disaring Tidak dianjurkan dengan menggunakan teknik penyaringan membran kecuali telah terbukti bahwa tidak terjadi penyumbatan pada filter.
Prosedur untuk: Alat Kesehatan 1. Secara aseptik alirkan volume tertentu cairan D melalui tiap lumen tidak kurang dari 20 alat hingga diperoleh 100mL dari tiap alat. 2. Kumpulkan cairan dalam wadah aseptik dan saring seluruh volume melalui penyaring membran. 3. Secara aseptik pindahkan membran dari alat pemegang, potong membran menjadi setengah bagian (jika digunakan hanya 1), celupkan membran atau setengah bagian membran, ke dalam 100mL SCDM dan inkubasi pada suhu 20 o -25 o dan ke dalam FTM dengan suhu inkubasi 30 o -35 o selama min.7hari. Jika ukuran alat besar, dan ukuran lot kecil, lakukan uji sejumlah unit yang sesuai seperti yang tertera pada kasus serupa dalam alat kesehatan pada prosedur uji inokulasi langsung ke dalam media uji.
Penafsiran Hasil Uji Sterilitas Tahap I Amati adanya pertumbuhan mikroba seperti kekeruhan dan / atau pertumbuhan pada permukaan pada isi semua wadah dalam interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi. Jika tidak terjadi pertumbuhan, maka bahan uji memenuhi syarat. Tahap II Jumlah spesimen yang diuji minimal 2 kali jumlah tahap I. Jika tidak ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji memenuhi syarat. Jika ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji tidak memenuhi syarat.