LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA LAPORAN IV (ISOLASI RNA DARI TANAMAN) KHAIRUL ANAM P051090031/BTK BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 0
ISOLASI RNA DARI TANAMAN TUJUAN Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengetahui dan memahami prinsip bagaimana cara mengisolasi suatu gen dari hasil ekspresinya (pada jaringan tanaman). TINJAUAN PUSTAKA Identifikasi gen yang diekspresikan pada tahap perkembangan atau kondisi tertentu suatu tanaman serta pengujian pola ekspresinya merupakan tahapan penting untuk mendapatkan informasi tentang fungsi gen, baik yang berhubungan dengan proses diferensiasi, perubahan morfologi dan metabolisme serta respons terhadap infeksi patogen. Salah satu cara yang dapat ditempuh untuk mengidentifikasi gen atau bagiannya adalah melalui penapisan (screening) terhadap pustaka cdna, (complementary DNA) yaitu suatu pustaka yang merepresentasikan gen gen yang diekspresikan dalam suatu jaringan, waktu, atau kondisi tertentu. Pustaka cdna diperoleh melalui proses kloning sehingga ratusan gen berbeda dimungkinkan untuk dikoleksi dan diperbanyak secara terus menerus. Identifikasi cdna spesifik dapat dilakukan melalui proses hibridisasi ataupun melalui proses amplifikasi PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk gen tertentu (Haris et al, 2005). Dalam konstruksi pustaka cdna, DNA polimerase yang memerlukan RNA (RNA dependent DNA polymerase) yakni reverse transcriptase (RT) digunakan untuk mengcopy messenger RNA (mrna) menjadi molekul cdna utas ganda. Berbeda dengan mrna yang dengan mudah terdegradasi dan menggambarkan proses transkripsi dari gen gen yang aktif pada suatu jaringan atau sel tertentu, cdna merupakan molekul yang lebih stabil sehingga sesuai untuk disisipkan ke dalam vektor kloning, baik berupa plasmid, cosmid, atau bakteriofage. Populasi mrna yang telah di copy menjadi cdna apabila diklon akan menghasilkan pustaka cdna yang bersifat permanen. Keuntungan pustaka cdna adalah hanya mengandung sekuen yang terekspresi dalam bentuk mrna dalam suatu kondisi atau waktu tertentu (Kleinsmith & Kish, 1995). 1
BAHAN DAN METODE KERJA Bahan Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah daun tembakau, nitrogen cair, CTAB, DEPC, LiCl, PCI, etanol 70%, bufer MOPS, formaldehida, dntp, reverse transcriptase dan Taq polymerase. Metode Isolasi RNA 1 gram daun tembakau segar ditimbang sambil di potong kecil dan dimasukkan ke dalam mortar yang telah disteril. Ke dalam mortar yang berisi jaringan daun, ditambahkan larutan nitrogen cair, biarkan menguap hingga tinggal sedikit, kemudian digerus cepat hingga terbentuk serbuk kering. Serbuk kering dimasukkan ke dalam larutan 0,6 ml buffer CTAB di dalam tabung 1,5 ml dan diinkubasi pada water bath dengan suhu 65 C selama 15 menit. Tabung dimasukkan ke dalam es lalu ditambah dengan 0,6 ml CI kemudian kocok dengan kuat. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil dan diukur volumenya lalu ditambahkan kedalamnya larutan LiCl 10 M, ¼ volume, kemudian diinkubasi di dalam lemari pembeku selama 2 jam. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 500 ul dh2o lalu diekstraksi menggunakan larutan fenol ph 9, 1x volume, kemudian di vorteks dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Supernatan diambil dan diekstraksi kembali menggunakan PCI ph 9, 1x volume, kemudian di veorteks dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh diambil dan dipindahkan pada tabung baru lalu ditambah dengan LiCl 10 M sebanyak ¼ volume yang kemudian diinkubasi di dalam lemari pembeku selama 1 jam agar pengendapan terjadi lebih cepat. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 15 menit lalu supernatan dibuang dan ditambahkan ke dalam tabung sebanyak 500 ul etanol 70%. Sentrifugasi kembali dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 5 menit lalu buang supernatan dan pelet yang tersisa dikeringkan. Setelah kering, pelet dilarutkan menggunakan 30 ul air DEPC. Identifikasi RNA Identifikasi dilakukan dengan gel terdenaturasi menggunakan elektroforesis. Gel dibuat dengan melarutkan 0,4 g agarose dengan MOPS (20x) 2 ml, formaldehida 2,2 ml dan air DEPC 0,1% hingga 2
volume 40 ml. Untuk larutannya digunakan premix (12 ml/sampel; komposisi: 5% MOPS 20x, 50% formamida, 17,5% formaldehida, 27,5% DEPC 0,1%) dan larutan RNA 5 ul (± 10 ug). Larutan dicampur lalu dimasukkan ke dalam es selama 5 menit, kemudian ditambahkan ke dalamnya loading dye. Larutan yang diperoleh di elektroforesis pada gel di dalam bufer MOPS 1x. Reverse Transcriptase PCR Tabung PCR diisi dengan larutan yang terdiri dari 2 ul first strand buffer 5x, 0,5 ul oligo (dt), 1 ul dntp mix, 1 ul RNA, 0,1 ul superscript Tm RT, 5,4 ul DTT dan ddh2o hingga 10 ul. PCR dilakukan pada kondisi annealing (penempelan) pada suhu 30 o C selama 10 menit, pemanjangan dengan suhu 42 o C selama 50 menit, inaktivasi RTase pada suhu 95 o C selama 5 menit dan pasca PCR pada suhu 15 o C selama 15 menit. PCR Produk RT PCR yang diperoleh di PCR kembali. Komposis PCR terdiri dari 1 ul dntp, 0,5 ul taq polymerase, 1 ul buffer mix, 0,4 ul DMSO, 1,5 ul cdna, 0,5 ul primer SOD F, 0,5 ul primer SOD R dan ddh2o hingga volume 10 ul. PCR dilakukan pada kondisi Pra PCR (predenaturasi) pada suhu 94 o C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik, annealing (penempelan) pada suhu 58 o C selama 30 detik, pemanjangan 72 o C selama 1 menit, pasca PCR 72 o C selama 5 menit, pendinginan pada suhu 15 o C selama 15 menit. Semua proses di atas dilakukan sebanyak 30 siklus. Hasil PCR kemudian di elektroforesis selama 30 menit. 3
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Dari hasil elektroforesis, dapat diketahui ada pita berbentuk smear dan pita lainnya yang terbentuk. Pita ini merupakan pita dari RNA yang berhasil diisolasi. Gambar 8. Elusi mrna dari tanaman Pembahasan Seperti halnya isolasi DNA, isolasi RNA pun juga memiliki prinsip yang sama yang terdiri dari tiga tahap, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi RNA, 3. Pengendapan RNA. Proses lisis diawali dengan adanya penggerusan terhadap jaringan daun yang telah diberi nitrogen cair. Tujuan dari penggerusan adalah untuk menghancurkan dinding sel tanaman dan penambahan nitrogen cair bertujuan untuk menjaga RNA agar tidak mudah terdegradasi oleh protease kuat seperti RNase dan menghilangkan kandungan air pada jaringan daun. Untuk lebih mengintensifkan proses lisis, serbuk atau bubuk yang terbentuk dimasukkan ke dalam larutan CTAB. Larutan CTAB ini berfungsi sebagai deterjen yang melisis membran sel dan dinding sel. Setelah dilisis, larutan yang mengandung RNA kemudian diekstraksi dengan larutan CI. Larutan CI berfungsii untuk mengikat lemak dan karbohidrat yang terkandung di dalam larutan. Dalam proses ekstraksi, tabung eppendorf dimasukkan ke dalam es dengan tujuan agar CI yang sudah dimasukkan tidak mudah menguap. Karena larutan polar yang mengandung RNA lebih ringan berat jenisnya dibandingkan dengan CI, maka supernatan yang diperoleh dari proses sentrifugasi, dikoleksi. 4
Larutan yang diperoleh kemudian di endapkan dengan menggunakan LICl. Larutan LiCl yang diperlukan adalah larutan dengan konsentrasi LiCl mencapai 2,5 M. karena sifat dari RNA yang single strand sehingga lebih mudah mengikat LiCl daripada DNA. Oleh karena itu, dalam persitiwa ini, endapan yang terbentuk adalah endapan RNA dimana bobot molekul RNA menjadi lebih besar dibandingkan dengan DNA. Penambahan LiCl jangan berlebih karena bisa RNA telah jenuh sehingga kemudian LiCl berikatan dengan DNA dan mengendapkan DNA juga. Dengan peristiwa pengendapan, RNA dapat dipisahkan dengan DNA. Pelet yang diperoleh lalu diresuspensikan dengan dh2o yang kemudian diekstraksi kembali dengan menggunakan PCI. Penggunaan PCI dimaksudkan untuk kembali mengekstraksi senyawasenyawa organik yang ditakutkan masih terikut di dalam larutan RNA. Dari pelet yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan dh2o yang mengandung DEPC (dietil piro carbonat) 0,01%. Penggunaan DEPC pada air yang digunakan dalam isolasi DNA atau pembilasan pada alat alat yang digunakan dalam isolasi RNA diperuntukkan untuk menghindari RNA mengalami denaturasi akibat RNase. Adanya DEPC menghambat kerja RNase. RNA pada jaringan terdiri dari 3 jenis RNA, yaitu rrna (ribosomal), trna (transport), mrna (messenger). rrna memiliki konsentrasi yang paling besar diantara yang lain, yaitu sekitar 88%, sehingga apabila terbentuk pita yang tebal pada hasil elektroforesis maka dapat diasumsikan pita tersebut adalah trna diaman trna dengan bobot molekul yang lebih besar berada lebih dekat dengan sumur. mrna yang hanya sedikit terkandung di dalam jaringan (sekitar 2%) akan membentuk smear pada hasil elektroforesis seperti yang terlihat pada gambar 1. Untuk mendapatkan gen yang diinginkan, maka dari RNA yang berhasil diisolasi, dilakukan reverse transcriptase PCR untuk mendapatkan cdna. Proses transkripsi terbalik meliputi pembentukan hybrid RNA DNA yang kemudian diikuti dengan pembentukan cdna diawali dengan penempelan primer yang berupa rantai polit (oligo dt) dimana rantai ini secara spesifik akan menempel pada mrna yang telah mengalami pasca transkripsi yaitu penempelan polia pada ujung 3. Setelah terbentuk cdna, maka dilakukan PCR untuk mendapatkan gen SOD. Untuk mendapatkan gen tersebut diperlukan primer spesifik yang dapat menempel dan mengamplifikasi gen tersebut secara spesifik sehingga cdna tersebut dapat diketahui mengandung gen SOD dan dapat dijadikan sebagai pustaka cdna. 5
SIMPULAN 1. Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa dalam mengisolasi RNA sangat diperlukan kehatihatian dalam bekerja karena sifat RNA yang single strand sangat rentan dan mudah terdegradasi (RNase ada dimana mana). 2. Proses isolasi RNA tahapannya mirip dengan mengisolasi DNA akan tetapi proses pemisahan DNA dan RNA dilakukan dengan pengendapan menggunakan LiCl. 3. Pustaka cdna dapat diperoleh dari mengisolasi mrna dari suatu jaringan tanaman sebagai hasil ekspresi dari sebuah gen target. DAFTAR ACUAN Kleinsmith, L.J. & V.M. Kish (1995). Principles of Cell and Molecular Biology. Second Edition. New York, Harper Collins College Publish. 810 p. Haris, N., Aswidinnoor, H., Suwanto A., Suhartono, M. T., Mathius, N. T., Purwantara, A. 2005. Konstruksi pustaka cdna dari daun klon karet AVROS 2037 yang diinfeksi patogen Corynespora cassiicola. Menara Perkebunan, No. 73 (vol. 2), hal: 44 62 6