III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi 1.1. Bahan Bahan yang digunakan terdiri atas biakan murni T. fuciformis dari CV. Asa Agro Corporation Cianjur, Malt Extract, Yeast Extract ekstrak biji kedelai, ekstrak biji jagung, ekstrak biji padi, alkohol 70%, akuades steril, spirtus. 1.2. Alat Alat yang digunakan terdiri atas Hot Plate Stirrer, beaker glass 1000 ml, labu Erlenmayer 250 ml, shaker orbital, timbangan analitik, kertas saring Whattman, alluminium foil, oven, ph meter universal, wrapping. 1.3. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian telah dilakukan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto, pada bulan Agustus Desember 2014. B. Metode Penelitian 1. Rancangan Percobaan Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial. Faktor yang dicoba terdiri atas 2 faktor, yaitu: a. Penggunaan Medium Cair M1 = Medium Malt Extract Yeast Broth (MEYB) M2 = Medium MEYB + ekstrak dari 3 gram biji kedelai M3 = M4 = Medium MEYB + ekstrak dari 3 gram biji jagung. Medium MEYB + ekstrak dari 3 gram biji padi. b. Waktu lama inkubasi W1= 20 hari W2= 30 hari W3= 40 hari
Perlakuan jenis medium dan lama waktu inkubasi dikombanisakan sehingga diperoleh 12 perlakuan yaitu : M1W1: Medium MEYB pada waktu inkubasi 20 hari M1W2: Medium MEYB pada waktu inkubasi 30 hari M1W3: Medium MEYB pada waktu inkubasi 40 hari M2W1: Medium MEYB modifikasi ditambah ekstrak biji kedelai yang diperoleh dari 3 gram biji kedelai pada waktu inkubasi 20 hari. M2W2: Medium MEYB modifikasi ditambah ekstrak biji kedelai yang diperoleh dari 3 gram biji kedelai pada waktu inkubasi 30 hari M2W3: Medium MEYB modifikasi ditambah ekstrak biji kedelai yang diperoleh dari 3 gram biji kedelai pada waktu inkubasi 40 hari M3W1: Medium MEYB modifikasi ditambah ekstrak biji jagung yang diperoleh dari 3 gram biji jagung pada waktu inkubasi 20 hari M3W2: Medium MEYB modifikasi ditambah ekstrak biji jagung yang diperoleh dari 3 gram biji jagung pada waktu inkubasi 30 hari M3W3: Medium MEYB modifikasi ditambah ekstrak biji jagung yang diperoleh dari 3 gram biji jagung pada waktu inkubasi 40 hari M4W1: Medium MEYB modifikasi ditambah ekstrak biji padi yang diperoleh dari 3 gram biji padi pada waktu inkubasi 20 hari M4W2: Medium MEYB modifikasi ditambah ekstrak biji padi yang diperoleh dari 3 gram biji padi pada waktu inkubasi 30 hari M4W3: Medium MEYB modifikasi ditambah ekstrak biji padi yang diperoleh dari 3 gram biji padi pada waktu inkubasi 40 hari Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali ulangan sehingga terdapat 36 unit percobaan. Variabel bebas yang digunakan berupa medium pertumbuhan dan lama inkubasi, sedangkan variabel tergantungnya adalah pertumbuhan miselium. Parameter utama yang diamati adalah bobot kering miselium jamur T.fuciformis, sedangkan parameter pendukungnya adalah bobot basah, ph medium sebelum dan sesudah inkubasi.
2. Diagram Alir Sterilisasi alat dan bahan Pembuatan medium Potato Dextrose Agar (PDA) Peremajaan isolat T.fuciformis dalam medium PDA Pembuatan medium uji Kultivasi isolat T.fuciformis ke dalam medium uji Inkubasi selama 20, 30, dan 40 hari Pemanenan miselium dengan kertas saring Penimbangan bobot basah miselium T.fuciformis Miselium dikeringkan dengan memakai oven pada suhu 60 o C Penimbangan bobot kering miselium T.fuciformis Analisis Data dengan analisis ragam
3. Cara Kerja 3.1. Sterilisasi Alat (Hadioetomo, 1985). Alat yang digunakan dari bahan gelas yaitu labu Erlenmeyer, botol kaca, beaker glass disterilisasi terlebih dahulu menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 15 psi selama 15 menit. Jarum ose dan bor gabus disterilisasi dengan alkohol 70% kemudian dibakar dengan Bunsen pada saat akan digunakan. 3.2. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA) (Muchroji & Cahyana, 2007). Pembuatan medium PDA terdapat pada Lampiran 1. 3.3. Peremajaan Isolat T. fuciformis (Kim et al., 2007). Peremajaan jamur ini dilakukan agar kondisi jamur yang akan dipergunakan dalam keadaan baik. Isolat yang akan diremajakan diambil dengan menggunakan jarum ose dan dipindahkan ke dalam cawan petri yang berisi medium PDA yang sudah disterilisasi kemudian ditutup dan dirapatkan dengan wrapping, dilakukan secara aseptis di dalam laminar airflow (LAF). Cawan petri yang berisi isolat T.fuciformis diinkubasi pada suhu 25 o C selama 5 minggu. 3.4. Pembuatan Medium Malt Extract Yeast Broth (MEYB)(Atlas, 1995). Ekstrak malt sebanyak 6 g dan ektsrak yeast sebanyak 1,2 gbahan dilarutkan dengan akuades dalam beaker glass ukuran 2000 ml, diaduk menggunakan stirrer, setelah homogen ditambahkan akuades 1000 ml. Sebelum dituang dalam labu Erlenmeyer dilakukan pengukuran ph medium. Medium dituang ke dalam labu Erlenmeyer ukuran 250 ml sebanyak 100 ml, ditutup dengan alluminium foil dan direkatkan dengan sari-sari dari bebijian tersebut. Ketiga ekstrak bebijian tersebut masing wrapping. Medium disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 15 psi selama 15 menit. 3.5. Pembuatan ekstrak biji kedelai, biji jagung, dan biji padi (Hiroko, 2005). Biji kedelai, padi, dan jagung masing-masing sebanyak 3 gramdirebus dengan akuades sebanyak 100 ml dalam Beaker glass sampai diperoleh
masing dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer, kemudian dituang kedalam gelas ukur 1000 ml yang berisi medium MEYB. 3.6. Pembuatan medium MEYB + ekstrak biji kedelai (Stamets, 2000). Medium MEYB dimodifikasi ditambah dengan ekstrak biji kedelai sama dengan MEYB (point 3.4.), bedanya pada medium MEYB termodifikasi ditambah ekstrak biji kedelai yang diperoleh dari 3 gram biji kedelai. 3.7. Pembuatan medium MEYB + ekstrak biji padi (Stamets, 2000). Medium MEYB dimodifikasi ditambah dengan ekstrak biji kedelai sama dengan MEYB (point 3.4.), bedanya pada medium MEYB termodifikasi ditambah ekstrak biji padi yang diperoleh dari 3 gram biji padi. 3.8. Pembuatan medium MEYB + ekstrak biji jagung (Stamets, 2000). Medium MEYB dimodifikasi ditambah dengan ekstrak biji kedelai sama dengan MEYB (point 3.4.), bedanya pada medium MEYB termodifikasi ditambah ekstrak biji jagung yang diperoleh dari 3 gram biji jagung. 3.9. Kultivasi jamur T.fuciformis ke dalam medium uji (Jae et al., 2006). Isolatyang ditumbuhkan pada medium PDA dalam cawan petri, dipotong dengan bor gabus dengan diameter 5 mm dipindahkan ke medium kultur menggunakan jarum ose, diinokulasikan ke dalam labu Erlenmeyer 250 ml yang berisi 100 ml medium MEYB dan medium MEYB modifikasi untuk masing-masing labu Erlenmeyer secara aseptis. Medium ditutup dengan menggunakan kapas lalu dilapisi alluminium foil dan direkatkan dengan wrapping, kemudian diinkubasi menggunakan rotary shaker dengan suhu ruang selama 20, 30 dan 40 hari. 3.10. Pengukuran bobot basah miselium T.fuciformis (Irianto et al., 2008). Kultur miselium T.fuciformis yang telah berumur 20, 30 dan 40 hari masing-masing perlakuan lalu dipanen dengan menggunakan kertas saring Whatman No.41 dan untuk mempercepat penyaringan digunakan pompa
vakum. Miselium yang diperoleh kemudian ditimbang menggunakan timbangan analitik. Kemudian dicatat hasilnya. Bobot basah miselium = berat kertas whatman setelah digunakan untuk menyaring dikurangi berat kertas whatman sebelum digunakan. 3.11. Pengukuran bobot kering miselium T.fuciformis (Morrin, 1989). Kultur miselium T.fuciformis yang telah berumur 20, 30 dan 40 hari masing-masing dipanen dan disaring menggunakan kertas Whatman No. 41, dan untuk mempercepat penyaringan digunakan pompa vakum. Miselium dari masing-masing sampel yang telah disaring kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 60 o C sampai diperoleh bobot yang konstan kemudian ditimbang dan hasilnya dicatat. Bobot kering miselium akhir = A-B Keterangan : A = Berat Kertas Whattman perlakuan B = Berat Kertas Whattman tanpa perlakuan 3.12. Pengukuran ph (Hadioetomo, 1985). Derajat keasaman (ph) diukur menggunakan kertas lakmus (ph paper) sebelum dan sesudah perlakuan. Cara pengukuran: kertas lakmus (ph paper) dicelupkan ke dalam medium cair selama 3 5 detik sebelum sterilisasi, kemudian kertas lakmus tersebut diangkat dan dicocokan warna pada strips dengan warnayang ada dalam tabel skala indikator ph. C. Metode Analisis Data rata-rata bobot kering yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan menggunakan analisis ragam (Uji F), dilanjutkan dengan Uji Beda Nyata Jujur (BNJ) pada tingkat kesalahan 5% dan 1% (Steel dan Torrie, 1993).