PENGARUH METODE GLISEROLISASI TERHADAP KUALITAS SEMEN DOMBA POSTTHAWING EFFECT OF GLYCEROLISATION METHOD ON THE QUALITY OF RAM SEMEN POSTTHAWING Labib Abdillah*, Nurcholidah Solihati**, Siti Darodjah Rasad** Universitas Padjadjaran *Alumni Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran Tahun 2015 ** Dosen Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran e-mail : labibabdillah1@gmail.com ABSTRAK Penelitian tentang pengaruh metode gliserolisasi terhadap kualitas semen beku domba postthawing telah dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan April 2015 di Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh metode gliserolisasi terhadap kualitas semen domba postthawing dan mengetahui metode gliserolisasi yang menghasilkan kualitas semen domba postthawing yang lebih baik. Sampel domba digunakan sebanyak satu ekor domba lokal umur dua tahun yang terdapat di Breeding Station Fakultas Peternakan Universtas Padjadjaran yang diambil semennya dua kali dalam satu minggu. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam, perbedaan antara perlakuan dianalisis dengan uji Duncan. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa metode gliserolisasi tidak berpengaruh nyata terhadap motilitas dan abnormalitas spermatozoa postthawing, tetapi berpengaruh nyata terhadap membran plasma utuh spermatozoa, dan metode gliserolisasi satu maupun dua tahap pada suhu 5ºC menghasilkan MPU postthawing yang paling baik dibandingkan perlakuan lainnya. Kata kunci : domba lokal, semen beku, gliserolisasi ABSTRACT Research on the effect of the glycerolisation method on the quality of frozen ram semen postthawing had been carried out in March to April 2015 in the Laboratory of Animal Reproduction and Artificial Insemination Faculty of Animal Husbandry, Padjadjaran University. This research aimed to determine the effect of glycerolisation method on the quality of ram semen postthawing and to know glycerolisation method which produces better quality of postthwing ram semen. The sample of ram used was a local ram aged two years old which is located in the Breeding Station Faculty of Animal Husbandry, Padjadjaran University, in which ram semen is being taken a twice in a week. The data was analyzed using analysis variance, the differences between treatments was analyzed by multiple range test Duncan. As a conclusion, that glycerolisation method doesnt significant effected on motility and abnormality, but significant effected on MPU postthawing, and treatment with all method at 5ºC have a better MPU postthawing than at room temperature. Keyword : local ram, frozen semen, glycerolisation
PENDAHULUAN Seiring dengan semakin bertambahnya jumlah penduduk, maka kebutuhan akan pangan juga turut bertambah, mulai dari pemenuhan kebutuhan pangan sumber karbohidrat yang didominasi oleh sektor pertanian serta kebutuhan sumber protein khususnya protein hewani yang dihasilkan oleh sektor peternakan. Salah satu ternak potensial sebagai penyumbang daging adalah ternak domba, di Indonesia perkembangan ternak domba masih tertinggal jauh apabila dibandingkan dengan sapi khususnya sapi perah dalam hal perkembangbiakan dan perbaikan mutu genetiknya. Salah satu kendala dari perkembangbiakan domba adalah rendahnya pemanfaatan pejantan unggul. Berbagai cara terus dilakukan untuk meningkatkan populasi dan produktivitas domba lokal, salah satunya dengan pemanfaatan teknologi inseminasi buatan (IB), Hingga saat ini keberhasilan IB pada domba belum sesuai dengan yang diharapkan, salah satu faktor yang menyebabkan rendahnya kebuntingan adalah kualitas semen beku yang digunakan yang berkaitan dengan proses produksi semen beku. Masalah yang sering timbul pada proses pembekuan semen adalah kerusakan sel akibat pengaruh kejutan dingin terhadap sel yang dibekukan dan perubahan intraseluler akibat pengeluaran air yang berhubungan dengan pembentukan kristal es. Kerusakan dapat direduksi dengan penambahan suatu zat krioprotektan, krioprotektan adalah agen protektif yang ditambahkan kedalam pengencer untuk melindungi spermatozoa dari kerusakan. Umumnya krioprotektan yang digunakan adalah gliserol, yang berfungsi sebagai agen pelindung (protective agent). Faktor yang mempengaruhi kualitas spermatozoa postthawing diantaranya kurangnya waktu ekuilibrasi sehingga peresapan gliserol tidak maksimal, penambahan gliserol diakhir masa ekuilibrasi tidak memberikan perlindungan yang optimal terhadap pengaruh coldshock dan pembentukan kristal es dikarenakan jarak waktu ke pembekuan terlalu singkat (Ihsan, 2013). Selama proses gliserolisasi, suhu juga merupakan hal penting yang perlu diperhatikan karena spermatozoa sangat cepat terpengaruh oleh perubahan suhu. Suhu ekuilibrasi (5 C) menyebabkan laju metabolisme dari sel hidup akan berkurang, sehingga spermatozoa tidak menghasilkan produk hasil metabolisme sebanyak apabila disimpan dalam suhu ruangan (Parks dan Graham, 1992). Cara penambahan gliserol atau metode gliserolisasi untuk mendapat kualitas semen yang optimal belum banyak dilaporkan. Oleh karena itu penelitian ini dimaksudkan untuk melihat pengaruh metode pemberian gliserol terhadap kualitas semen domba postthawing.
BAHAN DAN METODE Hewan percobaan yang digunakan adalah satu ekor domba lokal jantan berumur 2 tahun, bahan dan alat yang digunakan adalah semen domba, gliserol, Tris, kuning telur, penicilin dan streptomycin, haemocytometer, mikroskop, inkubator, straw 0,25 ml, dan lainlain. Semen segar dikoleksi dua kali dalam satu minggu menggunakan vagina buatan sebanyak dua kali ejakulasi. Semen yang telah dikoleksi di dievaluasi secara makroskopis meliputi pemeriksaan volume, warna, ph, bau, serta konsistensi dan mikroskopis meliputi pemeriksaan gerakan massa, gerakan individu, konsentrasi total, motilitas dan abnormalitas. Semen yang telah di evaluasi kemudian diencerkan dengan pengencer Tris kuning telur dengan komposisi Tris Hydroxymethyl aminomethane 2,42 gr; asam sitrat 1,36 gr; fruktosa 0,88 gr; penicilin 1000 IU dan streptomycin 1 mg per ml pengencer; aquadest 100 ml; 20% kuning telur dan 6% gliserol. Semen diencerkan sesuai dengan konsentrasi spermatozoa, semen dibagi empat, dan diencerkan sesuai perlakuan penelitian dengan metode satu dan dua tahap pada suhu ruang dan suhu dingin (5 C). Semen yang telah mendapat perlakuan gliserolisasi disiapkan ke dalam straw. Masa keseimbangan (equilibrasi) dilakukan pada suhu 5 C selama ± 4 jam. Straw dibekukan dengan menggunakan box styrofoam, straw di uapkan terlebih dahulu diatas uap nitrogen cair selama 8 menit lalu kemudian dicelupkan kedalam nitrogen cair. Thawing dilakukan dengan menggunakan air suhu 39 C selama 45-60 detik (Jadi, 1999). Kualitas semen yang diamati adalah motilitas, abnormalitas serta membran plasma utuh spermatozoa. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali, data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan analisis sidik ragam Rancangan Acak Lengkap (RAL) dan apabila terdapat pebedaan antar perlakuan maka dilakukan uji lanjut dengan menggunakan uji jarak beganda Duncan (α = 0,05). HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Semen Segar Hasil evaluasi semen segar merupakan pemeriksaan awal semen yang akan dijadikan sebagai standar kelayakan semen yang akan diproses lebih lanjut, selain itu juga digunakan untuk perhitungan kebutuhan komposisi pengencer pada saat akan diencerkan atau dibekukan.
Tabel 4. Rataan Nilai Karakteristik Semen Segar Domba Lokal Karakteristik Semen Nilai Rataan Volume (ml) 1,22±0,08 Warna Krem Konsistensi Kental Ph 6,8 Konsentrasi spermatozoa (x 10 7 sel/ml) 318,8±8,45 Gerakan massa +++ Motilitas (%) Abnormalitas (%) 84,4±1,91 7,474 ± 1,07 Pengaruh Metode Gliserolisasi Terhadap Motilitas Spermatozoa Motilitas sering digunakan untuk menilai kualitas semen beku karena parameter ini mudah dan cepat dilakukan (Kostaman dkk, 2000). Untuk keperluan IB minimal motilitas yang diizinkan adalah 40%. Tabel 5. Rataan Persentase Motilitas Spermatozoa Pada Berbagai Perlakuan Ulangan Perlakuan P1 P2 P3 P4...(%)... 1 43,20 43,48 42,37 45,10 2 41,22 42,16 41,34 43,36 3 43,80 45,19 42,86 45,71 4 38,58 40,00 38,32 41,44 5 40,18 41,93 39,09 42,37 Rataan 41,40 42,55 40,80 43,60 Jumlah 206,98 212,76 203,98 217,98 Keterangan : P1= satu tahap pada suhu ruangan P2= satu tahap pada suhu 5º C P3= dua tahap pada suhu ruangan P4= dua tahap pada suhu 5º C Hasil analisis ragam menunjukan bahwa perlakuan berbagai metode gliserolisasi tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap motilitas spermatozoa postthawing. Hasil penelitian ini sesuai dengan Yusuf dkk (2006) bahwa metode penambahan gliserol yang berbeda tidak menghasilkan motilitas postthawing yang berbeda. Hal ini diduga pada pencampuran pengencer yang mengandung gliserol satu tahap maupun dua tahap terjadi peningkatan tekanan osmotik dalam larutan pengencer, peningkatan ini dapat mencapai 800-1000 mosmol (Herdis, 2005). Menurut Apriyanti (2012) perubahan tekanan osmotik dapat menyebabkan kerusakan pada spermatozoa. Hasil penelitian menunjukkan metode gliserolisasi pada perlakuan P4 menghasilkan motilitas spermatozoa yang cenderung lebih tinggi. Hal ini diduga disebabkan karena
penambahan gliserol secara bertahap spermatozoa diberikan kesempatan untuk beradaptasi dengan pengencernya sehingga keseimbangan molekuler antara spermatozoa dan pengencer dapat tercapai (Toelihere, 1993). Selain itu gliserolisasi di suhu 5 C dapat meminimalisir kematian spermatozoa akibat aktifitas metabolisme yang tinggi dan efek negatif kuning telur pada suhu ruangan. Metode gliserolisasi satu tahap maupun dua tahap pada suhu ruangan maupun 5ºC menghasilkan motilitas diatas batas normal motilitas yang diizinkan untuk IB yaitu 40% (Toelihere, 1993). Menurut Feradis (2010) metode gliserolisasi satu tahap maupun dua tahap menghasilkan kualitas semen postthawing yang sama baiknya. Gliserol memiliki peranan penting dalam proses pembekuan semen dan pada kadar yang optimum akan bermanfaat untuk mempertahankan kualitas semen postthawing, karena gliserol mampu melindungi kerusakan sel spermatozoa selama proses pembekuan (Evans dan Maxwell, 1987). Perlindungan yang diberikan adalah memodifikasi bentuk kristal es menjadi lebih kecil dan mencegah penumpukan elektrolit yang terbentuk saat proses pembekuan (Toelihere, 1993). Pengaruh Metode Gliserolisasi Terhadap Abnormalitas Spermatozoa Pemeriksaan abnormalitas spermatozoa domba dilakukan dengan cara pewarnaan diferensial menggunakan cairan eosin dan diamati dibawah mikroskop. Tabel 6. Rataan Persentase Spermatozoa Abnormal pada Berbagai Perlakuan Ulangan Perlakuan P1 P2 P3 P4...(%)... 1 3,39 3,46 2,84 2,59 2 3,24 3,21 2,89 3,02 3 3,61 3,54 3,93 3,12 4 3,49 3,13 3,36 3,09 5 3,20 3,45 2,93 2,73 Rataan 3,38 3,36 3,19 2,91 Jumlah 16,92 16,81 15,95 14,55 Abnormalitas spermatozoa yang dihasilkan dari penelitian ini didominasi abnormalitas sekunder seperti ekor patah, putus maupun tergulung. Abnormalitas sekunder ini bisa terjadi saat ejakulasi semen, faktor panas yang berlebih-lebihan, pendinginan yang cepat, kontaminasi dengan air, urin, atau antiseptik, dan sebagainya. Selain itu, proses dalam pembuatan preparat ulas juga dapat mempengaruhi persentase abnormalitas. Berdasarkan hasil penelitian didapat hasil bahwa perlakuan berbagai metode gliserolisasi tidak memberikan hasil yang berbeda nyata terhadap abnormalitas, namun pada perlakuan P1 memiliki abnormalitas yang cenderung lebih tinggi, hal ini diduga disebabkan oleh efek negatif
dari kuning telur pada suhu ruangan, karena menurut Feradis (2010) beberapa unsur dari kuning telur dapat menghasilkan racun pada suhu ruangan, selain itu tingginya aktifitas spermatozoa pada suhu ruangan juga akan mempercepat kerusakan dari spermatozoa. Abnormalitas yang terjadi juga diduga akibat dari perlakuan pembekuan seperti coldshock, perubahan tekanan osmotik maupun saat membuat preparat ulas. Spermatozoa yang mengalami coldshock kadang ekor dan bagian tubuhnya melingkari bagian kepala dan hal ini menyebabkan abnormalitas pada spermatozoa (Salisbury dan Van Demark, 1985). Dilanjutkan oleh Herdis (2005) bahwa pada saat gliserolisasi terjadi perubahan tekanan osmotik yang dapat mencapai 800-1000 mosmol. Perubahan tekanan osmotik ini memungkinkan menyebabkan abnormalitas pada spermatozoa, karena menurut Herdiawan (2004) terjadinya perubahan fisik media hidup spermatozoa baik perubahan tekanan osmotik, maupun pembentukan kristal es intraseluler dapat menyebabkan perubahan struktur spermatozoa seperti ekor spermatozoa membengkok atau kepala terlepas dari ekornya. Pengaruh Metode Gliserolisasi Terhadap Membran Plasma Utuh Spermatozoa Membran plasma utuh dapat dilihat dengan menggunakan larutan hipoosmotik. Membran plasma yang utuh akan ditandai dengan melengkungnya ekor spermatozoa sedangkan spermatozoa dengan membran plasma yang rusak tidak terlihat pembengkokan ekor karena membran plasma tidak dapat mempertahankan larutan hipoosmotik. Tabel 7. Rataan Persentase MPU Spermatozoa Domba Lokal pada Berbagai Perlakuan Ulangan Perlakuan P1 P2 P3 P4...(%)... 1 37,25 37,62 35,47 37,61 2 35,50 38,14 35,55 36,50 3 36,36 37,91 34,38 37,31 4 33,66 36,36 32,84 35,15 5 34,88 36,16 33,33 35,47 Rataan 35,53 37,24 34,31 36,41 Jumlah 177,66 186,20 171,56 182,04 Berdasarkan hasil analisis ragam bahwa metode gliserolisasi yang berbeda menghasilkan hasil yang berbeda nyata, untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan dilakukan uji jarak berganda Duncan. Hasil analisis uji jarak berganda Duncan dapat dilihat pada Tabel 8.
Tabel 8. Uji Jarak Bergandan Duncan MPU Spermatozoa Domba Lokal pada Berbagai Perlakuan Perlakuan Rataan MPU (%) Signifikan P3 34,31 a P1 35,53 b P4 36,41 c P2 37,24 c Keterangan : Huruf yang berbeda pada kolom menunjukkan berbeda nyata (Fhitung>Ftabel0,05) Metode gliserolisasi satu tahap dan dua tahap pada suhu 5º C memberikan hasil yang tidak berbeda nyata terhadap MPU spermatozoa domba postthawing. Hal ini diduga pada pencampuran gliserol satu tahap dan dua tahap terjadi peningkatan tekanan osmotik dalam larutan pengencer. Menurut Herdis (2005) peningkatan ini dapat mencapai 800-1000 mosmol, akibat dari tingginya perubahan tekanan osmotik yang terjadi maka terjadi kerusakan membran plasma utuh spermatozoa. Menurut Apriyanti (2012) perubahan tekanan osmotik dapat menyebabkan pecahnya membran plasma spermatozoa. Kondisi membran plasma yang baik akan memberikan pengaruh yang baik pula pada motilitas dikarenakan pada membran plasma banyak mengandung makromolekul yang berfungsi dalam proses metabolisme dan melindungi organel sel spermatozoa. Perlakuan p1 dan p3 memberikan hasil yang nyata lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan p2 dan p4, hal ini diduga akibat suhu pada saat pencampuran pengencer bergliserol mengakibatkan toksik pada spermatozoa. Membran plasma spermatozoa kaya akan lemak tak jenuh sehingga rentan terhadap peroksidasi lipid (Maxwell dan Watson, 1996). Akibat dari peroksidasi lipid adalah terbentuknya peroksid lipid yang akan bereaksi dengan radikal bebas dan merangsang terjadinya reaksi otokatalitik sehingga mengakibatkan rusaknya membran plasma spermatozoa (Tambing dkk, 2000). Suhu ruangan dapat menyebabkan meningkatnya aktifitas metabolisme spermatozoa dan menghasilkan radikal bebas hasil dari metabolisme sel. Menurut Yulnawati dan Setiadi (2005) penurunan kualitas spermatozoa selama penyimpanan akibat toksik dari spermatozoa yang mati atau dari zat yang terkandung dalam pengencer yang telah mengalami oksidasi dapat menyebabkan tingginya kadar radikal bebas yang bisa merusak keutuhan membran plasma.
SIMPULAN berikut : Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan maka dapat diambil kesimpulan sebagai 1. Metode gliserolisasi tidak berpengaruh nyata terhadap motilitas dan abnormalitas spermatozoa domba lokal postthawing, namun berpengaruh nyata terhadap membran plasma utuh spermatozoa. 2. Metode gliserolisasi satu tahap maupun dua tahap pada suhu 5º C menghasilkan MPU SARAN semen postthawing yang paling baik dibanding perlakuan satu tahap maupun dua tahap pada suhu ruangan. Berdasarkan hasil penelitian yang telah diperoleh, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai tingkat fertilitas penggunaan semen beku hasil pembekuan dengan metode gliserolisasi yang berbeda. DAFTAR PUSTAKA Apriyanti, C. 2012. Pengaruh waktu ekuilibrasi terhadap kualitas semen beku sapi pesisir pre dan post thawing. Tesis. Universitas Andalas. Padang Evans and Maxwell. 1987. Salamon`s artificial insemination of sheeps and goat`s. Butterworth. Sydney. Feradis. 2010. Bioteknologi reproduksi pada ternak. Alfabeta. Bandung. 18-85. Herdiawan, I. 2004. Pengaruh laju penurunan suhu dan jenis pengencer terhadap kualitas semen beku domba priangan. Balai Penelitian Ternak. Bogor. Herdis. 2005. Optimalisasi inseminasi buatan melalui aplikasi teknologi laserfunktur pada domba garut. Desertasi Program Doktor. Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor. Ihsan, M. N. 2013. Pembekuan vitrifikasi semen kambing boer dengan tingkat gliserol berbeda. Jurnal ternak tropika vol. 14 no. 2 hal. 43. Jadi, M.L. 1999. Pengaruh lama ekuilibrasi dan lama pembekuan terhadap kualitas semen beku domba. Tesis. Universitas Padjadjaran. Bandung Kostaman, T., I. Ketut Sutama., P. Situmorang., I.G.M. Budiarsana. 2000. Pengaruh jenis pengencer dan waktu ekuilibrasi terhadap kualitas semen beku kambing peranakan etawah. Balai Penelitian Ternak. Bogor.
Maxwell, W.M.C., and P.F. Watson. 1996. Recent progress in the preservation of ram semen. Anim. Reprod. Sci. 42:55-65. Parks, J.E. dan J.K. Graham. 1992. Effect of cryopreservation procedures on sperm membrane. Theriogenology 38: 209 222. Salisbury, G.W., N.L. Van Demark. 1985. Fisiologi reproduksi dan inseminasi buatan pada sapi. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta Tambing, S.N., M.R. Toelihere., T.L. Yusuf, I.K. Sutama. 2000. Pengaruh gliserol dalam pengencer tris terhadap kualitas semen beku kambing peranakan etawah. Jurnal ilmu ternak dan veteriner vol. 5 no.2. Toelihere, M.R. 1993. Inseminasi Buatan Pada Ternak. Angkasa. Bandung. Yulnawati, M., A. Setiadi. 2005. Motilitas dan keutuhan membran plasma spermatozoa epididimis kucing selama penyimpanan pada suhu 4º C. Media Kedokteran Hewan 21(3) : 100-104. Yusuf, T.L., R.I. Arifiantini, Y. Mulyadi. 2006. Efektifitas waktu pemaparan gliserol terhadap motilitas spermatozoa pada pembekuan semen domba lokal menggunakan pengencer tris kuning telur. Bogor Agricultural University. Bogor UCAPAN TERIMAKASIH Penulis mengucapkan terimakasih yang sedalam-dalamnya kepada para pembimbing yang telah memberi masukan dalam penelitian ini, kepada tim Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan Universitas Padjadjaran, Breeding Station Universitas Padjadjaran, Orangtua penulis, serta pihak-pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu.