ANALISIS GEN PENYANDI PROTEIN TERIKAT MEMBRAN, impx, YANG TERLIBAT DALAM PATOGENISITAS PADA Xanthomonas axonopodis pv. glycines ANY FITRIANI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2 0 0 7
SURAT PERNYATAAN Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa segala pernyataan dalam disertasi saya yang berjudul ANALISIS GEN PENYANDI PROTEIN TERIKAT MEMBRAN, impx, YANG TERLIBAT DALAM PATOGENISITAS PADA Xanthomonas axonopodis pv. glycines Merupakan hasil karya saya sendiri dengan arahan Komisi Pembimbing, dan bukan hasil jiplakan atau tiruan dari tulisan siapapun. Disertasi ini belum pernah diajukan untuk memperoleh gelar pada program sejenis di perguruan tinggi manapun Semua data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya. Bogor, Februari 2007 Any Fitriani G361020021
ABSTRAK Any Fitriani. Analisis gen penyandi protein terikat membran, impx, yang terlibat dalam patogenisitas pada Xanthomonas axonopodis pv. glycines. Dibimbing oleh Antonius Suwanto, Budi Tjahjono dan Aris Tri Wahyudi. Xanthomonas axonopodis pv glycines (Xag) adalah bakteri penyebab penyakit pustul pada tanaman kedelai. Mutan non patogenik (Xag M715) telah dikonstruksi melalui mutagenesis transposon untuk mengetahui gen yang terlibat patogenisitas. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk 1) mengisolasi gen/gen-gen yang terlibat patogenisitas pada Xag YR32, (2) mengkarakterisasi gen/gen-gen yang terlibat patogenisitas pada Xag YR32, (3) mempelajari struktur dan fungsi gen yang terlibat patogenisitas pada Xag YR32, (4) menentukan posisi penyisipan transposon pada Xag M715. DNA sekitar penyisipan Tn5 dari Xag YR32 diisolasi melalui inverse Polymerase Chain Reaction (IPCR). Analisis BLASTN dari urutan DNA memperlihatkan similaritas pada nukleotida yang terlibat patogenisitas pada Xanthomonas axonopodis pv citri (GenBank accession No. NC003919) dengan identity 99%. BLASTX menunjukkan bahwa urutan nukleotida menyandikan inner membrane protein (imp) dan cystein protease (cp) (identity 90% dan 99%). Analisis Open Reading Frame (ORF) finder menunjukkan dua arah transkripsi yang berlawanan dari gen impx dan cp. Putative promoter, ribosom binding site (RBS), kodon awal dan akhir ditemukan pada gen impx. Putative promoter, RBS, kodon awal dan akhir ditemukan pada gen cp. Analisis ini menunjukkan bahwa transposon menyisip pada C-terminal impx. Analisis fungsi protein menunjukkan sebagai putative ABC-ATPase, suatu protein transmembran, famili ABC transporter, termasuk kelompok ABC-A1 yang mengekspor molekul. Analisis menunjukkan bahwa transposon menyisip pada ATP-ase dari ABC-ATPase. Analisis transkrip pada Xag YR32 menunjukkan bahwa gen ditranskrip tetapi hanya terdeteksi sangat tipis pada Xag M715. Analisis hibridisasi Northern memperlihatkan bahwa gen impx bersifat monosistronik dengan ukuran sekitar 546 bp. Introduksi impx ke dalam Xag M715 dapat mengembalikan sifat patogen pada bioesai kotiledon kedelai. Xag M715 menjadi patogen kembali. Sepuluh hari setelah infeksi, kotiledon yang terinfeksi oleh Xag YR32 menjadi coklat, sedangkan Xag M715 (prp06) mencoklat pada 14 hari setelah infeksi. Analisis statistik menunjukkan bahwa fenotip Xag M715 berbeda dengan Xag M715 (prp06) dan fenotip Xag YR32 sama dengan Xag M715 (prp06). Analisis awal ekspresi protein menunjukkan bahwa gen impx diekspresikan pada E. coli BL21(DE3)pLysS. Fenotip non-patogenik dari Xag M715 disebabkan oleh penyisipan transposon pada ATP-ase dari ABC-ATPase transporter. Kata kunci : impx, patogenisitas, Xanthomonas axonopodis pv. glycines
ABSTRACT Any Fitriani. Analysis of a gene encoding transmembrane protein, impx, involved in pathogenicity in Xanthomonas axonopodis pv. glycines. Under supervision of Antonius Suwanto, Budi Tjahjono, and Aris Tri Wahyudi. Xanthomonas axonopodis pv glycines (Xag) is the cause of bacterial pustule disease in soybean. A non pathogenic mutant (Xag M715) has been constructed by transposon mutagenesis to identify gene involved in pathogenicity. The objective of this study are (1) to isolate gene/genes involved pathogenicity in Xag YR32, (2) to characterize gene/genes involved pathogenicity in Xag YR32, (3) to study structure and function of gene involved pathogenicity in Xag YR32, (4) to determine position of transposon insertion in Xag M715. DNA from Xag YR32 surrounding the Tn5 insertion (1,3 kb) was isolated employing inverse Polymerase Chain Reaction (IPCR). BLASTN analysis of the DNA sequence showed similarity to a region involved in pathogenicity of Xanthomonas axonopodis pv citri (GenBank accession No. NC 003919) 99% identity. BLASTX showed the sequence encodes inner membrane protein (imp) and cystein protease (cp) (identity 90% and 99%, respectively). Open Reading Frame (ORF) finder analysis showed two opposite transcription direction of impx and cp genes. Putative promoter, ribosome binding site (RBS), start and stop codon, and stop transcription were found in impx. However, promoter, RBS, start and stop codon were found in cp. This analysis showed that the transposon was inserted in C-terminal portion of ImpX. Analysis of protein function indicated as putative ABC-ATPase. It is a transmembrane protein ABC transporter family, include in ABC-A1 type cluster that exported molecule. This analysis revealed that transposon was inserted in ATPase of ABC-ATPase. Transcript analysis in Xag YR32 revealed that the gene was transcribed but could only be detected as a very thin in Xag M715. Northern hybridization analysis showed that the gene is monocistronic of about 546 bp. Introduction of impx into Xag M715 could restore pathogenicity in soybean cotyledon assay, Xag M715 recovered to pathogenic. Ten days after infection, cotyledon infected by Xag YR32 were browning, meanwhile Xag M715(pRP06) were browning in 14-days after infection. Statistical analysis revealed that phenotype of Xag M715 was different from Xag M715(pRP06) and phenotype of Xag YR32 was the same as Xag M715(pRP06). Preliminary protein expression of impx in E. coli showed that gene of impx was expressed in E. coli BL21(DE3)pLysS. Non pathogenic phenotype of Xag M715 was caused by transposon insertion in ATPase of ABC-ATPase transporter. Key words : impx, pathogenicity, Xanthomonas axonopodis pv. glycines
ANALISIS GEN PENYANDI PROTEIN TERIKAT MEMBRAN, impx, YANG TERLIBAT DALAM PATOGENISITAS PADA Xanthomonas axonopodis pv. glycines ANY FITRIANI Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor Pada Program Studi : Biologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007
Judul Disertasi Nama NRP Program Studi : Analisis Gen Penyandi Protein Terikat Membran, impx, yang Terlibat dalam Patogenisitas pada Xanthomonas axonopodis pv glycines : Any Fitriani : G361020021 : Biologi Menyetujui, Komisi Pembimbing Ketua Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. Anggota Anggota Dr. Ir. Budi Tjahjono, M.Agr. Dr. Drs. Aris Tri Wahyudi, M.Si. Mengetahui, Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Prof. Dr. Ir. Khairil. A. Notodiputro, MS. Tanggal ujian : 16 April 2007 Tanggal lulus : 16 April 2007
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas rahmat dan hidayah Nya, penulis dapat menyelesaikan disertasi yang berjudul Analisis Gen Penyandi Protein Terikat Membran, impx, yang Terlibat dalam Patogenisitas pada Xanthomonas axonopodis pv glycines. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. atas segala bimbingan dan dedikasinya selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium Research Center Microbial Diversity (RCMD) dan penulisan disertasi. Atas kebaikan dan perhatian Beliau yang tulus, penulis dapat melakukan sebagian penelitian di Laboratorium Research and Development Charoen Phokpand Indonesia. Diskusi-diskusi yang menarik dan sarat dengan ilmu, selalu Beliau tumpahkan dan tidak mengenal waktu. Banyak hal dari Beliau yang dapat dijadikan teladan sebagai ilmuwan dan pendidik yang baik. Selama menjadi bimbingan Beliau, penulis berkesempatan menjadi asisten praktikum matakuliah Rekayasa Genetika Tahun 2004/2005, Tahun 2005/2006, dan Tahun 2006/2007 PS Bioteknologi, SPs IPB, pengajar pada Pokok Bahasan Bioteknologi Mikroba pada matakuliah Prinsip-prinsip Bioteknologi (BIO-400) pada Tahun 2005/2006, Departemen Biologi, IPB, Reviewer pada Majalah Biosains Hayati, November 2006. Selain itu, penulis diminta untuk memberi Kuliah khusus pada matakuliah Kapita Selekta Bioteknologi Program Studi Biologi, Program Pascasarjana ITB pada 6 November 2006. Penulis sampaikan terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya untuk Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. atas pengarahan pada metode Inverse Polymerase Chain Reaction (IPCR) dan segala masukan dalam diskusi selama penelitian dan penulisan disertasi ini. Beliau juga selalu memberikan dukungan semangat selama penelitian. Terima kasih kepada Dr. Ir. Budi Tjahjono, M.Agr. atas dukungan dan doa selama proses penelitian berlangsung. Penulis tak lupa sampaikan rasa terima kasih pada Bapak Dr. Muhammad Machmud, M.Sc., APU dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Departemen Pertanian atas masukan dan penyempurnaan disertasi ini. Juga kepada Bapak Dr. Ir. Giyanto, M.Si dari Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian IPB atas masukan dan wawasan tentang ilmu yang dipelajari pada disertasi ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan pada pengelola Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS) Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan
Nasional atas pemberian beasiswa, Ketua Departemen Pendidikan Biologi, Dekan Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Rektor Universitas Pendidikan Indonesia, atas ijin yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan di program studi Biologi Sekolah Pascasarjana IPB. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dekan Sekolah Pascasarjana IPB, Ketua PS Biologi SPs IPB atas perkenaan penulis melanjutkan pendidikan S3 di IPB. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada sahabat-sahabat, Dr. Yaya Rukayadi, atas dorongan semangat yang tak henti-henti dan bantuan literatur yang sulit diperoleh. Dr. Irawan Tan, atas dukungan dan persahabatan yang tulus. Juga kepada teman-teman alumni RCMD, Dr. Andi Khaeruni R., Ir. Cecilia A. Semahu, M.Si., Dra. Nurhasanah, M.Si, Ir. Dede Abdulrakhman, dan teman satu bimbingan di RCMD, Ir. Tati Barus, M.P. dan Artini Pangastuti, SSi, M.Si. atas persahabatan yang tulus. Kepada Mamah dan Bapak, penulis mengucapkan banyak terima kasih atas dorongan moril dan doa selama menempuh pendidikan ini. Terima kasih yang tak terhingga kepada suami tercinta, Taufik Mahpudin atas doa, kasih sayang, dukungan moril dan materil, pengertian dan pengorbanannya selama penulis mengikuti program S3 di IPB. Kepada semua pihak yang telah membantu dan tak tersebutkan namanya, penulis ucapkan terima kasih atas segala bantuannya. Semoga budi baik yang diberikan diterima Allah SWT sebagai amal shaleh. Semoga disertasi ini menjadi sumbangan ilmu yang bermanfaat. Amien. Bogor, April 2007 Any Fitriani ix
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bandung, pada tanggal 2 Februari 1965 sebagai anak sulung dari lima bersaudara dari pasangan Bapak Achmad Sumantri dan Ibu Emi Rustemi. Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar hingga Sekolah Menengah Atas di Bandung. Pada tahun 1983 penulis diterima sebagai mahasiswa Biologi Institut Teknologi Bandung (ITB) melalui jalur Proyek Perintis II. Pada tahun 1987 sampai dengan 1989, penulis menjadi staf peneliti di Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan dan Fitokimia, Pusat Antar Universitas Ilmu Hayati, ITB. Pada tahun 1989 penulis lulus sebagai Sarjana Biologi. Pada tahun 1989 sampai dengan 1991, penulis menjadi Kepala Bagian Research and Development Plant Tissue Culture pada PT Purwasari Nusantara, Yayasan Bunga Nusantara. Pada tahun 1995 penulis mendapat beasiswa Tim Manajemen Program Doktor (TMPD) dari Departemen Pedidikan dan Kebudayaan RI, diterima pada Program Studi Biologi, Program Pascasarjana ITB dan menamatkannya pada tahun 1998. Pada tahun 2002 penulis mendapat beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS) dari Departemen Pendidikan Nasional RI untuk melanjutkan Program Doktor pada Program Studi Biologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor (IPB). Penulis bekerja sebagai staf pengajar Departemen Pendidikan Biologi, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Indonesia sejak tahun 1991. Selama mengikuti Program Doktor, penulis berkesempatan menyajikan karya ilmiah berjudul Analysis of A Gene Involved in Pathogenicity of Xanthomonas axonopodis pv. glycines pada Pertemuan Ilmiah Tahunan Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia (PIT PERMI) 2006 di Solo, 26-27 Agustus 2006. Sebagian dari Disertasi ini akan dipublikasikan pada Journal Microbiology Indonesia dengan judul Evidence for a Link Between Pathogenicity and the Role of Imp Bacterial Transport Effector Proteins in Soybean Infection by Xanthomonas axonopodis pv glycines (telah diterima untuk publikasi Volume 12, Number 2, September 2007).
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... xiii DAFTAR GAMBAR... xiv I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang... 1 1.2 Tujuan dan Manfaat Penelitian... 3 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Mikroorganisme Penyebab Pustul Bakteri... 4 2.2 Gejala dan Epidemiologi Pustul Bakteri... 5 2.3 Patogenisitas pada Bakteri... 7 2.4 Mekanisme Patogenisitas pada Bakteri... 8 2.5 Protein Membran Dalam (Inner Membrane Proteins)... 12 2.6 ATP Binding Cassette Transporter (ABC transporter)... 16 2.7 ATPase... 18 III. BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian... 19 3.2 Bahan dan Alat 3.2.1 Galur-galur Bakteri dan Plasmid... 19 3.2.2 Media Tumbuh... 20 3.3 Metodologi 3.3.1 Isolasi DNA Genom Total... 20 3.3.2 Inverse Polymerase Chain Reaction (IPCR)... 21 3.3.3 Isolasi dan Pemurnian Hasil PCR dan Fragmen DNA dari Gel Agarosa... 21 3.3.4 Kloning Gen Patogenisitas... 22 3.3.5 Isolasi DNA Plasmid... 23 3.3.6 Sekuensing dan Analisis Sekuen DNA... 23 3.3.7 Analisis Urutan Asam Amino... 23 3.3.8 Isolasi RNA dan RT-PCR... 24 3.3.9 Analisis Hibridisasi Northern... 24 3.3.10 Uji Komplementasi... 26 3.3.11 Konjugasi Tiga Tetua... 26 3.3.12 Bioesai Patogenisitas pada Kotiledon Kedelai... 27 3.3.13 Kloning dan Ekspresi Gen impx... 27 3.3.14 Isolasi Protein... 28 3.3.15 Elektroforesis Protein dengan SDS-PAGE... 28 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Inverse PCR... 29 4.2 Analisis urutan DNA... 30 4.3 Analisis Struktur Gen... 32 4.4 Analisis Fungsi ImpX... 39 4.5 Analisis RNA... 43 4.6 Uji Komplementasi... 46 4.7 Bioesai Kotiledon... 48 4.8 Analisis Ekspresi Gen impx... 56 xi
Halaman 4.9 Implikasi Hasil Penelitian dengan Penelitian Sebelumnya... 59 4.10 Hipotesis Mekanisme Patogenisitas pada Xag... 60 V. KESIMPULAN 5.1 Kesimpulan... 62 5.2 Saran... 62 DAFTAR PUSTAKA... 63 xii
DAFTAR TABEL Nomor Halaman 1 Galur-galur bakteri dan plasmid yang digunakan dalam Penelitian 19 2 Hasil analisis BLASTX. 32 3 Hasil analisis FASTX.. 32 4 Hasil pengujian patogenisitas dengan bioesai kotiledon 48 5 Persentase gejala nekrosis pada kotiledon kedelai 49 6 Tabel kontingensi efek nekrosis setiap perlakuan galur bakteri.. 53
DAFTAR GAMBAR Nomor Halaman 1 Pustul bakteri pada kedelai... 7 2 Skema prediksi lokasi subselular faktor virulen pada bakteri Gram negatif dan Gram positif... 10 3 Skematik lima jalur utama sistem sekresi... 11 4 Hipotesis model mekanisme molekuler aktivitas virulen dan avirulen dari AvrBs3 dari Xanthomonas campestris pv vesicatoria 13 5 Beberapa tipe protein terikat membran lipid bilayer... 15 6 Jalur target dan insersi protein membran pada E. coli. 16 7 Struktur skematik beberapa ABC transporter... 18 8 Hidrolisis ATP... 19 9 Elektroforesis gel agarosa DNA produk dari hasil inverse PCR... 29 10 Elektroforesis gel agarosa DNA hasil verifikasi pft3551... 30 11 Plasmid rekombinan pft3551... 30 12 Hasil analisis BLASTN... 31 13 Hasil penyejajaran urutan nukleotida ukuran 1,3 kb dengan database... 31 14 Hasil analisis ORF untuk Imp... 33 15 Hasil analisis ORF untuk Cp... 34 16 Struktur gen pada fragmen 1,3 kb dari Xanthomonas axonopodis pv. glycines YR32... 35 17 Posisi situs restriksi pada fragmen 1,3 kb Xag YR32... 36 18 Hasil analisis ORF sekuen imps yang telah digabungkan... 36 19 Urutan DNA dari struktur gen impx dan asam aminonya serta posisi penyisipan transposon... 38 xiv
Nomor Halaman 20 Peta fisik gen imp, cp dan tonb-dependent receptor... 39 21 Karakter-karakter putative ABC-ATPase transporter ImpX pada Xag YR32. 41 22 Peta fisik putative ABC-ATPase transporter ImpX pada Xag YR32... 42 23 Hasil elektroforesis sampel RNA total dari berbagai Xanthomonas... 43 24 Elektroforesis gel agarosa DNA hasil RT-PCR dari RNA total sampel... 44 25 Elektroforesis gel agarosa terdenaturasi RNA dan analisis hibridisasi RNA Xag YR32 dan Xag M715... 46 26 Konstruksi plasmid prp06... 47 27 Hasil verifikasi prp06... 48 28 Diagram persentase gejala nekrosis pada kotiledon kedelai setelah diinfeksi beberapa galur bakteri... 49 29 Hasil uji komplementasi... 50 30 Konstruksi plasmid peg01 untuk ekspresi protein heterologous.. 57 31 Verifikasi hasil PCR impx dan verifikasi plasmid peg01 dengan NdeI dan BamHI... 58 32 Hasil SDS-PAGE protein total... 58 33 Uji patogenisitas Xag YR32 dan Xag M715 in planta... 59 34 Hipotesis mekanisme patogenisitas pada Xag YR32 dan Xag M715... 60 xv