I. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April - Juli 2012 di Laboratorium. Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

dokumen-dokumen yang mirip
III. METODE. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari - April 2015 di Laboratorium

III. METODE PENELITIAN. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Instrumentasi

III. METODELOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei-November 2013 di Laboratorium

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2012 sampai bulan Desember 2012 di

III. METODE. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-April 2015 di Laboratorium

METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2012 sampai dengan bulan Juni 2012 di

METODELOGI PENELITIAN. Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Mei-November 2013 di Laboraturium

BAB III METODE PENELITIAN. adalah Bacillus subtilis dan Bacillus cereus yang diperoleh di Laboratorium

III. METODE. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari - Mei 2015 di Laboratorium

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni-November Penelitian ini

III. METODE PENELITIAN. Waktu penelitian dilakukan pada bulan Februari Oktober. penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia Universitas Lampung.

BAB III METODE PENELITIAN. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: waterbath,

III. METODE PENELITIAN

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitianini dilaksanakandaribulanagustus - Desember 2015 di

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Percobaan yang dilakukan pada penelitian ini yaitu penggunaan amonium

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juli sampai bulan September 2010 di

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Maret Agustus 2015 di

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini telah dilaksanakan pada Oktober 2014 sampai dengan Februari

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan dari bulan Juli 2014 sampai dengan bulan September

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret 2011 sampai dengan bulan

LAMPIRAN. Lampiran 1. Foto Lokasi Pengambilan Sampel Air Panas Pacet Mojokerto

BAB III BAHAN, ALAT DAN METODA

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret sampai bulan Agustus 2013 di

BAB III METODE PENELITIAN. Biologi dan Laboratorium Biokimia, Departemen Kimia Fakultas Sains dan

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Lampiran 1 Metode pengujian aktivitas protease (Walter 1984)

BAB III METODE PENELITIAN. A. Waktu dan Tempat Penelitian. Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-November 2012 di

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini sudah dilaksanakan dari bulan Februari sampai bulan Juli 2013 di

III. METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi

BAB III METODE PENELITIAN. variasi suhu yang terdiri dari tiga taraf yaitu 40 C, 50 C, dan 60 C. Faktor kedua

BAB III METODE PENELITIAN. Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana

METODE PENELITIAN. Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Januari-Mei 2015 di Laboratorium

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan Agustus-Desember 2015 di Laboratorium

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Juli sampai September 2012,

BAB III BAHAN DAN CARA KERJA. Penelitian dilakukan di Laboratorium Teknologi Bioindustri, Pusat

METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai Juni 2014 bertempat di

BAB III METODE PENELITIAN. lengkap (RAL) pola faktorial yang terdiri dari 2 faktor. Faktor pertama adalah variasi

BAB III METODE PENELITIAN. Pendidikan Biologi FPMIPA UPI dan protease Bacillus pumilus yang diperoleh

I. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2014 sampai dengan bulan Juni

BAB III METODE PENELITIAN. adalah variasi jenis kapang yaitu Penicillium sp. dan Trichoderma sp. dan

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN. Enzim α-amilase dari Bacillus Subtilis ITBCCB148 diperoleh dengan

METODE PENELITIAN. Penelitian ini di laksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi

III. METODE KERJA. Penelitian ini telah dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

BAB III METODE PENELITIAN. Rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan penelitian deskriptif

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai

III METODELOGI PENELITIAN. Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Februari sampai Juni 2014 bertempat di

III. METEDOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini telah dilaksanakan dari bulan Maret sampai bulan Nopember 2013

METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Oktober sampai Februari 2014, dengan

Sampel air panas. Pengenceran 10-1

BAB III METODE PENELITIAN

III. METODE PERCOBAAN. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai April 2014 di

III. BAHAN DAN METODE

3 Metode Penelitian Alat

Air Panas. Isolat Murni Bakteri. Isolat Bakteri Selulolitik. Isolat Terpilih Bakteri Selulolitik. Kuantitatif

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN. Pada penelitian ini isolat actinomycetes yang digunakan adalah ANL 4,

BAB III METODE PENELITIAN. terdiri atas 5 perlakuan dengan 3 ulangan yang terdiri dari:

BABm METODA PENELITIAN

III. METODELOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei sampai Agustus 2013 di Laboratorium

BAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan berdasarkan bagan alir yang ditunjukkan pada gambar 3.1

APPENDIKS A PROSEDUR KERJA DAN ANALISA

BAHAN DAN METODE. Bahan dan Alat

BAB III METODE PENELITIAN. dengan mengadakan manipulasi terhadap objek penelitian serta adanya kontrol

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Waktu pelaksanaan penelitian pada bulan Juni 2013.

DAFTAR LAMPIRAN. Lampiran 1. Alur Kerja Subkultur Bakteri Penghasil Biosurfaktan dari Laut dalam Mendegradasi Glifosat

BAB III METODE PENELITIAN. yaitu jenis isolat dan sumber fosfat yang digunakan. selama 3 bulan mulai tanggal 1 Februari 31 April 2017.

III. METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari sampai dengan Desember di Laboratorium Biomasa Universitas Lampung.

ANALISIS PROTEIN. Free Powerpoint Templates. Analisis Zat Gizi Teti Estiasih Page 1

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Bahan Pertumbuhan dan Peremajaan Isolat Pengamatan Morfologi Isolat B. thuringiensis

III. METODE PENELITIAN. Penelitian dilaksanakan pada Desember 2014 Mei 2015 di. Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Universitas Lampung.

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN. Pada penelitian ini digunakan berbagai jenis alat antara lain berbagai

Lampiran 1 Prosedur uji aktivitas protease (Walter 1984, modifikasi)

III. METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini telah dilaksanakan dari bulan April 2012 sampai dengan bulan

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Pelaksanaan penelitian ini dilakukan pada bulan Juni 2013 dan

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. waterbath, set alat sentrifugase, set alat Kjedalh, AAS, oven dan autoklap, ph

1 atm selama 15 menit

BAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi

BAB III METODE PENELITIAN. mengujikan kemampuan Bacillus mycoides dalam memfermentasi onggok untuk

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Dalam pembuatan dan analisis kualitas keju cottage digunakan peralatan

III. METODOLOGI PENELITIAN

LAMPIRAN. Lampiran 1. Tahapan Penelitian. Kultur Stok S. thermopillus, L. bulgaricus, dan B. bifidum. MRS agar miring

DEPARTEMEN BIOLOGI FMIPA USU LAMPIRAN

MATERI DAN METODE. Pekanbaru. Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Mei sampai September

BAB III MATERI DAN METODE. Penelitian tentang Sintesis Protein Mikroba dan Aktivitas Selulolitik Akibat

BAB III METODE PENELITIAN. yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan

Lampiran 1. Analisis Kadar Pati Dengan Metode Luff Schroll (AOAC, 1995)

MATERI DAN METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Juli sampai bulan November 2009

II. MATERI DAN METODE PENELITIAN. 1. Materi Penelitian, Lokasi dan Waktu Penelitian

Lampiran 1. Diagram Alur Penelitian. Persiapan Penyediaan dan Pembuatan Inokulum Bacillus licheniiformis dan Saccharomyces.

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat

LAMPIRAN. Ekstraksi dengan 25 ml etil asetat digojog 10 menit dalam corong pemisah. Etil asetat dipisahkan

ISOLASI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM α AMILASE DARI Aspergillus niger DENGAN MENGGUNAKAN MEDIA CAMPURAN ONGGOK DAN DEDAK

BAB 1 PENDAHULUAN. 1.1 Latar Belakang

II. MATERI DAN METODE PENELITIAN. 1. Materi Penelitian, Lokasi dan Waktu Penelitian

BAB III BAHAN DAN METODE

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA BAB III METODE PENELITIAN. Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga.

Transkripsi:

1 I. METODOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April - Juli 2012 di Laboratorium Biokimia, Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung. B. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas, jarum ose, pembakar spiritus, pipet Ependroff, pengaduk magnet, ph Universal, sentrifuga, autoklaf, lemari pendingin, shaker incubator (orbit environ shaker), cold plate, waterbath, laminar air flow, dan spektrofotometer UV-Vis. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain malt extract, pepton, yeast extract, larutan kasein, susu skim, air laut steril, akuades, alkohol, kantung selofan, glukosa, Na 2 CO 3, NaOH,TCA, (NH 4 ) 2 SO 4, reagen folin ciocelteau, Na/K tartarat, NaCl, NaH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, BSA (Bovine Serum Albumin), gliserol dan sorbitol. Bakteri penghasil enzim protease yang digunakan yaitu Actinomycetes ANL4 2b-3. C. Prosedur Penelitian 1. Pembuatan Media dan Larutan Pereaksi a. Pembuatan Media Pertumbuhan dan Peremajaan Actinomycetes

2 1). Media ISP-2 (International Streptomyces Project) untuk Peremajaan Actinomycetes ANL4 2b-3 Media ISP-2 terdiri dari 4 gram yeast ekstract, 10 gram malt extract, 4 gram dextrose, dan 24 gram agar dilarutkan dalam 1L air laut steril lalu disterilisasi selama 15 menit 121 o C, 1 atm. Setelah media sedikit dingin ditambahkan sikloheksamida 25µg/mL dan nalidixic acid 25µg/mL (Margavey, et al., 2004). 2). Pembuatan Media Inokulum dan Fermentasi untuk Produksi Enzim Media cair dibuat dengan komposisi yeast extract 0,5%, glukosa 0,1%, susu skim 0,5%, 1% NaCl 0,5 M dilarutkan dalam 100 ml akuades, kemudian disterilisasi selama 15 menit pada suhu 121 C dan tekanan 2 atm. b. Pembuatan Pereaksi Untuk Pengukuran aktivitas Protease Metode Kunitz 1). Buffer Phospat ph 7 Stok A : 0,2 M NaH 2 PO 4 (15,601 g NaH 2 PO 4.2H 2 O dilarutkan dalam labu ukur 1L dengan akuades. Sok B : 0,2 M Na 2 HPO 4 (17,799 g NaH 2 PO 4.2H 2 O dilarutkan dalam labu ukur 1L akuades. Buffer phospat ph 7 dibuat dengan mencampurkan 38,9 ml stok A dan 61,1 ml stok B. 2). Larutan Kasein 1 gram larutan kasein dilarutkan dalam labu ukur 100 ml dengan buffer phospat ph 7 pada penangas air (80-90 o C) ph akhir 7,2. 3). Larutan Asam Trikloroasetat

3 5 gram TCA dilarutkan dalam labu ukur 100 ml lalu diencerkan dengan akuades hingga garis batas. 4). Larutan Standar Tirosin Larutan standar tirosin dibuat dengan kadar 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120 ppm. c. Pembuatan Pereaksi Untuk Pengukuran kadar protein Metode Lowry Pereaksi A : 2 gram Na 2 CO 3 dilarutkan dalam 100 ml NaOH 0,1 N. Pereaksi B : 5 ml larutan CuSO 4.5H 2 O 1% ditambahkan ke dalam 5 ml larutan Na(K) tartarat 1%. Peraksi C : 2 ml pereaksi B ditambahkan 100 ml pereaksi A. Pereaksi D : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1 : 1. Larutan standar : larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 ppm. 2. Penyiapan Inokulum Isolat bakteri yang telah ditumbuhkan pada media ISP-2 diinokulasikan kedalam erlenmeyer yang berisi IL media yang mengandung yeast extract 0,5%, glukosa

4 0,1%, susu skim 0,5%, 1% NaCl 0,5 M, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C, ph 7.0 dan waktu inkubasi 120 jam. Biakan ini disebut starter atau inokulum. 3. Isolasi dan Pemurnian Enzim Media yang digunakan untuk isolasi enzim sama dengan media pada penyiapan inokulum, media tersebut disterilisasi selama 15 menit 121 o C, 1 atm. Selanjutnya biakan actinomycetes diinokulasikan dan diinkubasi pada suhu 37 o C, ph 7.0 dan waktu inkubasi 120 jam. Untuk memisahkan larutan enzim dari konstituen seluler lainnya dilakukan sentrifugasi pada 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat yang diperoleh disebut ekstrak kasar enzim, terhadap ekstrak kasar enzim tersebut dilakukan penentuan kadar protein dengan metode Lowry dan uji aktivitas enzim menggunakan metode Kunitz. a. Pengendapan dengan amonium sulfat [(NH 4 ) 2 SO 4 ] Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam amonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu (0-15)%; (15-30)%; (30-45)%; (45-60); (60-75)% ; dan ( 75-90)%. Skema proses pengendapan protein enzim dengan penambahan amonium sulfat ditunjukkan pada Gambar 6. Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan garam amonium sulfat secara perlahan sambil diaduk dengan magnetic stirrer. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan amonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan yang diperoleh dilarutkan dengan buffer phosfat 0,1 M ph 7,0

5 dan diuji aktivitasnya dengan metode Kunitz, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry. Selanjutnya, filtrat yang didapat dari fraksi 0-15% digunakan untuk diendapkan kembali dengan fraksi kejenuhan 15-30% dengan prosedur yang sama (Kazan et al., 1997). Gambar 6. Skema pengendapan protein enzim dengan amonium sulfat b. Dialisis Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi amonium sulfat dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantung selofan dan didialisis dengan buffer posphat 0,01 M ph 7 selama 24 jam pada suhu dingin (Pohl, 1990).

6 Selama dialisis, dilakukan pergantian buffer selama 4-6 jam agar konsentrasi ionion di dalam kantung dialisis dapat dikurangi. Proses ini dilakukan secara terus menerus sampai ion-ion di dalam kantung dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantung, maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH) 2 atau BaCl 2, bila masih ada ion sulfat dalam kantung, maka akan terbentuk endapan putih BaSO 4. Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantung. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Kunitz, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry. 4. Pembuatan Campuran Enzim dan Senyawa Aditif Campuran enzim dan senyawa aditif dibuat dengan menambahkan senyawa aditif (gliserol dan sorbitol) ke dalam larutan enzim dengan perbandingan 1:1. Konsentrasi senyawa aditif yang digunakan yaitu masing-masing 0,5M, 1M dan 1,5M baik untuk gliserol maupun sorbitol. 5. Karakterisasi Enzim Sebelum dan Setelah Penambahan Senyawa Aditif a. Penentuan ph Optimum Enzim Protease Untuk mengetahui ph optimum dari campuran masing-masing enzim dan senyawa aditif (gliserol dan sorbitol) dilakukan pengukuran aktivitas enzim menggunakan metode Kunitz dengan variasi ph yang digunakan yaitu 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5 dan 9. b. Penentuan Suhu Optimum Enzim Protease

7 Untuk mengetahui suhu optimum dari campuran masing-masing enzim dan senyawa aditif (gliserol dan sorbitol) dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode Kunitz dengan variasi temperatur yang digunakan adalah 45, 50, 55, 60, 65, 70 dan 75 o C. c. Penentuan Waktu Inkubasi Maksimum Untuk mengetahui waktu inkubasi optimum dari campuran msing-masing enzim dan senyawa aditif (gliserol dan sorbitol), dilakukan pengukuran aktivitas enzim menggunakan metode Kunitz dengan variasi waktu inkubasi 50, 55, 60, 65, 70, 75 dan 80 menit. d. Uji stabilitas enzim Penentuan stabilitas enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama suhu dan ph tertentu (suhu dan ph optimum). Caranya yaitu dengan mengukur aktivitas enzim setelah proses pemanasan selama waktu tertentu sesuai dengan pengukuran aktivitas enzim. Aktivitas awal enzim (tanpa perlakuan) di beri nilai 100% (Virdianingsih et al., 2002) Aktivitas sisa = ( ) x 100% 6. Uji Aktivitas Protease dan Penentuan Kadar Protein

8 Uji aktivitas protease dilakukan pada tiap tahap isolasi, tiap tahap pemurnian dan pada saat karakterisasi enzim hasil isolasi dan pemurnian. Penentuan kadar protein dilakukan pada tiap tahap isolasi dan pada tiap tahap pemurnian. a. Pengujian Aktivitas Protease Metode Kunitz Analisis aktivitas dilakukan menurut metode Kunitz menggunakan substrat kasein (Soedigdo, 1998). Pengukuran didasarkan pada jumlah peptida yang terlarut dalam TCA (asam trikloroasetat). Prosedur pengujian adalah sebagai berikut : 1 ml larutan kasein dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah 1 ml larutan enzim. Kemudian diinkubasi pada 35 o C selama 30 menit. Setelah 30 menit, tabung reaksi dikeluarkan lalu ditambah 3 ml larutan TCA, larutan diaduk dan didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar agar pengendapan sempurna. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi. Absorbsi filtrat diukur pada panjang gelombang 280 nm. Pada pengujian aktivitas untuk uji stabilitas termal, 1mL kasein dan 1mL larutan enzim diinkubasi pada suhu 50 o C selama 60 menit yang merupakan suhu dan waktu inkubasi optimum yang diperoleh pada karakterisasi enzim protease. Kontrol dibuat dengan menambahkan larutan TCA sebelum enzim lalu diinkubasi. Aktivitas enzim dihitung berdasarkan jumlah asam amino (peptida sederhana) yang terbentuk dengan menggunakan kurva standar tirosin. Aktivitas 1 unit tirosin ditetapkan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menguraikan 1µmol tirosin dari kasein di dalam 1 ml volume reaksi per menit. b. Penentuan kadar protein Metode Lowry

9 Kadar protein enzim ditentukan dengan metode Lowry (Lowry et al., 1951). Penentuan kadar protein ini bertujuan untuk mengukur aktivitas spesifik dari protein enzim protease. Sebanyak 0,1 ml enzim protease ditambahkan 0,9 ml akuades lalu direaksikan dengan 5 ml pereaksi C dan diaduk rata kemudian dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5 ml pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk kontrol, 0,1 ml enzim diganti dengan 0,1 ml akuades, selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel. Serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm. Untuk menentukan konsentrasi protein enzim yang digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin). Penentuan kadar protein enzim protease dengan menggunakan metode Lowry ini dilakukan pada tahap isolasi dan pada tiap tahap pemurnian.