BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. HASIL AMPLIFIKASI DAERAH ITS DENGAN METODE PCR. Pengukuran kualitas dan kuantitas DNA dilakukan menggunakan

37 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. HASIL AMPLIFIKASI DAERAH ITS DENGAN METODE PCR Pengukuran kualitas dan kuantitas DNA dilakukan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kualitas dan kuantitas cetakan DNA (template) merupakan faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi fragmen DNA dengan metode PCR (Palumbi 1996: 206--207). Kualitas DNA yang baik memiliki rasio absorbansi 260/280 nm sebesar 1,8--2,0 (1,8 A 260 /A 280 2,0) (Seidman & Moore 2000: 419--423). Hasil pengukuran kualitas dan kuantitas DNA dari 12 isolat dapat dilihat pada Tabel 1. Hasil pengukuran kualitas DNA menunjukkan bahwa dua isolat (W1114 dan W322) memiliki kualitas DNA yang baik karena memiliki nilai rasio absorbansi 260/280 nm sebesar 1,8--2,0, sedangkan sepuluh isolat lainnya memiliki nilai rasio absorbansi < 1,8 atau > 2,0. Menurut Sambrook dan Russell (2001: 4.72), kualitas DNA cetakan yang baik tidak menjadi syarat mutlak dalam proses PCR. Hasil elektroforesis (Gambar 3--4) memperlihatkan pemendaran pita-pita DNA tunggal (single band) yang jelas dari seluruh isolat. Pita-pita DNA tunggal (single band) tersebut adalah fragmen daerah ITS yang teramplifikasi dengan metode PCR. Hasil

38 elektroforesis menunjukkan bahwa amplifikasi daerah ITS berhasil dilakukan dengan kualitas cetakan DNA yang bervariasi. Hasil pengukuran kuantitas DNA memperlihatkan bahwa 12 isolat khamir memiliki konsentrasi DNA yang bervariasi (93,5--246,5 µg/ml). Menurut Sambrook dan Russell (2001: 8.6), konsentrasi DNA khamir yang dapat digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR minimal adalah 10 ng/ml. Hasil pengukuran kuantitas DNA menunjukkan bahwa konsentrasi DNA yang diperoleh sangat memadai untuk digunakan dalam proses PCR. Hasil elektroforesis (Gambar 3--4) memperlihatkan pemendaran pita-pita DNA tunggal (single band) yang jelas dari seluruh isolat. Hasil elektroforesis (Gambar 3--4, Tabel 2) memperlihatkan panjang fragmen daerah ITS yang bervariasi dari seluruh isolat yaitu 400--700 pb. Menurut Fujita dkk. (2001: 3619) panjang fragmen daerah ITS pada khamir adalah 300--900 pb. Isolat W1114 memiliki ukuran 400--500 pb, isolat W144 dan W3324 memiliki ukuran 600--700 pb, sedangkan sembilan isolat lainnya (W1126, W127, W314, W322, W324, W325, W3329, W3338 dan W3351) memiliki ukuran 500--600 pb. Perbedaan panjang fragmen tersebut menunjukkan adanya polimorfisme daerah ITS. Polimorfisme ukuran fragmen daerah ITS dari 12 isolat tersebut mengindikasikan adanya keanekaragaman genetik yang dapat mengindikasikan keanekaragaman spesies. Hal tersebut dapat dibuktikan dengan melakukan sequencing pada fragmen daerah ITS. Fujita dkk. (2001:

39 3618) melaporkan bahwa spesies khamir yang berbeda umumnya memiiliki panjang fragmen ITS yang berbeda. Sebagai contoh ditunjukkan oleh spesies yang berbeda dari genus candida yaitu C. famata (633 pb), C. kefyr (722 pb), C. lipolytica (359 pb), C. utilis (554 pb), dan C. rugosa (418 pb). Spesiesspesies tersebut memiliki tingkat homologi sequence yang rendah ( 98%). B. IDENTIFIKASI ISOLAT-ISOLAT KHAMIR DARI CAGAR ALAM PULAU RAMBUT Identifikasi dilakukan dengan pencarian homologi sequence daerah ITS menggunakan program BLASTn pada database DNA GenBank (situs http:// www.ncbi.nlm. nih.gov). Hasil pencarian homologi sequence dari isolat dapat dilihat pada Gambar 5--16. Menurut Sugita dkk. (1999: 1990), isolat yang memiliki homologi sequence daerah ITS 99% dengan spesies terdekatnya merupakan spesies yang sama, sedangkan isolat yang memiliki homologi sequence daerah ITS < 99% dengan spesies terdekatnya merupakan spesies yang berbeda. Hasil analisis sequence daerah ITS menunjukkan bahwa 12 isolat dari Cagar Alam Pulau Rambut terdiri atas sepuluh spesies yang termasuk dalam empat genus. Data sequence daerah ITS dapat mendeteksi empat spesies baru, yang termasuk dalam dua genus. Tiga spesies baru tersebut termasuk dalam genus Candida yaitu Candida sp. 1 (isolat W1114), Candida sp. 2 (isolat W144) dan Candida sp.3 (isolat W127), sedangkan satu spesies

40 termasuk dalam genus Debaryomyces yaitu Debaryomyces sp. (isolat W3324). Pengamatan morfologi reproduksi seksual dilakukan untuk menambah informasi dari hasil identifikasi molekular. Satu individu khamir dapat memiliki nama genus yang berbeda tergantung pada fase reproduksi yang terlihat pada saat pengamatan morfologi (Yarrow 1998: 84). Berdasarkan hasil identifikasi menggunakan daerah ITS dan data pengamatan morfologi reproduksi, 12 isolat khamir yang diidentifikasi terdiri dari genus anamorfik dan teleomorfik. Tiga genus termasuk genus anamorfik, yaitu Candida, Rhodotorula, dan Trichosporon, sedangkan satu genus termasuk genus teleomorfik yaitu Debaryomyces (Tabel 3). Seluruh isolat khamir yang diteliti tersebar dalam filum Ascomycota dan Basidiomycota. Spesies-spesies khamir yang berhasil diidentifikasi merupakan spesies khamir yang umum terdapat di habitat perairan laut dan mangrove, contohnya R. minuta, R. mucilaginosa, D. hansenii dan anggota genus Candida. Analisis sequence daerah ITS terbukti dapat digunakan untuk mengidentifikasi hingga tingkat spesies pada seluruh isolat dalam penelitian (Tabel 3). Keanekaragaman spesies yang tinggi pada dua belas isolat penelitian ditunjukkan oleh adanya sepuluh spesies yang berbeda dan empat di antaranya adalah spesies baru.

41 1. Isolat-isolat dari perairan mangrove Isolat-isolat yang berasal dari perairan mangrove adalah W1114, W144, W1126 dan W127. Elektroferogram hasil sequencing isolat-isolat tersebut dapat dilihat pada Lampiran 3--6. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa empat isolat tersebut termasuk dalam genus Candida (Tabel 3). Berdasarkan taksonomi, genus Candida termasuk dalam famili Candidaceae, ordo Saccharomycetales, kelas Hemiascomycetes, dan filum Ascomycota (Meyer dkk. 1998: 454). Hasil identifikasi dan deskripsi morfologi empat isolat tersebut adalah sebagai berikut. a. Candida Berkhout sp. (1). Sjamsuridzal (2004:122) melaporkan bahwa isolat W1114 memiliki homologi sequence daerah D1/D2 LSU sebesar 90% dengan Metschnikowia sp. Lachance sebagai spesies terdekatnya sehingga diperkirakan sebagai spesies baru yang berbeda dari Metschnikowia sp. Oleh karena itu, perlu dilakukan identifikasi menggunakan daerah ITS untuk memperjelas identitasnya sebagai spesies baru. Berdasarkan identifikasi menggunakan daerah ITS, isolat W1114 memiliki homologi sequence sebesar 82% dengan spesies terdekatnya yaitu Candida akabanensis Nakase dkk (EU100744) (Tabel 2). Terdapat 47

42 perbedaan nukleotida antara sequence daerah ITS isolat W1114 dan Candida akabanensis (EU100744). Panjang sequence ITS isolat W1114 yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 491 pb (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS Candida akabanensis (EU100744) pada database adalah 403 pb. Berdasarkan data tersebut, tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W1114 dan sequence ITS Candida akabanensis (EU100744) diperoleh dari homologi keseluruhan sequence daerah ITS. Berdasarkan hasil homologi sequence daerah ITS tersebut, isolat W1114 merupakan spesies baru yang berbeda dari spesies Candida akabanensis. Oleh karena itu, isolat W1114 diberi identitas sebagai Candida sp. 1 (Tabel 3). Hasil pengamatan morfologi makroskopik pada medium padat YMA dan MEA 5% menunjukkan koloni khamir yang berwarna putih, tekstur koloni seperti mentega, permukaan koloni halus dan mengilap, tepi koloni halus dan menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Candida akabanensis memiliki koloni khamir berwarna putih atau krem dengan tekstur seperti mentega (Barnett dkk. 2000: 129). Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair YMB dan MEB 5% memperlihatkan adanya endapan (Gambar 18--19, Tabel 4). Hasil pengamatan mikroskopik pada medium YMB yang diinkubasi selama 48 jam memperlihatkan sel vegetatif dengan bentuk semi bulat dan bulat dengan

43 ukuran (3,5--5,5) x(3--5) µm 2 pada medium YMB dan (3--6)x(2--5) µm 2 pada medium MEB 5% dan tipe pertunasan multipolar (Gambar 20, Tabel 7--8). Hasil pengamatan metode slide culture pada medium CMA yang diinkubasi selama tujuh hari tidak menunjukkan adanya miselium palsu maupun sejati (Gambar 20, Tabel 7--8). Hasil pengamatan tersebut berbeda dengan deskripsi C. akabanensis. Menurut Barnett dkk. (2000: 129), Candida akabanensis memiliki miselium palsu. Candida akabanensis pernah dilaporkan diisolasi dari insekta (Barnett dkk. 2000:129). Spesies tersebut belum pernah dilaporkan diisolasi dari perairan. Metschnikowia termasuk nama genus teleomorfik khamir, dengan nama genus anamorfik adalah Candida. Hasil pengamatan morfologi fase reproduksi mendukung hasil identifikasi molekular berdasarkan daerah ITS, bahwa isolat W1114 merupakan anggota Candida karena tidak ditemukan adanya reproduksi seksual berupa askospora. Masih diperlukan tambahan informasi mengenai karakter fisiologi untuk melengkapi deskripsi isolat W1114 sebagai spesies baru. b. Candida Berkhout sp. (2). Menurut Sjamsuridzal (2004: 122), isolat W144 memiliki tingkat homologi sequence daerah D1/D2 LSU sebesar 95% dengan spesies terdekatnya yaitu Candida atmosphaerica Santa Maria sehingga diperkirakan sebagai spesies baru yang berbeda dari C. atmosphaerica. Oleh karena itu,

44 perlu dilakukan identifikasi menggunakan daerah ITS untuk memperjelas identitasnya sebagai spesies baru. Berdasarkan identifikasi menggunakan daerah ITS, isolat W144 memiliki tingkat homologi sebesar 97% dengan spesies terdekatnya yaitu Candida atlantica (Siepmann) S.A. Meyer & Simione (AJ539368) (Tabel 2). Hasil BLAST juga menunjukkan bahwa isolat W144 memiliki homologi sequence ITS sebesar 95% dengan Candida atmosphaerica. Namun demikian, homologi sequence ITS antara isolat W144 dan C. atlantica lebih tinggi daripada homologi antara isolat W144 dan C. atmosphaerica. Terdapat sepuluh perbedaan nukleotida antara sequence daerah ITS isolat W144 dan C. atlantica (AJ539368). Panjang sequence ITS yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 649 pb (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS C. atlantica (AJ539368) pada database adalah 596 pb. Berdasarkan data tersebut, tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W144 dan C. atlantica (AJ539368) diperoleh dari homologi keseluruhan sequence daerah ITS. Berdasarkan hasil homologi sequence daerah ITS tersebut, isolat W144 merupakan spesies baru yang berbeda dari C. atmosphaerica maupun C. atlantica (Tabel 3). Hasil pengamatan morfologi makroskopik pada medium padat YMA dan MEA 5% memperlihatkan koloni khamir yang berwarna putih dengan tekstur seperti mentega, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus dan elevasi menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan

45 makroskopik juga dilakukan pada medium cair YMB dan MEB 5% yang memperlihatkan adanya endapan (Gambar 18--19, Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada medium YMB pada usia 48 jam, dengan hasil sebagai berikut: sel vegetatif berbentuk bulat, semi bulat, oval, seperti buah lemon, dan elips dengan ukuran (3,5--7)x(2--4) µm 2 pada medium YMB dan (4--10)x(3--10) µm 2 pada medium MEB, dan pertunasan multipolar (Gambar 20, Tabel 7--8). Hasil pengamatan metode slide culture pada medium CMA yang diinkubasi selama tujuh hari tidak menunjukkan adanya miselium palsu maupun sejati (Gambar 20, Tabel 7--8). Menurut Barnett dkk. (2000: 138-- 139), C. atmosphaerica dan C. atlantica memiliki deskripsi morfologi yang hampir sama, antara lain adalah warna koloni putih atau krem, tekstur seperti mentega, memiliki miselium palsu dan tidak ditemukan adanya reproduksi seksual. Deskripsi morfologi isolat W144 sesuai dengan deskripsi C. atlantica maupun C. atmosphaerica kecuali bahwa kedua spesies tersebut membentuk miselium palsu, sedangkan isolat W144 tidak memiliki miselium palsu (Barnett dkk. 2000: 138 & 139). Candida atlantica diketahui pernah diisolasi dari perairan laut, sedangkan C. atmosphaerica diketahui pernah diisolasi dari atmosfer (Meyer dkk. 1998: 483). Hasil pengamatan morfologi fase reproduksi mendukung hasil identifikasi molekular berdasarkan daerah ITS, bahwa isolat W144 merupakan anggota genus Candida karena tidak ditemukan adanya

46 reproduksi seksual berupa askospora. Masih diperlukan tambahan informasi mengenai karakter fisiologi untuk melengkapi deskripsi isolat W144 sebagai spesies baru. c. Candida Berkhout sp. (3). Sjamsuridzal (2004: 122) melaporkan bahwa isolat W127 memiliki tingkat homologi D1/D2 LSU sebesar 98% dengan Candida sp. sebagai spesies terdekatnya sehingga diperkirakan sebagai spesies baru yang berbeda. Oleh karena itu perlu dilakukan identifikasi menggunakan daerah ITS untuk memperjelas identitasnya sebagai spesies baru yang berbeda. Berdasarkan hasil identifikasi menggunakan daerah ITS isolat W127 memiliki tingkat homologi sequence sebesar 98% dengan C. orthopsilosis (AY391846) (Tabel 2). Berdasarkan hasil homologi sequence daerah ITS tersebut, isolat W127 merupakan spesies baru yang berbeda dari spesies Candida orthopsilosis (Tabel 3). Panjang sequence ITS isolat W127 yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 505 pb (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS C. orthopsilosis (AY391846) pada database adalah 524 pb. Adapun, hasil elektroforesis (Gambar 3, Tabel 2) menunjukkan bahwa panjang fragmen hasil amplifikasi daerah ITS dari isolat W127 adalah 500--600 pb. Homologi sequence daerah ITS yang lebih rendah dari 99% antara isolat W127 dan C. orthopsilosis (AY391846) disebabkan oleh data sequence yang belum lengkap. Tingkat homologi yang lebih akurat dapat

47 diperoleh berdasarkan analisis data sequence seluruh daerah ITS. Oleh karena itu, perlu dilakukan sequencing menggunakan primer ITS4 (reverse) untuk memperoleh data sequence daerah ITS yang lengkap dari isolat W127. Menurut Meyer dkk. (1998: 537), C. orthopsilosis memiliki deskripsi morfologi yang identik dengan C. parapsilosis. Pengamatan morfologi isolat W127 sesuai dengan C. Parapsilosis yang dideskripsikan oleh Meyer dkk. 1998. Hasil pengamatan morfologi isolat W127B adalah sebagai berikut. Hasil pengamatan morfologi makroskopik pada medium padat YMA dan MEA 5% adalah sebagai berikut: koloni khamir yang berwarna putih agak krem, dengan tekstur seperti mentega, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus dan elevasi menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan makroskopik juga dilakukan dengan medium cair YMB dan MEB 5% yang memperlihatkan adanya endapan (Gambar 18--19, Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada isolat yang telah diinkubasi selama 48 jam dalam medium YMB. Hasil pengamatan mikroskopik memperlihatkan sel vegetatif berbentuk bulat, semi bulat, dan oval dengan ukuran (3--6)x(2--5) µm 2 pada medium YMB dan (4--8)x(3--7) µm 2 pada medium MEB, dan tipe pertunasan multipolar. Berdasarkan pengamatan pada medium CMA dengan metode slide culture memperlihatkan adanya miselium palsu (Gambar 20, Tabel 7-- 8). Hasil pengamatan morfologi fase reproduksi mendukung hasil identifikasi

48 molekular isolat tersebut sebagai anggota genus Candida karena tidak ditemukan adanya reproduksi seksual berupa askospora. Tavanti dkk. (2005: 290) melaporkan bahwa C. orthopsilosis dan C. metapsilosis adalah dua spesies baru yang dibedakan dari C. parapsilosis berdasarkan analisis data sequence daerah ITS. Candida parapsilosis, C. orthopsilosis, dan C. metapsilosis diketahui pernah diisolasi dari kulit yang terinfeksi (Lin dkk. 1995: 1815). d. Candida fukuyamaensis Nakase dkk. Berdasarkan hasil identifikasi menggunakan daerah ITS isolat W1126 memiliki tingkat homologi sebesar 100% dengan C. fukuyamaensis (AM158923) (Tabel 2). Tingkat homologi sequence yang lebih besar dari 99% menunjukkan bahwa isolat W1126 adalah C. fukuyamaensis (Tabel 3). Panjang sequence ITS yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 603 pb (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS C. fukuyamaensis (AM158923) pada database adalah 596 pb. Berdasarkan data tersebut, tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W1126 dan C. fukuyamaensis (AM158923) diperoleh dari homologi keseluruhan sequence daerah ITS. Hasil pengamatan morfologi makroskopik pada medium padat YMA dan MEA 5% memperlihatkan koloni khamir yang berwarna putih agak krem, dengan tekstur seperti mentega, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus dan elevasi menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan

49 makroskopik juga dilakukan dengan medium cair YMB dan MEB 5% yang memperlihatkan adanya endapan (Gambar 18--19, Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada medium YMB setelah diinkubasi selama 48 jam, dengan hasil sebagai berikut: sel vegetatif berbentuk bulat, semi bulat dan elips dengan ukuran (2--5)x(1--4) µm 2, dan pertunasan multipolar. Berdasarkan pengamatan pada medium CMA dengan metode slide culture tidak ada miselium palsu yang terbentuk (Gambar 20, Tabel 7--8). Hasil pengamatan morfologi fase reproduksi mendukung hasil identifikasi molekular isolat tersebut sebagai anggota dari genus Candida karena tidak ditemukan adanya reproduksi seksual berupa askospora. Deskripsi morfologi isolat W1126 sesuai dengan C. guilliermondii (Castellani) Berkhout. Deskripsi morfologi C. fukuyamaensis identik dengan spesies C. guilliermondii. Bai dkk. (2000: 418) melaporkan bahwa kedua spesies tersebut hanya dapat dibedakan berdasarkan analisis sequence daerah ITS, karena sequence D1/D2 LSU kedua spesies tersebut identik. Menurut Nakase dkk. pada tahun 1995 (lihat Bai dkk. 2000: 416), C. fukuyamaensis pernah diisolasi dari air danau, buah, dan insekta. Namun demikian spesies tersebut belum pernah dilaporkan diisolasi pada perairan laut dan mangrove.

50 2. Isolat-isolat dari perairan laut Isolat-isolat yang berasal dari perairan laut adalah W314, W322, W324, W325, W3324, W3329, W3338 dan W3351. Isolat-isolat tersebut menunjukkan hasil data sequence yang baik karena seluruh basa dari fragmen daerah ITS dapat terbaca. Elektroferogram hasil sequencing isolatisolat tersebut dapat dilihat pada Lampiran 7--14. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa delapan isolat tersebut secara taksonomi tersebar dalam filum Ascomycota (W314, W3324 dan W3351) dan Basidiomycota (W322, W324, W325, W3329, dan W3338) (Tabel 3). Delapan isolat tersebut terdiri atas enam spesies berbeda yang termasuk dalam empat genus yaitu Candida, Debaryomyces, Rhodotorula, dan Trichosporon. Lima spesies yang diidentifikasi merupakan spesies yang sering dilaporkan diisolasi dari habitat perairan, kecuali T. dermatis yang umumnya diisolasi dari kulit yang terinfeksi. Hasil identifikasi dan deskripsi morfologi delapan isolat tersebut adalah sebagai berikut: a. Debaryomyces hansenii (Zopf) Lodder & Kreger-van Rij Hasil identifikasi menggunakan daerah ITS menunjukkan bahwa isolat W3351 memiliki homologi sequence sebesar 99% dengan D. hansenii (DQ249204) sebagai spesies terdekatnya (Tabel 2). Hal tersebut

51 menunjukkan bahwa isolat W3351 merupakan D. Hansenii. Panjang sequence ITS isolat W3351 yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 625 pb (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS D. hansenii (DQ249204) pada database adalah 573 pb. Berdasarkan data tersebut, tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W1126 dan D. hansenii (DQ249204) diperoleh dari homologi keseluruhan sequence daerah ITS. Hasil pengamatan morfologi makroskopik isolat W3351 pada medium padat YMA dan MEA 5% adalah sebagai berikut: koloni berwarna putih, tekstur koloni seperti mentega, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus dan menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair yang diinkubasi selama 48 jam dan satu bulan memperlihatkan adanya endapan serta pulau-pulau pada medium YMB serta endapan dan pelikel pada medium MEB 5% (Gambar 18--19, Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada medium cair YMB yang diinkubasi selama 48 jam serta pada medium CMA dengan metode slide culture menunjukkan hasil sebagai berikut: sel berbentuk bulat, semi bulat, oval dan menyerupai buah lemon dengan ukuran (4--8)x(3--8) µm 2 pada medium YMB dan (4--6)x(3--5) µm 2 pada medium MEB 5%, pertunasan multipolar dan tidak ditemukan adanya miselium palsu maupun miselium sejati (Gambar 20, Tabel 7--8).

52 Deskripsi morfologi makroskopik dan mikroskopik isolat W3351 sesuai dengan deskripsi morfologi D. hansenii yang dilaporkan oleh Barnett dkk. (2000: 177). Menurut Nakase dkk. (1998: 157), D. Hansenii secara taksonomi termasuk dalam famili Saccharomycetaceae, ordo Saccharomycetales, kelas Hemiascomycetes, dan filum Ascomycota. Debaryomyces merupakan salah satu nama genus teleomorfik khamir, akan tetapi pengamatan morfologi mikroskopik pada medium YMB dan MEB tidak memperlihatkan adanya reproduksi seksual isolat W3351. Hal tersebut mungkin disebabkan karena faktor lingkungan yang kurang mendukung. Menurut Kurtzman dkk. (2003: 76--77), beberapa genus teleomorfik memerlukan suhu dan medium tertentu untuk dapat melakukan reproduksi seksual. Oleh karena itu, masih perlu dilakukan pengamatan morfologi lebih lanjut menggunakan berbagai medium untuk menemukan reproduksi seksual dari isolat W3351 yang akan memperkuat identitasnya sebagai D. hansenii. Debaryomyces hansenii merupakan khamir dari Ascomycota yang paling sering ditemukan pada habitat perairan baik perairan darat maupun perairan laut (Spencer & Spencer 1997: 56). Menurut Hagler dan Mendonća- Hagler (1981: 177) spesies tersebut pernah diisolasi dari sedimen dasar laut. b. Debaryomyces Lodder & Kreger-van Rij sp. Hasil pencarian homologi sequence dengan BLASTn menunjukkan bahwa isolat W3324 memiliki homologi sequence daerah ITS sebesar 98% dengan D. hansenii (DQ249204) sebagai spesies terdekatnya. Tingkat

53 homologi yang rendah menunjukkan bahwa isolat W3324 adalah spesies baru yang berbeda dari D. Hansenii (Tabel 3). Terdapat perbedaan lima pasangan basa dan satu delesi antara sequence daerah ITS isolat W3324 dengan D. hansenii (DQ249204). Panjang sequence ITS yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 621 pb (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS Debaryomyces hansenii (DQ249204) pada database adalah 573 pb. Berdasarkan data tersebut, tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W1126 dan Debaryomyces hansenii (DQ249204) diperoleh dari homologi keseluruhan sequence daerah ITS. Hasil pengamatan morfologi makroskopik isolat W3324 pada medium padat YMA dan MEA 5% adalah sebagai berikut: koloni berwarna putih, tekstur koloni seperti mentega, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus dan menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair YMB dan MEB 5% memperlihatkan adanya endapan serta pelikel pada permukaan medium (Gambar 18--19, Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada medium cair YMB yang diinkubasi selama 48 jam serta pada medium CMA dengan metode slide culture menunjukkan hasil sebagai berikut: sel berbentuk bulat dan semi bulat dengan ukuran (3--5)x(3--5) µm 2 pada medium YMB dan (3--6)x(3--5) µm 2 pada medium MEB 5%, pertunasan multipolar dan tidak ditemukan adanya miselium palsu maupun miselium sejati (Gambar 20, Tabel 7--8). Deskripsi

54 morfologi tersebut sesuai dengan deskripsi morfologi genus Debaryomyces yang dideskripsikan oleh Nakase dkk. (1998: 157). Debaryomyces merupakan salah satu nama genus teleomorfik khamir akan tetapi pengamatan morfologi mikroskopik tidak memperlihatkan adanya reproduksi seksual pada isolat W3324. Hal tersebut mungkin disebabkan karena faktor lingkungan yang kurang mendukung. Menurut Kurtzman dkk. (2003: 76--77), beberapa genus teleomorfik memerlukan suhu dan medium tertentu untuk dapat membentuk spora seksual. Oleh karena itu, untuk melengkapi deskripsi isolat W3324 sebagai spesies baru diperlukan pengamatan lebih lanjut mengenai fase reproduksi serta tambahan informasi mengenai karakter fisiologi dan morfologi reproduksi. Deskripsi suatu spesies baru juga memerlukan data karakter molekular yang lengkap. Oleh karena itu, isolat W3324 yang diidentifikasi sebagai Debaryomyces sp. masih memerlukan data molekular berdasarkan daerah D1/D2 LSU gen rrna. c. Candida parapsilosis (Ashford) Langeron & Talice Hasil identifikasi menggunakan daerah ITS menunjukkan bahwa isolat W314 memiliki homologi sequence sebesar 100% dengan spesies terdekatnya yaitu C. parapsilosis (EF190230) (Tabel 2). Tingkat homologi sequence yang lebih besar dari 99% menunjukkan bahwa isolat W314 adalah C. parapsilosis (Tabel 3). Panjang sequence ITS yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 406 pb (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS C. parapsilosis (EF190230) pada

55 database adalah 388 pb. Berdasarkan data tersebut, tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W314 dan C. parapsilosis (EF190230) diperoleh dari homologi keseluruhan sequence daerah ITS. Hasil pengamatan morfologi makroskopik isolat W314 (white) pada medium padat YMA dan MEA 5% memperlihatkan koloni berwarna putih, tekstur koloni seperti mentega, permukaan halus dan kusam pada medium MEA 5% usia satu bulan, permukaan halus dan mengilat pada medium YMA, tepi koloni halus dan menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair yang diinkubasi selama 48 jam dan satu bulan memperlihatkan adanya endapan serta pulau-pulau pada medium YMB serta endapan dan pelikel pada medium MEB 5% (Gambar 18--19, Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada medium cair YMB yang diinkubasi selama 48 jam menunjukkan hasil sebagai berikut: sel berbentuk bulat, semi bulat, dan elips dengan ukuran (2--6)x(2--6) µm 2 pada medium YMB dan (4--6)x(3--5) µm 2 pada medium MEB 5%, pertunasan multipolar dan ditemukan adanya miselium palsu pada medium CMA dengan metode slide culture (Gambar 20, Tabel 7--8). Deskripsi morfologi isolat W314 sesuai dengan C. parapsilosis yang dideskripsikan oleh Meyer dkk. (1998: 537). Hasil pengamatan morfologi mikroskopik mendukung hasil identifikasi molekular isolat tersebut sebagai anggota genus Candida karena tidak ditemukan adanya reproduksi seksual berupa askospora. Candida merupakan genus anamorfik khamir yang secara taksonomi termasuk dalam

56 famili Candidaceae, kelas Hemiascomycetes, dan filum Ascomycota (Meyer dkk. 1998: 537). Patricia (2007: 44) melaporkan bahwa C. Parapsilosis pernah ditemukan di periaran laut Cagar Alam Pulau Rambut, Indonesia. Candida parapsilosis merupakan salah satu khamir penyebab infeksi pada manusia (Lin dkk. 1995: 1815). Keberadaan khamir patogen pada manusia di habitat perairan dapat dijadikan indikator adanya pencemaran lingkungan di habitat tersebut (Spencer & Spencer 1997: 56). d. Rhodotorula minuta (Saito) F.C Harrison Sjamsuridzal (2004: 122) melaporkan bahwa isolat W3329 memiliki tingkat homologi sequence daerah D1/D2 LSU sebesar 98% dengan R. minuta sebagai spesies terdekatnya sehingga diperkirakan sebagai spesies yang berbeda. Oleh karena itu, diperlukan identifikasi menggunakan daerah ITS untuk memperjelas identitas isolat tersebut sebagai spesies berbeda. Berdasarkan identifikasi mengunakan daerah ITS, isolat W3329 memiliki tingkat homologi sebesar 99% dengan spesies terdekatnya yaitu R. minuta (AF444620) (Tabel 2). Tingkat homologi sequence tersebut menunjukkan bahwa isolat W3329 adalah R. minuta (Tabel 3). Panjang sequence ITS isolat W3329 yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 588 pb (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS R. minuta (AF444620) pada database adalah 574 pb.

57 Berdasarkan data tersebut, tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W3329 dan R. minuta (AF444620) diperoleh dari homologi keseluruhan sequence daerah ITS. Hasil pengamatan morfologi makroskopik isolat W3329 dilakukan pada medium padat YMA dan MEA 5% yang berusia satu bulan adalah sebagai berikut: koloni berwarna peach-oranye dengan tekstur berlendir pada medium YMA usia satu bulan, koloni berwarna -oranye dengan tekstur seperti mentega pada medium MEA 5% usia satu bulan, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus dan menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair YMB dan MEB 5% yang diinkubasi selama 48 jam dan satu bulan memperlihatkan adanya endapan (Gambar 18--19, Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada medium cair YMB yang diinkubasi selama 48 jam serta pada medium CMA dengan metode slide culture menunjukkan hasil sebagai berikut: sel berbentuk bulat, semi bulat dan elips dengan ukuran (4--11)x(3--11)µm 2 pada medium YMB dan (4--7)x(3--6)µm 2 pada medium MEB 5%, pertunasan polar dan tidak ditemukan adanya miselium palsu (Gambar 20, Tabel 7--8). Deskripsi morfologi isolat tersebut sesuai dengan deskripsi R. minuta yang dilaporkan oleh Fell dan Statzell-Tallman (1998: 820). Hasil pengamatan morfologi mikroskopik mendukung hasil identifikasi molekular isolat W3329 sebagai anggota Rhodotorula karena tidak ditemukan

58 adanya reproduksi seksual. Genus Rhodotorula merupakan genus anamorfik khamir yang secara taksonomi termasuk dalam clade Erythrobasidium, kelas Urediniomycetes, dan filum Basidiomycota (Fell dkk. 2000: 1362). Rhodotorula minuta merupakan khamir yang sering diisolasi dari perairan laut (Spencer & Spencer (1997: 56). Patricia (2007: 49) melaporkan bahwa R. minuta pernah ditemukan pada perairan laut Cagar Alam Pulau Rambut, Indonesia. Menurut Kohlmeyer dan Kohlmeyer (1979: 556), R. minuta berasal dari habitat terestrial meskipun seringkali diisolasi dari habitat perairan. e. Rhodotorula mucilaginosa (Jorgensen) F.C. Harrison Berdasarkan hasil identifikasi menggunakan daerah ITS, isolat W322, W324 dan W325 memiliki homologi sequence yang tinggi dengan R. mucilaginosa. Tingkat homologi sequence ketiga isolat tersebut adalah sebagai berikut: isolat W322 memiliki homologi sequence sebesar 100% dengan R. mucilaginosa (AF444541), isolat W324 memiliki homologi sequence sebesar 99% dengan R. mucilaginosa (EF174517) dan isolat W325 memiliki homologi sequence sebesar 99% dengan R. mucilaginosa (AF444614) (Tabel 2). Tingkat homologi 99% menunjukkan bahwa isolat W322, W324 dan W325 merupakan R. mucilaginosa. Data sequence daerah ITS isolat W325 memiliki perbedaan dengan R. mucilaginosa (AF444614) sebanyak tiga nukleotida, dan isolat W324 hanya memiliki perbedaan dengan

59 R. mucilaginosa (EU177580) satu nukleotida saja. Adapun Isolat W322 memiliki sequence daerah ITS yang identik dengan R. mucilaginosa (AF444541). Panjang sequence ITS ketiga isolat tersebut yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 620 pb (isolat W322), 605 pb (isolat W324) dan 618 pb (isolat W325) (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS R. mucilaginosa pada database adalah 620 pb (Rhodotorula mucilaginosa AF444541 dan AF444614) dan 616 pb (R. mucilaginosa EF174517). Berdasarkan data tersebut, tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W322 dan R. mucilaginosa (AF444541)diperoleh dari homologi keseluruhan sequence daerah ITS. Tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W324 dan W325 dengan R. mucilaginosa (EF174517 dan AF444614) belum diperoleh dari homologi keseluruhan daerah ITS. Akan tetapi, dari tingkat homologi sequence ITS yang dihasilkan (99%), sudah dapat diketahui identitas kedua isolat tersebut sebagai R. mucilaginosa. Hasil pengamatan morfologi makroskopik isolat W322 pada medium padat YMA dan MEA 5% adalah sebagai berikut: koloni berwarna merahmuda oranye pada medium MEA 5% usia satu bulan dan berwarna oranye pada medium YMA usia satu bulan, tekstur koloni berlendir, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus dan menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair yang diinkubasi selama 48 jam dan satu bulan memperlihatkan adanya endapan (Gambar 18--19,

60 Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada medium cair YMB yang diinkubasi selama 48 jam serta pada medium CMA dengan metode slide culture menunjukkan hasil sebagai berikut: sel berbentuk bulat, semi bulat, dan oval dengan ukuran (3--6)x(3--5) µm 2 pada medium YMB dan (2--5)x(2-- 5) µm 2 pada medium MEB 5%, pertunasan multipolar dan tidak ditemukan adanya miselium palsu maupun miselium sejati (Gambar 20, Tabel 7--8). Hasil pengamatan morfologi makroskopik isolat W324 pada medium padat YMA dan MEA 5% adalah sebagai berikut: koloni berwarna oranye pada medium YMA dan MEA 5% usia satu bulan, tekstur koloni berlendir, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus dan menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair yang diinkubasi selama 48 jam dan satu bulan memperlihatkan adanya endapan, pulau-pulau, dan cincin tipis pada permukaan medium YMB dan memperlihatkan adanya endapan pada medium MEB 5% (Gambar 18--19, Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada medium cair YMB yang diinkubasi selama 48 jam serta pada medium CMA dengan metode slide culture menunjukkan hasil sebagai berikut: sel berbentuk bulat, semi bulat, dan elips dengan ukuran (4--6)x(3,5--5 ) µm 2 pada medium YMB dan (3,5-- 6)x(2,5--6) µm 2 pada medium MEB 5%, pertunasan polar dan tidak ditemukan adanya miselium palsu maupun miselium sejati (Gambar 20, Tabel 7--8).

61 Hasil pengamatan morfologi makroskopik isolat W325 pada medium padat YMA dan MEA 5% adalah sebagai berikut: koloni berwarna oranye pada medium MEA 5% dan oranye-merah bata pada medium YMA usia satu bulan, tekstur koloni berlendir, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus dan menggunung (Gambar 17, Tabel 5--6). Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair yang diinkubasi selama 48 jam dan satu bulan memperlihatkan adanya endapan (Gambar 18--19, Tabel 4). Pengamatan mikroskopik dilakukan pada medium cair YMB yang diinkubasi selama 48 jam serta pada medium CMA dengan metode slide culture menunjukkan hasil sebagai berikut: sel berbentuk bulat, semi bulat, oval dan elips dengan ukuran (4--6)x(3--5) µm 2 pada medium YMB dan (4--8)x(3--7,5) µm 2 pada medium MEB 5%, pertunasan polar dan tidak ditemukan adanya miselium palsu maupun miselium sejati (Gambar 20, Tabel 7--8). Deskripsi morfologi isolat W322, W324 dan W325 sesuai dengan R. mucilaginosa yang dideskripsikan oleh Fell dan Statzell-Tallman (1998: 821). Rhodotorula adalah salah satu nama genus anamorfik khamir. Hasil pengamatan morfologi mikroskopik mendukung hasil identifikasi molekular isolat tersebut sebagai anggota genus Rhodotorula karena tidak ditemukan adanya reproduksi seksual. Rhodotorula mucilaginosa secara taksonomi termasuk ke dalam clade Sporidiobolous, kelas Urediniomycetes, dan filum Basidiomycota (Fell dkk. 2000: 1362).

62 Rhodotorula mucilaginosa merupakan khamir yang umum diisolasi dari habitat perairan laut dan diperkirakan sebagai spesies pendatang (allochtonous) dari habitat terestrial (Nagahama 2006: 246--255). Patricia (2007: 51) melaporkan bahwa R. mucilaginosa pernah ditemukan di perairan laut Cagar Alam Pulau Rambut, Indonesia. f. Trichosporon dermatis Sugita, Takashima, Nakase & Shinoda. Hasil identifikasi menggunakan daerah ITS menunjukkan bahwa isolat W3338 (yellow) memiliki homologi sequence sebesar 100% dengan spesies terdekatnya yaitu T. dermatis (AY143557) (Tabel 2). Tingkat homologi sequence ITS yang lebih tinggi dari 99% menunjukkan bahwa isolat W3338 merupakan T. dermatis. Hasil identifikasi isolat W3338 menggunakan daerah ITS memperjelas hasil identifikasi sebelumnya yang dilakukan menggunakan daerah D1/D2 LSU oleh Sjamsuridzal (2004). Sjamsuridzal (2004: 122) melaporkan bahwa berdasarkan data sequence daerah D1/D2 LSU rdna, isolat W3338 (yellow) menunjukkan homologi sebesar 98% dengan spesies terdekatnya yaitu Trichosporon sp. Panjang sequence ITS yang dikirimkan untuk pencarian homologi dengan program BLAST adalah 528 pb (Tabel 2), sedangkan panjang sequence ITS Trichosporon dermatis (AY143557) pada database adalah 528 pb. Berdasarkan data tersebut, tingkat homologi yang dihasilkan antara sequence ITS isolat W314 dan C. parapsilosis (EF190230) diperoleh dari homologi keseluruhan sequence daerah ITS dan sequencenya identik.

63 Pertumbuhan isolat pada medium padat YMA dan MEA 5% memperlihatkan morfologi makroskopik koloni berwarna kuning dengan tekstur seperti mentega, permukaan halus dan mengilap, tepi koloni halus pada medium YMA usia satu bulan, serta berfilamen pada medium MEA 5% usia satu bulan, dan profil koloni menggunung (Gambar 5, Tabel 6--9). Morfologi makroskopik isolat dalam medium YMB dan MEB 5% yang diinkubasi dalam suhu ruang selama 48 jam dan satu bulan memperlihatkan adanya endapan dan cincin yang tipis (Gambar 6--7, Tabel 4--5). Morfologi mikroskopik isolat yang diinkubasi selama 48 jam memperlihatkan sel vegetatif yang berbentuk bulat, semi bulat dan elips, dengan ukuran (3,5-- 9)x(3--7) µm 2 pada medium MEB dan (3--6)x(2--6) µm 2 pada medium YMB; pertunasan multipolar; dan adanya miselium palsu (Gambar 8, Tabel 10--11). Pengamatan pada slide culture juga menunjukkan adanya arthrokonidia (Gambar 8). Deskripsi morfologi isolat W3338 sesuai dengan spesies T. dermatis yang dideskripsikan oleh Sugita dkk. (2001: 1224). Hasil pengamatan morfologi mikroskopik isolat W3338 memperlihatkan adanya miselium sejati dan arthrokonidia. Arthrokonidia adalah sel yang terbentuk dari miselium yang terfragmentasi dan merupakan ciri khas yang dimiliki oleh anggota genus tertentu, contohnya Trichosporon (Sugita dkk. 2001: 1226). Trichosporon dermatis adalah spesies baru dalam genus Trichosporon yang diidentifikasi berdasarkan hasil analisis sequence daerah ITS (Sugita dkk.

64 2001: 1224). Trichosporon dermatis secara taksonomi termasuk dalam famili Trichosporonaceae, ordo Trichosporonales, kelas Hymenomycetes, filum Basidiomycota (Fell dkk. 2000: 1362). Hasil identifikasi menggunakan analisis sequence daerah ITS pada 12 isolat khamir dari perairan mangrove dan laut Cagar Alam Pulau Rambut memperlihatkan keanekaragaman spesies yang tinggi. Hal tersebut ditunjukkan oleh adanya sepuluh spesies berbeda yang termasuk dalam empat genus. Selain itu, analisis data sequence daerah ITS juga mendeteksi adanya empat spesies baru dari sepuluh spesies tersebut. Empat spesies baru yang diidentifikasi termasuk dalam genus Candida dan Debaryomyces.