BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian observasional analitik dengan pendekatan cross-sectional. B. Lokasi Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. C. Subjek Penelitian Penelitian ini menggunakan data hasil pemeriksaan hitung sel T CD4+ deteksi RNA HCV dan data non-medis yang dimiliki grup riset A-IGIC. Sampel darah dan data non-medis berasal dari pasien HIV Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi di Surakarta dari bulan November 2011 hingga Febuari 2012. D. Teknik Sampling Teknik sampling yang digunakan dalam penelitian ini adalah total sampling, yaitu sampel yang digunakan adalah total populasi. 11
12 E. Rancangan Penelitian Pasien HIV Jenis kelamin dan usia Sampel Darah Deteksi RNA HCV Flow Cytometry Data Status RNA HCV Data Jumlah sel T CD4+ Analisis Data Keterangan: : Skripsi Gambar 2. Rancangan Penelitian F. Alat dan Bahan Pemeriksaan yang dilakukan sebelumnya oleh grup riset A-IGIC yaitu pemeriksaan hitung sel T CD4+ menggunakan immunophenotyping flow cytometry serta isolasi dan deteksi asam nukleat untuk mengetahui status RNA HCV. Alat dan bahan yang digunakan yaitu:
13 1. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: 1) BD FACSCalibur TM flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, California); 2) vortex (Thermo Fisher Scientific, Worcester, MA); 3) micropipette (P10, P200 dan P1000); 4) multiset software (Becton Dickinson Immunocytometry Systems); 5) centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Jerman); (Gilson, Middleton, WI); 6) thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Jerman); 7) class II safety cabinet (ESSCO, Portland, OR); 8) autoclave (Hirayama, Saitama, Jepang); 7) digital scale (Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland); 9) magnetic stirrer (Biomega, Redding, CA); 10) aparatus elektroforesis (chamber, comb, power supply) (BioRad, Loas Angeles, CA); 11) gel documententation (GelDoc XR) (BioRad, Loas Angeles, CA); 12) refrigerator (Sharp, Osaka, Jepang); 13) deep-freezer (New Brunswick Scientific, Edison, NJ); 14) gelas beker; 15) microtube rack. 2. Bahan Penelitian Bahan Penelitian yang digunakan meliputi: 1) sampel darah; 2) antibodi monoklonal Tritest TM CD3/CD4/CD45 Kit (BD Biosciences, San Jose, California); 3) tabung trucount (BD Biosciences, San Jose, California); 4) BD FACS lysing solution (BD Biosciences, San Jose, California); 5) Kit PureLink TM Viral RNA/DNA (Invitrogen, carlsbad, CA); 6) Kit SuperScript TM First-Strand Synthesis supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA); 7) Kit Platinum PCR SuperMix (Invitrogen, Carlsbad, CA); 8) Loading Quick λhind II digest, DNA-110 (Toyobo, Osaka, Japan); 9) Loading Quick φx174/hae III digest,
14 DNA-112 (Toyobo, Osaka, japan); 10) Filter tips RNase/DNase pyrogen free (10 µl, 200 µl, dan 1000 µl); 11) Buffer Tris-EDTA (TE) ph 8; 12) Etidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml; 13) Buffer Tris-acetate EDTA (TAE) 1 x (Promega, Madison, WI); 14) Primer oligonukleotida (primer forward dan primer backward); 15) Etanol 70% dan 90%; 16) Agarose gel; 17) microcentrifuge tube; 18) wash tube (2 ml); 19) recovery tube (1,5 ml); 20) PCR tube; 21) ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA); 22) glove steril; 23) masker; 24) tisu. G. Cara Kerja 1. Hitung sel T CD4+ a. Staining The Cells Masukkan sebanyak 20 µl antibodi monoklonal Tritest TM CD3/CD4/CD45 Kit (BD Biosciences) ke dalam tabung trucount, dengan pipet tidak menyentuh pellet. Selanjutnya, masukkan 50 µl sampel darah dengan teknik reverse pipetting, kemudian tutup tabung dan campur dengan cara di-vortex. Inkubasi selama 15 menit dalam ruang gelap pada suhu ruang. Berikutnya, masukkan 450 µl ke dalam tabung trucount, tutup tabung dan campur kembali dengan cara di-vortex. Inkubasi kembali selama 15 menit dalam ruang gelap pada suhu ruang. Selanjutnya sampel siap untuk dianalisis dengan flow cytometer atau simpan dalam ruang tertutup pada suhu ruang.
15 b. Flow Cytometry Vortex tabung dengan kecepatan rendah sebelum dianalisis pada flow cytometer. Kemudian letakkan tabung tepat di tengah treshold untuk meminimalisasi debris. Analisis data menggunakan multiset software. 2. Deteksi RNA HCV a. Isolasi Asam Nukleat Isolasi asam nukleat menggunakan kit PureLink Viral RNA/DNA (Invitrogen). Diawali dengan memasukkan 25 µl Proteinase K, 200 µl cellfree sample dan 200 µl Lysis Buffer ke dalam microcentrifuge tube, kemudian di-vortex selama 15 detik. Selanjutnya, inkubasi lisat pada suhu 56 C selama 15 menit. Lakukan sentrifugasi secara singkat agar lisat yang terdapat pada tutup dapat turun ke dasar microcentrifuge tube. Setelah itu, masukkan 250 µl 96% etanol ke dalam microcentrifuge tube dan di-vortex selama 15 detik. Dilanjutkan dengan inkubasi lisat selama 5 menit pada suhu ruang dan sentrifugasi secara singkat. Pindahkan lisat ke dalam Viral Spin Column dan sentifugasi kembali pada kecepatan 8500 rpm (sekitar 6800 x g) selama 1 menit. Kemudian buang collection tube beserta cairan di dalamnya ke klorin dan tempatkan spin column ke Wash Tube baru. Selanjutnya, cuci menggunakan Wash Buffer (W5) sebanyak 500 µl dan sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 6800 x g. Wash Tube beserta cairan dibuang kembali ke dalam larutan klorin dan tempatkan spin column ke Wash Tube baru. Kemudian, sentrifugasi pada kecepatan maksimal selama 1 menit. Setelah itu, buang Wash Tube beserta cairan di
16 dalamnya dan tempatkan spin column ke 1,5 ml Recovery Tube. Selanjutnya, dielusi dengan 50 µl Steril, RNase-free water (E3) dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruang. Kemudian lakukan sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan maksimal. Setelah selesai, RNA HCV akan berada dalam Recovery Tube sehingga spin column dapat dibuang. RNA HCV selanjutnya dapat disimpan pada suhu -80 C atau digunakan untuk proses berikutnya. b. Sintesis complementary DNA (cdna) Sintesis cdna menggunakan Kit SuperScriptTM First-Strand Synthesis Supermix. Pertama-tama, masukkan 6 µl sampel RNA dan 1 µl Anneling Buffer ke dalam PCR tube. Inkubasi PCR tube pada suhu 65 C selama 5 menit dengan menggunakan thermal cycler, kemudian dinginkan pada suhu 4 C selama 1 menit dan dilanjutkan dengan sentrifugasi secara singkat. Tahap berikutnya, tambahkan 10 µl 2X First-Strand Reaction Mix dan 2 µl SuperScript III/RNaseOUT TM Enzyme Mix ke dalam PCR tube. PCR tube di-vortex agar tercampur dan di sentrifugasi secara singkat. Kemudian inkubasi pada suhu 50 C selama 50 menit dan reaksi diakhiri dengan pendinginan pada suhu 85 C selama 5 menit. cdna yang dihasilkan selanjutnya dapat disimpan pada suhu -20 C atau digunakan untuk proses berikutnya.
17 c. PCR PCR cdna HCV menggunakan Kit Platinum PCR SuperMix dengan metode Nested PCR yang mengamplifikasi region NS5B. Pasangan primer yang digunakan adalah hep31b (5 -TGG GST TCT CDT ATG AYA CC-3 ; sense outer), hep32 (5 -GCD GAR TAC CTG GTC ATA GC-3 ; antisense outer), hep33b (5 -AYA CCC GMT GYT TTG ACT C-3 ; sense inner), dan hep34b (5 -CCT CCG TGA AKR CTC KCA G-3 ; antisense inner). Kode huruf standar yang digunakan sebagai alternative basa adalah D= A, G, atau T; K= G atau T; M= A atau C; R= A atau G; S= C atau G; dan Y= C atau T. PCR pada kedua tahap diawali dan diakhiri dengan proses denaturasi awal selama 2 menit pada suhu 94 C dan ekstensi akhir selama 10 menit dengan suhu 72 C. Amplifikasi dilakukan sebanyak 40 siklus pada kedua tahap yang terdiri dari 3 proses yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi. Pada tahap pertama, waktu dan temperatur inkubasi yang digunakan berturut-turut adalah 30 detik pada suhu 94 C, 30 detik pada suhu 55 C, 1 menit pada suhu 72 C. Pada tahap kedua waktu dan temperatur inkubasi yang digunakan berturut-turut adalah 30 detik pada suhu 94 C, 30 detik pada suhu 60 C, 1 menit pada suhu 72 C.
18 d. Elektroforesis Elektroforesis untuk analisis produk PCR menggunakan agarose gel 1,5% dalam larutan buffer TAE. Loading Quick λhind II digest, DNA- 110 dan Loading Quick φx174/hae III digest, DNA-112, masing-masing sebanyak 5 µl di masukkan ke sumur pertama dan kedua. Selanjutnya, sebanyak 2,5 µl produk PCR di masukkan ke sumur berikutnya. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100V selama 30 menit dan divisualisasikan menggunakan Gel Documentation. H. Analisis Data Data status koinfeksi HCV dan jumlah sel T CD4+ dianalisis menggunakan program Statistical Product and Service Solution (SPSS) 22. Hubungan antara rata-rata jumlah sel T CD4+ dengan status koinfeksi HCV pasien HIV diuji menggunakan uji Mann-Whitney. Data katagorikal jumlah sel T CD4+ dengan status koinfeksi HCV diuji dengan uji Chi-Square. Hubungan antara dua variabel yang diuji dinyatakan signifikan apabila didapatkan hasil p < 0,05. Besarnya hubungan diukur menggunakan Odds Ratio (OR).