IDENTIFIKASI GEN BABI PADA MARSHMALLOW MENGGUNAKAN KIT OLIPRO DALAM TEKNIK PCR DAN SOUTHERN HYBRIDIZATION PADA CHIP Hefi Kurnia Sari *, Marlina 1, Mutalib,S.A 2, Islami, S.N 1, Fitria,A 1 1. Fakultas Farmasi, Universitas Andalas,Limau Manis, Padang, Indonesia 25162. 2. Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia Bangi, Malaysia 43600 ABSTRAK Identifikasi gen babi pada (permen lunak) Marshmallow telah dilakukan dalam penelitian ini. DNA spesifik diamplifikasi menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Identifikasi kualitatif terhadap hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Metode Southern hybridization pada Chip digunakan untuk melihat hasil pendeteksian secara jelas. Dalam metode ini sejumlah Olipro porcine KIT digunakan untuk membantu proses pendeteksian. Hasil proses PCR dan Southern Hybridization pada Chip menunjukkan bahwa semua sampel marshmallow tidak mengandung unsur babi. Key Words: Marshmallow, Olipro porcine KIT, PCR, Southern hybridization,chip. PENDAHULUAN Persaingan antar industri pangan semakin ketat. Hal ini terlihat ketika kebanyakan produsen berlomba-lomba untuk menarik perhatian masyarakat dengan menghasilkan produk baru atau produk lama yang telah dimodifikasi dengan rasa baru. Namun, untuk dapat meningkatkan penjualan dan memperluas pemasaran diperlukan kreativitas dalam menciptakan suatu produk yang dapat diterima kehalalannya oleh konsumen (Sartika, 1995). Bahan tambahan yang sering digunakan dalam proses produksi makanan adalah gelatin. Penggunaan gelatin dalam industri pangan saat ini cukup luas, mulai dari makanan emulsi, pasta, permen lunak, minuman hingga kapsul. Gelatin sampai saat ini di Indonesia keberadaannya masih didatangkan dari hasil impor. Tahun 2003, Indonesia mengimpor lebih dari 6200 ton gelatin dari berbagai negara (Perancis, Jepang, India, Brazil, Jerman, Cina, Argentina, dan Australia) (Pusat Data dan Informasi Deperindag 2004). Kondisi tersebut sangat meresahkan masyarakat. Karena gelatin yang biasa digunakan dalam industri pangan umumnya berasal dari sapi atau babi. Di Indonesia, gelatin dari babi dilarang penggunaannya dalam suatu bahan atau produk pangan karena kondisi kehalalannya dan berkaitan dengan penduduk Indonesia yang mayoritas beragama Islam. (Sartika, 1995) Akhir-akhir ini terjadi kemajuan teknologi yang pesat dalam bidang biologi molekuler. Teknologi ini mempermudah pengujian atau pendeteksian akan adanya kontaminasi bahan lain diluar bahan aslinya (Margawati & Ridwan, 2010). Metode yang biasa digunakan berdasarkan pada pendeteksian molekul DNA spesifik menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction) (Tanabe, et al., 2007). Marshmallow merupakan salah satu produk makanan terproses, dibuat dengan pemanasan tinggi dan ph rendah. Akibatnya, terjadi degradasi dan hidrolisis enzim pada jenis produk terproses ini, sehingga membuat kualitas DNA dalam produk terproses menjadi rendah (Applewhite, et al., 2012). Untuk itu dibutuhkan teknik pendeteksian lanjutan untuk membantu sensitifitas kerja alat PCR. Maka, pada penelitian ini dipilih metode Southern hybridization sebagai metode lanjutan. Dengan metode ini gen yang terdapat dalam DNA sampel pada 88
produk terproses dapat dideteksi dengan baik (Sahilah, et al., 2012). Metode southern hybridization ini menggunakan kit Olipro sebagai reagen dalam proses pendeteksian sampel (Olipro, 2009). Alat dan Bahan Alat Mesin PCR (eppendorf ), oven hibridisasi (Olipro Biotechnology ), Orbital Shaker (Labnet ), tabung eppendorf (eppendorf ) 1.5 ml, tip eppendorf (10 µl, 100µl, 1000µl), vortex (Felt ), spektrofotometer maestronano (maestrogen ), sentrifugator (eppendorf ), autoklaf (Hirayama ), inkubator (Memmert ), Oven (panasonic ), gelas ukur, erlenmeyer, tube PCR (eppendorf ), collection tube (DNeasy Tissue Kit (QIAGEN )), QIAamp Spin column (DNeasy Tissue Kit (QIAGEN )) microcentrifuge tube, pisau pemotong steril/ surgical blade (Xinda ), alumunium foil, pipet mikro (eppendorf ) 0,1-10 µl ; 10-100 µl; 100-1000 µl, timbangan digital, perangkat elektroforesis (Elite 300 ), gel documentation system (Alpha Imager ), freezer (Dairei ), ice box, kertas parafilm, Bio chip (Olipro Biotechnology ), beaker glass, falcon tube. Bahan Marshmallow, kontrol positif (DNA babi), kontrol negatif (Nuckleas Free Water), kit isolasi DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany; buffer ATL, buffer AL, proteinase k, buffer AW1, buffer AW2, buffer AE), mastermix PCR Olipro (primer, dntp, MgCl 2, IC, dan buffer), DNA Taq Polymerase, aquadest steril, DNA ladder 100bp (Pure Extreme ), loading dye (Pure Extreme ), Ethanol 100 %, agarose powder, ethidium bromide, Tris Acetate EDTA (TAE), Reagen hibridisasi (Olipro ) dan DNA removal (Oligon ). METODE PENELITIAN Sampel Empat jenis Marshmallow yang tidak memiliki label halal dari MUI berasal dari empat Supermarket yang terdapat di Kota Padang. Sampel ini dikumpulkan pada bulan November 2012. Isolasi DNA Isolasi DNA menggunakan kit QIAGEN dengan jumlah total sampel yang digunakan adalah 20 mg. Sampel di potong kecil kemudian dimasukkan ke dalam 1,5 ml tabung eppendrof. Uji kualitatif dilakukan untuk melihat keberadaan DNA dalam sampel dengan menggunakan analisis spektrofotometer (Maestrogen ). DNA template disimpan pada suhu -20 C. Amplifikasi PCR Komponen PCR yang dibutuhkan untuk proses ini yaitu reagen PCR mastermix 19,6 µl, Taq DNA polymerase 0,5 µl, DNA template 10µl, dan NFW (nucleas free water) 19,9 µl. Total volume untuk komponen PCR yang digunakan adalah 50 µl untuk setiap sampel. Kontrol negatif menggunakan NFW dan kontrol positif menggunakan DNA babi masing-masing sebanyak 10 µl. Proses amplifikasi PCR ini dilakukan sebanyak 47 siklus yang terdiri dari; pradenaturasi 95 C (5 menit), denaturasi 95 C (30 detik), annealing (penempelan) pada 55 C (30 detik), extension (pemanjangan) 72 C (30 detik), elongation (pemanjangan akhir) 72 C 5 menit). Hasil amplifikasi PCR dapat dilihat dengan teknik elektroforesis, menggunakan gel agarosa 2,5 % dan buffer TAE 1x pada tegangan 100 Volt selama 39 menit. Untuk memudahkan pengamatan, gel diwarnai dengan 0.5 µg/ml 89
larutan editium bromida selama 5-10 menit dan dilihat gambarannya dengan DNA Gel Documentation system. Pada foto dapat dilihat pola pemisahan pita-pita DNA yang panjang amplikonnya diketahui, dimana untuk DNA babi adalah 276 bp. Southern Hybridization pada Chip Pada teknik ini produk PCR didenaturasi pada suhu 95 C selama 10 menit. Proses hibridisasi menggunakan OLIPRO Porcine Gene Chip (OLIPRO, MY). Proses hibridisasi dilakukan dengan pencampuran produk PCR yang telah didenaturasi dengan reagen ke dalam chip (ketentuan sesuai protocol kit). Setelah itu, dilihat hasil proses southern hybridization menggunakan scanner olipro biotechnology (OLIPRO, MY) yang mengandung probe target spesifik gen babi. Hasil positif mengindikasikan sampel mengandung DNA babi, hal ini ditunjukkan dengan terdapatnya 2 titik vertikal pada bagian tengah bawah chip. Dalam chip titik internal control mengindikasikan bahwa proses PCR dan southern hybridization berjalan dengan baik. HASIL DAN DISKUSI Hasil amplifikasi DNA menggunakan metode PCR-southern hybridization menunjukkan bahwa semua sampel marshmallow yang di uji negatif mengandung gen babi. Hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya pita DNA yang spesifik sama atau sejajar dengan kontrol positif yang digunakan berupa DNA babi pada 276 bp. (Gambar 1) dan tidak adanya visualisasi spot (gambar 2) pada 2 titik vertikal di bagian tengah paling bawah chip, menandakan pada sampel tidak terdapat gen babi. Penampakan titik pada chip terjadi ketika sequen DNA target pada produk PCR diberi label dengan senyawa biotin (senyawa berfluorosensi atau dikenal sebagai vitamin H) oleh reagen A. Senyawa biotin ini memiliki afinitas tinggi untuk mengikat avidin atau streptavidin alkalin fosfat (Strep- AP) yang merupakan protein hasil isolasi dari bakteri Streptomyces avidinii. Suhu optimum pada oven hibridisasi menyebabkan produk PCR yang telah berlabel biotin akan berikatan dengan probe pada membran nitroselulosa di dalam chip. Dimana probe ini memiliki nukleotida yang homolog dengan produk PCR. Dengan penambahan NBT/BCIP sebagai pewarna yang merupakan substrat dan akan berikatan dengan enzim strep-ap. Proses ini akan menimbulkan perubahan warna pada membran dalam chip menjadi ungu kebiruan (Olipro, MY. 2009). M NC H1 H2 H3 H4 PC M 300 195 276 90
Gambar 1. Hasil gel elektroforesis dari analisis DNA babi. Deteksi sampel menggunakan PCR OLIPRO porcine kit. M; Marker (penanda ladder 100 bp); PC: kontrol positif, NC: Kontrol negatif; H1-H4: Sampel negatif mengandung gen babi. K(-) K(+) H1 H2 H3 H4 Gambar 2. Scan process Southern hybridization menggunakan chip (Olipro porcine kit). Dimana K(-): kontrol negatif, K(+): kontrol positif, H1-H4: sampel marshmallow. Tabel 1. Hasil identifikasi pada ke empat sampel marshmallow menggunakan metode PCR dan Southern hybridization pada Chip Label sampel Jenis sampel Marshmallow PCR Metode Southern hybridization H1 Marshmallow BBQ - - H2 Marshmallow manis - - H3 Marshmallow isi selai - - (jam) H4 Marshmallow gula - - Walaupun proses PCR merupakan metode yang cepat dan simple, tetapi dengan adanya metode southern hybridization ini akan membantu sensitivitas kerja alat PCR terhadap proses pendeteksian. KESIMPULAN Pendeteksian DNA babi menggunakan metode PCR-southern hybridization ini akan lebih menghasilkan sensitivitas deteksi yang lebih baik. UCAPAN TERIMA KASIH Kami mengucapkan terima kasih kepada UKM atas bantuan dana yang berasal dari UKM (Fundamental Research Grant Schene), Malaysia yang telah bersedia mendukung penelitian ini serta Olipro Biotechnology Sdn. Bhd untuk semua fasilitas lab dan bimbingannya dalam penelitian ini. 91
REFERENSI Applewhite, L. A., Rasmussen, R. & Morrisey, M. 2012. Species identification of seafood. The Seafood Industry: Species, Products, Processing, and Safety, hlm. 193-212. West Sussex: Blackwell Publishing Ltd Olipro, MY. 2009. Olipro Porcine Gene chip. Diakses pada 10 Maret 2013 dari http://www. oliprobiotech.com. Pusat Data dan Informasi Departemen Perindustrian dan Perdagangan. 2004. Data Impor Gelatin Tahun 1999-2003. Jakarta Sahilah, A. M, Mohd. Fadly, L., Norrakiah, A. S., Aminah, A., Wan Aida, W. M., Ma aruf, A. G & Mohd. Khan, A. 2012. Halal market surveillance of soft and hard gel capsules in pharmaceutical products using PCR and southern hybridization on the biochip analysis. International Food Research Journal 19(1): 371-37. Sartika, D. 2009. Pengembangan Produk Marshmallow Dari Gelatin Kulit Ikan Kakap Merah (Lutjanus sp.).(skripsi). Bogor : Institut Pertanian Bogor. Tanabe, S., Hase, M., Yano, T., Sato, M., Fujimura, T., & Akiyama, H. 2007. A-real-time quantitative PCR detection method for pork, chicken, beef, mutton, and horseflesh in food. Bioschi. Biotechnol. Biochem, 71, 12, 3131-3135. 92