IV. BAHAN DAN METODE PENELITIAN 4.1. Tempat dan Waktu Percobaan Pelaksanaan percobaan pendahuluan dilakukan pada bulan April - Mei 2011. Pelaksanaan percobaan utama telah dilaksanakan pada bulan Februari - Maret 2012 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium Penilaian Indera, Laboratorium Kimia Pangan, Laboratorium Uji, dan Laboratorium In Vivo-Pilot Plan, Jurusan Teknologi Industri Pangan, Fakultas Teknologi Industri Pertanian, Universitas Padjadjaran. 4.2. Alat dan Bahan Percobaan 4.2.1. Bahan-Bahan Perobaan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian utama terdiri dari : butter, margarin, gula tepung, susu cair, susu skim, starter murni (L. bulgaricus, S. thermophilus, dan L. acidophilus), tepung bonggol pisang varietas batu dengan ciriciri berwarna putih di bagian dalamnya, tekstur keras tapi masih mudah dalam pemotongannya dan berumur 8-12 bulan setelah ditanam, tepung ubi jalar kuning varietas kuningan, konsentrat protein whey (KPW 80%), susu full krim, air, minyak nabati, gula tepung, garam, kuning telur dan bahan pengembang (baking powder dan baking soda)), tikus putih galur Wistar, pakan tikus (susu skim, minyak jagung, CMC (carboxy metil cellulosa) tablet Bekamin 10, tepung maizena, dan campuran mineral : NaCl, KI, KH2PO4, MgSO4 anhidrid, CaCO3, FeSO47H2O, MnSO47H2O, ZnSO47H2O, CuSO47H2O, CoC126H2O ), air minum, sekam padi, yogurt probiotik komersial. 40 FTIP001650/057
41 Bahan untuk keperluan analisis fisik dan kimia yaitu, HCl 0,1 M, NaOH 60% 0,1 M, ZnSO4 5%, Ba(OH)2 0,3 N, kertas saring, K2SO4, H2SO4 pekat, H3BO3 3%, Na2S2O3, metilen blue, dan alkohol. Bahan untuk keperluan analisis mikrobiologi, yaitu MRS agar, larutan pengencer NaCl Fis 0,85%. 4.2.2. Alat-alat Percobaan Peralatan yang digunakan untuk penelitian utama terdiri dari : objek glass, batang pengaduk, pipet, ose, pipet leukosit, sonde lambung, suntikan, gunting bedah, pinset anatomi dan fisiologis, vaquette dengan antikoagulan heparin, hemositometer, mikro pipet, pipet tetes, spatula, sendok, beker glass, gelas ukur, erlenmeyer, cawan porselin, labu ukur, bunsen, kertas saring, kain saring, masker, sarung tangan karet, Styrofoam, plastik, pisau, mangkuk, talenan, tempat makan, tempat minum, ph meter, buret, cetakan biskuit, loyang, baskom plastik, roller pin, tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas ukur, tabung silinder kimia, tabung Soxhlet, labu Kjeldhal, hotplate, mixer, neraca analitik, ayakan 80 mesh dan 120 mesh, counter colony, oven listrik, tanur, kandang tikus, desikator, water bath, autoclave, inkubator, refrigator, oven tipe kabinet. 4.3. Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan adalah metode penelitian deskriptif tanpa uji lanjutan. Metode ini menggunakan 5 jenis perlakuan dengan 2 kali ulangan. Perlakuan yang diujikan terhadap tikus putih adalah : M0 : Ransum standar (sebagai kontrol negatif) M1 : Ransum standar + krim probiotik yang berasal dari yogurt komersial + biskuit (sebagai kontrol positif) M2 : Ransum standar + krim probiotik (konsentrasi starter yogurt 3%) + biskuit FTIP001650/058
42 M3 : Ransum standar + krim probiotik (konsentrasi starter yogurt 4%) + biskuit M4 : Ransum standar + krim probiotik (konsentrasi starter yogurt 5%) + biskuit Tikus putih akan melalui masa adaptasi selama 7 hari, dimana selama masa adaptasi masing-masing tikus akan ditempatkan pada kandang yang terpisah, diberi makan berupa ransum standar sebanyak 10 g/ekor/hari dan air minum. Tujuan dari masa adaptasi ini adalah untuk membiasakan pola makan dan minum serta lingkungan hidup bagi tikus agar homogen sehingga tidak mempengaruhi hasil penelitian. Setelah masa adaptasi tikus akan melalui masa perlakuan selam 7 hari. Tikus putih diberi asupan sesuai dengan perlakuan sebanyak dua kali dalam sehari (pagi dan sore) dengan rentang waktu 7 jam, selama 7 hari. Setelah itu, tikus dimatikan (dislokasi), kemudian dilakukan pembedahan untuk mengambil darah yang terdapat pada pembuluh vena dan feses yang terdapat pada usus besar untuk penghitungan jumlah leukosit, diferensiasi leukosit, dan pengujian TPC pada feses. Data yang didapat dari perlakuan tersebut disajikan dalam bentuk diagram batang. Diagram batang akan menunjukkan biskuit bonggol pisang berisi krim yogurt probiotik yang mengandung konsentrasi starter berapakah yang mampu meningkatkan pertumbuhan bakteri asam laktat dalam sistem pencernaan dan tingkat imunitas hewan percobaan yang paling baik. 4.4. Pelaksanaan Percobaan 4.4.1. Percobaan Pendahuluan Percobaan pendahuluan dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu: tahap pembuatan tepung bonggol pisang dan tepung ubi jalar, serta tahap pembuatan krim probiotik yang terdiri dari tahap pembuatan yogurt probiotik, pembuatan krim FTIP001650/059
43 probiotik, dan pengujian viabilitas BAL (Bakteri Asam Laktat) pada krim probiotik. Prosedur pelaksanaan percobaan pendahuluan beserta data pengamatan disajikan pada Lampiran 1. 4.4.2. Percobaan Utama 1. Pembuatan Yogurt Probiotik A. Persiapan Starter Tahap pesiapan starter murni terdiri dari dua tahap, yaitu tahap pemeliharaan starter dan tahap pembuatan starter murni siap pakai. Tahap proses persiapan starter disajikan pada Gambar 7, dengan uraian sebagai berikut : Penusukan starter pada media MRS chalk semi solid Inkubasi starter pada suhu 37ºC selama 24 jam Penyimpanan dalam refrigerator (T : ±4 C) Untuk Penumbuhan kembali, diambil 1 loop starter Inokulasi pada media MRS Broth Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam Starter murni siap dipakai Gambar 7. Diagram Alir Pemeliharaan Starter (Heriyadi et al., 2001) a. Tahap pemeliharaan starter dilakukan dengan penusukan 1 loop starter pada media MRSA chalk semi solid dan inkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. FTIP001650/060
44 dari tahapan ini dapat diperoleh starter stok. Starter stok ini dapat disimpan dalam refrigator pada suhu 5 C dan dapat digunakan selama 8 minggu. Penyegaran starter stok dapat dilakukan dengan menumbuhkan pada media MRSA chalk semi solid baru. b. Tahap aktivasi starter bakteri (starter murni siap pakai). Starter bakteri diaktifkan melalui penyegaran dengan cara ditumbuhkan dalam media de Mann Rogossa Sharp Broth (MRSB) dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Starter bakteri perlu disegarkan hingga berumur 24 jam sebelum diinokulasikan ke dalam susu murni sebagai starter. B. Pembuatan Starter Starter yang digunakan selama penelitian dibuat dari starter murni (L. bulgaricus, S. thermophilus, dan L. acidophilus) yang telah dipindahkan ke dalam susu skim sebanyak dua tahap. Tahap pertama adalah transformasi starter murni menjadi starter induk dan tahap kedua adalah transformasi dari starter induk menjadi starter kerja. Tahap proses pembuatan starter dapat dilihat pada Gambar 8, dengan uraian sebagai berikut : FTIP001650/061
45 1% Starter Murni Tunggal (L. bulgaricus/l. acidophilus/s. thermophilus) Penambahan starter ke dalam 50 ml susu skim ( konsentrasi10%) steril Inkubasi starter L. acidophilus ( T : 37-38ºC t : 24 jam) Inkubasi starter L. bulgaricus dan S. thermophilus ( T : 43-45ºC t : 24 jam) Starter Induk Inokulasi 5% starter induk ke dalam 100 ml susu skim (konsentrasi10%) steril Inkubasi starter L. bulgaricus dan S. thermophilus ( T : 43-45ºC t : 24 jam) Inkubasi starter L. acidophilus ( T : 37-38ºC t : 24 jam) Starter Kerja (L. bulgaricus/l. acidophilus/s. thermophilus) Gambar 8. Diagram Alir Pembuatan Starter (Modifikasi Heriyadi et al., 2001) a. Sterilisasi alat dan bahan yang terdiri dari : bekker gelas 50 ml dan 100 ml, serta 50 ml dan 100 ml susu skim konsentrasi 10%. Transformasi starter murni menjadi starter induk dibutuhkan 50 ml larutan susu skim 10% untuk 1 jenis starter bakteri dan 100 ml larutan susu skim 10% untuk transformasi starter induk menjadi starter kerja untuk masing-masing starter bakteri. b. Penambahan l% (0,5 ml) starter murni dari masing-masing bakteri ( L. bulgaricus, L. acidophilus, atau S. thermophilus) ke dalam 50 ml larutan susu FTIP001650/062
46 skim 10% serta dilakukan homogenisasi dengan cara menggerakkan bekker gelas membentuk angka delapan pada meja sebanyak 20 kali. c. Inkubasi tahap pertama yaitu transformasi untuk menjadi starter induk dilakukan selama 24 jam pada suhu 43-45 C untuk kultur induk L. bulgaricus dan S. thermophilus, sedangkan untuk L. acidhophilus selama 24 jam pada suhu 35-38 C. d. Penambahan 5% starter induk (5 ml) pada 100 ml larutan susu skim 10% untuk transformasi tahap kedua yaitu membuat starter induk menjadi starter kerja. e. Inkubasi starter induk untuk menjadi starter kerja selama 24 jam pada suhu 43-45 C untuk kultur induk L. bulgaricus dan S. thermophilus, sedangkan untuk L. acidhophilus selama 24 jam pada suhu 35-38 C. f. Starter siap digunakan langsung atau dapat disimpan dalam refrigator. C. Proses Pembuatan Yogurt Probiotik Proses pembuatan yogurt probiotik dengan perlakuan penambahan susu skim sebanyak 5%, Perlakuan konsentrasi starter 3%, 4%, dan 5% dengan jenis bakteri yang digunakan adalah L. bulgaricus, S. thermophilus, dan L. acidophilus dengan perbandingan 1:1:1 v/v. Tahap proses pembuatan yogurt probiotik disajikan pada Gambar 9, dengan uraian sebagai berikut : FTIP001650/063
47 Susu Segar Susu skim 5% b/v Pasteurisasi T : 80-85 C ; t : 15 menit Starter campuran L. bulgaricus:s. thermophilus:l. acidophilus = 1:1:1 dengan konsentrasi 3%,4%,5% v/v Pendinginan Susu hingga T : 40-45 C t : ± 30 menit Inokulasi Inkubasi Tahap 1 T : 37 C ; t : 1 jam Inkubasi Tahap 2 T : 42-45 C ; t : 2 jam Yogurt Probiotik Gambar 9. Proses Pembuatan Yogurt Probiotik (Modifikasi Hadiwiyoto, 1983) a. Pasteurisasi susu segar yang telah ditambahkan 5% b/v susu skim dengan suhu 80 85 C selama 15 menit. Tahap pasteurisasi (pemanasan) ini bertujuan untuk menghancurkan dan menginaktivasi organisme yang tidak diinginkan yang dapat berkompetisi dengan bakteri yogurt. Selain itu, pemanasan juga mempengaruhi protein dalam susu untuk mengikat air sehingga diperoleh curd yang lebih kompak dan suhu pemanasan yang tinggi dapat membebaskan oksigen sehingga menciptakan kondisi anaerob selama fermentasi (Helferich and Westhoff, 1980). b. Pendinginan susu hingga suhu mencapai 40-45 C yang bertujuan untuk memberikan kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri starter. Pendinginan susu dilakuan dengan cara merendam beker glass yang berisi susu pada wadah yang FTIP001650/064
48 berisi air, kemudian air diganti dengan yang baru setelah air menjadi lebih hangat, hal ini dilakukan beberapa kali hingga suhu susu mencapai 40-45 C ± 30 menit. c. Inokulasi starter kerja (L. acidophilus, L. bulgaricus, dan S. thermophilus) dengan perbandingan 1 : 1 : 1 sebanyak 3%, 4%, atau 5% v/v. d. Inkubasi dilakukan dengan dua tahap, yaitu pada suhu 37 C selama 1 jam kemudian dilanjutkan dengan suhu 42-45 C selama 2 jam. tujuan dari inkubasi tahap pertama adalah untuk mengoptimalkan suhu bagi pertumbuhan bakteri L. acidophilus sedangkan tahap kedua untuk mengoptimalkan suhu pertumbuhan bagi L. bulgaricus, dan S. thermophilus. 2. Pembuatan Krim Probiotik Formula yang digunakan dalam pembuatan krim, yaitu 75 gram gula halus, 10 gram margarine, 10 gram butter unsalted, dan yogurt probiotik dengan berbagai konsentrasi perlakuan. Tahap proses pembuatan krim dapat dilihat pada Gambar 10, dengan uraian sebagai berikut: 10 g Butter + 10 g Margarin Pengadukan dengan horizontal mixer kecepatan rendah (posisi 1) selama 1 menit 75 g gula tepung + 5 ml yogurt probiotik Pengadukan dengan kecepatan tinggi (posisi 5) selama 2 menit Pengadukan dengan kecepatan rendah (posisi 1) selama 1 menit Pengadukan dengan kecepatan tinggi (posisi 5) selama 3 menit Krim Probiotik Gambar 10. Diagram Proses Pembuatan Krim Probiotik Biskuit Sandwich (Modifikasi Rieuwpassa, 2005) FTIP001650/065
49 a. Penyiapan bahan, meliputi tahap penimbangan bahan-bahan yang digunakan yaitu: gula halus sebanyak 100 g, margarin 10 g, butter unsalted 10 g, dan yogurt probiotik dengan berbagai konsentrasi perlakuan. b. Pencampuran bahan I, yaitu mencampurkan bahan seperti margarin dan butter unsalted yang dikocok dengan mixer selama 1 menit, dengan kecepatan sampai kedua bahan tercampur merata. c. Pengocokkan tahap I, yaitu mengocok bahan I dengan kecepatan tinggi selama 2 menit. d. Pencampuran bahan II, yaitu mencampurkan bahan seperti gula halus dan yogurt probiotik yang dikocok dengan mixer selama 1 menit, dengan kecepatan sampai kedua bahan tercampur merata. e. Pengocokkan tahap II, yaitu mengocok bahan-bahan yang telah tercampur di atas dengan kecepatan tinggi selama 3 menit sampai terbentuk krim. 3. Pembuatan Biskuit Tepung Komposit Berisi Krim Probiotik a. Formula yang digunakan adalah 55 g tepung bonggol pisang, 45 g tepung ubi jalar, 70 g gula tepung, 50 g minyak nabati, 40 g susu full krim, 30 g kuning telur, 48 g air, 0,8 g garam, 0,7 g baking soda, 0,5 g baking powder dan 16 g KPW 80 (perhitungan jumlah penambahan KPW 80 dapat dilihat pada Lampiran 1). Prosedur pembuatan biskuit selengkapnya terdapat pada Gambar 11. FTIP001650/066
50 70 g Gula tepung, 50 g Minyak nabati, dan 0,8 g Garam 40 g Susu full krim 30 g Kuning telur 55 g Tepung bonggol pisang 45 g Tepung ubi jalar 16 g KPW 80 0,7 g Baking soda 0,8 g Baking powder Pencampuran Bahan I (Pengadukan dengan mixer kecepatan tinggi sampai tebentuk krim selama 10 menit) Pencampuran Bahan II (Pengadukan dengan mixer kecepatan rendah selama 4 menit) Pencampuran Bahan III 48 g Air Pembuatan adonan (Penambahan air sedikit demi sedikit) Aging (15-30 menit) Pencetakan Pemanggangan T : 160 C ; t : 15-18 menit Pendinginan Biskuit bonggol pisang Krim Probiotik Sandwiching Biskuit Sandwich Probiotik Pengemasan Gambar 11. Proses Pembuatan Biskuit Tepung Komposit Berisi Krim Probiotik (Modifikasi Juwita, 2010) FTIP001650/067
51 Prosedur pembuatan biskuit bonggol pisang hasil penelitian Jasmin (2010) selengkapnya meliputi : b. Penyiapan bahan Penyiapan bahan meliputi tahap penimbangan bahan-bahan yang digunakan yaitu: tepung bonggol pisang, tepung ubi jalar, garam, gula tepung, minyak nabati, susu full krim, kuning telur dan bahan pengembang (baking powder dan baking soda). c. Pencampuran bahan I Pencampuran bahan I yaitu mencampurkan bahan seperti gula tepung, garam dan minyak nabati yang diaduk dengan mixer (10 menit) sampai terbentuk krim. d. Pencampuran bahan II Penambahan susu full krim dan kuning telur ke dalam krim, lalu diaduk kembali sampai tercampur halus (4 menit). e. Pencampuran bahan III Penambahan tepung bonggol pisang, tepung ubi jalar, dan konsetrat whey protein dengan imbangan yang telah ditentukan, juga ditambahkan bahan pengembang. f. Pembentukan adonan Pembentukan adonan ini dilakukan dengan mengaduk bahan-bahan yang telah tercampur diatas dengan menggunakan air sedikit demi sedikit hingga terbentuk adonan yang merata. g. Aging (15-30 menit) Setelah adonan terbentuk, dilakukan proses aging. Aging diperlukan untuk memberi kesempatan kepada bahan pengembang untuk bekerja. FTIP001650/068
52 h. Pencetakkan Sebelum dicetak, adonan yang telah diaging mengalami penipisan terlebih dahulu sampai diperoleh ketebalan yang diinginkan yaitu sekitar 3 mm, lalu dicetak. i. Pemanggangan Pemanggangan pada pembuatan biskuit dilakukan dengan menggunakan oven listrik suhu 160oC selama 15-18 menit. Pada waktu pemanggangan struktur biskuit akan terbentuk akibat gas yang dilepaskan oleh bahan pengembang dan uap air akibat kenaikan suhu. j. Pendinginan Pendinginan dilakukan dengan cara mendiamkan biskuit yang baru keluar dari oven pada suhu ruang (25 C) selama ± 10 menit. Tahap pendinginan bertujuan untuk menurunkan suhu biskuit dan mengeraskan biskuit akibat memadatnya gula dan lemak. k. Sandwiching Sandwiching biskuit dilakukan secara manual, yaitu dengan menggunakan kantong penyemprot krim. Krim yang sudah ditimbang diletakkan di tengahtengah biskuit yang akan menjadi dasar, kemudian biscuit bagian atas diletakkan di atas krim sambil diputar dan agak sedikit ditekan sehingga krim menyebar secara merata. l. Pengemasan Pengemasan biskuit bertujuan untuk melindungi dari kerusakan dan penyimpangan mutu. Menurut Manley (1983), biskuit termasuk produk yang mudah menyerap air dan oksigen sehingga bahan pengemasnya harus memenuhi FTIP001650/069
53 beberapa syarat antara lain kedap air, kedap oksigen, kedap terhadap komponen volatil terutama bau-baun, kedap terhadap sinar matahari, dan mampu melindungi produk dari kerusakan mekanis. Bahan pengemas yang dapat digunakan untuk mengemas biskuit antara lain : plastik jenis polipropilen, alumunium foil, kertas minyak, karton berlipat, dan kaleng berbentuk persegi dan bulat. Bahan kemasan tersebut dapat berperan sebagai kemasan primer atau kemasan sekunder. 4. Pengujian Secara In Vivo Pengujian In Vivo pada penelitian ini menggunakan tikus putih jantan galur Wistar, dengan persyaratan, usia 6 minggu sebanyak 10 ekor yang dibagi menjadi 5 kelompok. Masing-masing kelompok terdiri dari 2 ekor tikus. Setiap ekor tikus mempunyai kandang yang terpisah. Selama penelitian, hewan percobaan dipelihara pada suhu kamar, diberi pakan ransum standar (Tabel 5) sebanyak 10g/ekor/hari dan air minum berupa akuades steril selama tahap adaptasi dan masa perlakuan secara ad libitum. Ransum yang diberikan sesuai dengan kegutuhan gizi tikus. Tabel 5. Komposisi Ransum Standar Bahan Ransum Kasein (sumber protein) Minyak jagung (sumber lemak) Selulosa (sumber serat) Campuran mineral (sumber mineral) Tablet Bekamin 10 (sumber vitamin) Air Pati jagung (sumber karbohidrat) Jumlah (%) 20 8 1 3 1 5 62 Sumber : Muchtadi et al., (1989) FTIP001650/070
54 Komposisi campuran mineral yang diberikan pada pakan tikus dibuat menurut Muchtadi et al., (1989) tercantum pada Tabel 6. Tabel 6. Komposisi Campuran Mineral Pada Ransum Tikus Jenis Mineral NaCl KI KH2PO4 MgSO4 anhidrid CaCO3 FeSO47H2O MnSO47H2O ZnSO47H2O CuSO47H2O CoC126H2O Jumlah Mineral (g) 139,3 0,79 389 57,3 381,4 27 4,01 0,548 0,477 0,023 Sumber : Muchtadi et al., (1989) Setelah masa perlakuan selesai, tikus dimatikan dengan cara dislokasi cervicalis, kemudian dilakukan pembedahan untuk mengambil darah yang terdapat pada pembuluh vena dan untuk mengambil feses yang terdapat pada usus besar. Darah yang diambil, kemudian dilakukan penghitungan jumlah leukosit dan diferensiasi leukosit, sedangkan pada feses, dilakukan TPC. 4.5. Kriteria Pengamatan Pengamatan yang dilakukan pada percobaan utama meliputi pengamatan terhadap biskuit tepung komposit (bonggol pisang, ubi jalar, dan konsentrat protein whey), krim probiotik, serta darah dan feses hewan prcobaan. Prosedur analisis dan pengujian pada percobaan utama disajikan pada lampiran 1. 1. Pengamatan terhadap krim probiotik a. Deskripsi karakteristik krim secara visual meliputi : FTIP001650/071
55 Kenampakan permukaan krim Pengerasan krim secara organoleptik Uji stabilitas emulsi b. Analisis fisik krim meliputi : Pengukuran densitas kamba (Kenkel, J., 2002) Pengukuran viskositas krim dengan alat Rapid Visco Analyzer (Weaver dan Daniel, 2003) 2. Pengamatan terhadap biskuit sandwich a. Analisis mikrobiologi dengan metode TPC (Fardiaz, 1989). 3. Pengamatan terhadap feses dan darah hewan percobaan a. Analisis Mikrobiologi dengan metode TPC pada media agar MRS (Fardiaz, 1989). b. Perhitungan jumlah leukosit (Gandasoebrata, 2007 dikutip Nadiah, 2011). c. Diferensiasi leukosit (Wattiheluw, 2007 dikutip Nadiah, 2011). 4. Pengamatan penunjang untuk biskuit sandwich probiotik terbaik : a. Analisis Kimia Krim : Kadar air metode destilasi toluene (AOAC, 1990), Kadar abu cara kering (AOAC, 1990), Kadar protein metode kjeldahl (AOAC, 1990), Kadar lemak metode soxhlet (AOAC, 1990), Kadar karbohidrat (by difference). b. Analisis kimia biskuit meliputi : kadar air metode thermogravimetri (AOAC, 1990), kadar abu cara kering (AOAC, 1990), kadar protein metode kjeldahl (AOAC, 1990), kadar lemak metode soxhlet (AOAC, 1990), dan kadar karbohidrat (by difference). c. Perhitungan AKG (Angka Kecukupan Gizi) Biskuit Sandwich Probiotik (jumlah kalori per 100 g biskuit) (Hardiansyah dan Dodik, B., 1994). FTIP001650/072