BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah jenis penelitian eksperimen. Termasuk jenis penelitian ekperimen karena observasi di bawah kondisi buatan (artificial condition), dan kondisi tersebut dibuat dan diatur. Penelitian ini dilakukan dengan mengadakan manipulasi objek penelitian serta adanya kontrol sebagai perbandingan dalam eksperimen (Nazir, 2003:63) Objek dalam penelitian ini adalah produksi pigmen yang dihasilkan oleh M. purpureus yang dinyatakan dalam satuan Unit Absorbansi per gram substrat. Kontrol dalam penelitian ini yaitu substrat tepung biji durian yang tidak diberikan inokulum spora M. purpureus. B. Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan adalah desain Rancangan Acak lengkap (RAL). Pada penelitian terdapat tiga variabel penelitian yaitu variabel bebas, variabel terikat dan variabel kontrol. Variabel bebasnya yaitu konsentrasi inokulum spora M. purpureus. Sedangkan variabel terikatnya yaitu produksi pigmen M. purpureus. Kemudian untuk variabel kontrolnya adalah Jenis substrat, jenis organisme yang digunakan, ph substrat, waktu dan suhu inkubasi. Penelitian ini terdiri dari 4 perlakuan yaitu inokulum spora M. purpureusdengan konsentrasi 0%, 5%, 10%, 15%. Setiap perlakuan akan dilakukan pengulangan dengan mengikuti rumus (t) (r) 1 20 (Gomez, 1995). Dimana t adalah perlakuan (treatment), sedangkan r adalah pengulangan (replication). 21

22 Dengan demikian: (t) (r 1) 20 (4) (r 1) 20 (r 1) 5 r 6 Berdasarkan perhitungan di atas, maka banyaknya pengulangan yang harus dilakukan adalah minimal enam kali. Maka terdapat 24 unit percobaan. 24 unit percobaan ini diletakkan secara acak, mengikuti aturan bilangan acak yang diperoleh dengan menggunakan pengocokan secara manual.unit percobaan disusun seperti Tabel 3.1 dan untuk penempatan botol dalam inkubator tersaji dalam Gambar 3.1. Tabel 3.1. Desain Rancangan Acak Lengkap 91 66 65 9 162 158 105 24 114 112 17 42 31 142 23 150 85 133 27 40 100 68 161 73 52 14 16 8 156 34 26 144 90 148 94 97 13 87 54 25 145 55 113 67 77 63 15 82 110 81 12 20 125 19 123 10 152 136 107 39 121 32 28 1 137 62 108 56 69 99 57 102 72 38 45 103 129 11 134 92 79 75 126 61 50 109 118 37 60 166 131 143 30 153 78 95 43 5 80 46 146 111 44 155 104 76 70 164 117 151 93 101 89 98 160 124 84 21 159 140 53 147 106 59 128 4 7 127 29 41 83 48 2 139 88 74 33 132 122 115 138 71 119 49 141 22 6 58 130 47 154 3 51 36 167 120 135 35 151 168 165 116 86 149 96 18 163 64

23 Keterangan: 1. Konsentrasi inokulum 0% 2. Konsentrasi inokulum 5% a. Hari ke 1: botol nomor 1-6 a. Hari ke 1: botol nomor 43-48 b. Hari ke 3 : botol nomor 7-12 b. Hari ke 3: botol nomor 49-54 c. Hari ke 5 : botol nomor 13-18 c. Hari ke 5: botol nomor 55-60 d. Hari ke 7 : botol nomor 19-24 d. Hari ke 7: botol nomor 61-66 e. Hari ke 9 : botol nomor 25-30 e. Hari ke 9: botol nomor 67-72 f. Hari ke 11: botol nomor 31-36 f. Hari ke 11:botol nomor 73-78 g. Hari ke 13: botol nomor 37-42 g. Hari ke 13: botol nomor 79-84 3. Konsentrasi inokulum 10% 4. Konsentrasi inokulum 15% a. Hari ke 1: botol nomor 85-90 a. Hari ke 1 : botol nomor 127-132 b. Hari ke 3: botol nomor 91-96 b. Hari ke 3 : botol nomor 133-138 c. Hari ke 5: botol nomor 97-102 c. Hari ke 5 : botol nomor 139-144 d. Hari ke 7: botol nomor 103-108 d. Hari ke 7 : botol nomor 145-150 e. Hari ke 9: botol nomor 109-114 e. Hari ke 9 : botol nomor 151-156 f. Hari ke 11: botol nomor 115-120 f. Hari ke 11 : botol nomor 157-162 g. Hari ke 13: botol nomor 121-126 g. Hari ke 13 : botol nomor 163-168

24 Gambar 3.1 Penempatan botol fermentasi (Sumber: Dokumentasi Pribadi ) C. Populasi dan Sampel Populasi : Seluruh substrat tepung biji durian yang berada dalam botol fermentor. Sampel : 1 gram substrat tepung biji durian yang diambil dari botol fermentor untuk pengukuran produksi pigmen M. purpureus. D. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Februari 2013 sampai dengan bulan Juli 2013.Serta dilakukan di Laboratorium Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI.

25 E. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Alat No. Alat Tabel 3.2 Alat Penelitian Spesifikasi 1. Autoclave HL36AE 2. Jarum inokulasi 3. Tabung reaksi Pyrex 4. Jumlah 3 unit 10 unit Timbangan digital PT25.221.03.018BF 5. Gelas ukur Pyrex, 250 ml 6. Vorteks homogenizer PT25.221.03.044BM 3 unit 7. Shaker bath PT25.2221.03004 BM 8. Spektrofotometer 9. Alumunium foil PT25-221- 03021BF(2/2) 10. Plastik tahan panas Ukuran ½ kg 11. Karet gelang 13. ph indikator 14. Kain sumbat 15. Haemocytometer 16. Inkubator 17. Erlenmayer Pyrex 500 ml 18. Erlenmayer Pyrex 100 ml 19. Termometer 0-100 C 20. Wadah plastik 1 pack 40 lembar 200 unit 50 lembar 60 unit 20 unit 25 unit 2 unit 168 unit 21. Mikroskop Listrik Shimadzu BI-71-16126

26 22. Spatula 23. Pembakar spirtus 24. Korek api 25. Batang pengaduk 26. Botol gelas ukuran 1 L 4 unit 1 kotak 27. Papan miring 28. Hot plate & magnetic stireer 29. Oven PT25.221.03.023 BM (1/2) 30. Loyang 31. Pisau 2. Bahan No. Bahan Spesifikasi Jumlah 1. Monascus purpureus Kapang 18 isolat 2. Tepung biji durian Serbuk 1680 gram 4. Medium PDA Serbuk 10,4 gram 5. Ethanol 95% Cairan 840 ml 6. Aquades steril Cairan 500 ml 7. KH 2 PO 4 Serbuk 2 gram 8. NH 4 NO 3 Serbuk 5 gram 9. NaCl Serbuk 1 gram 10. MgSO 4 7H 2 O Serbuk 1 gram 11. Spirtus Cairan Secukupnya

27 F. Prosedur Kerja 1. Tahap Persiapan a. Pembuatan Medium PDA Medium yang digunakan untuk menumbuhkan M. purpureusadalah PDA (Potato Dekstrose Agar). Medium dibuat dengan mencampurkan serbuk PDA dengan aquades dengan takaran tertentu. Standar pembuatannya yaitu untuk 1 liter medium PDA, dibutuhkan 39 gram serbuk PDA.Setelah dicampurkan dengan aquades dan diaduk hingga homogen, medium dipanaskan di hot plate dan magnetic stirer hingga mendidih. b. Sterilisasi Mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Semuanya disterilkan di autoclave pada suhu 121 0 C selama 15 menit. Setelah selesai, semua alat dan bahan disimpan di tempat yang aman. Alatalat yang tidak tahan panas disterilkan dengan menggunakan alkohol. 2. Tahap Pra Penelitian a. Identifikasi Monascus purpureus Isolat kapang M. purpureus yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi ITB selanjutnya dibiakan dalam medium kultur PDA di laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FPMIPA UPI. Penyimpanan dilakukan di suhu ruang. Identifikasi M. purpureus dilakuakan melalui pengamatan morfologi secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan makroskopis dilakuakan dengan mengawati warna miselia dan bentuk koloni M. purpureus. Sedangkan pengamatan mikroskopis dilakukan dengan pembuatan slide culture lalu mengamati bentuk spora, hifa, kleistotesia dan aleurokonidia M. purpureus di bawah

28 mikroskopdengan perbesaran 400x. Identifikasi mengacu pada Chairoite et al. (2008) dan Pattangul et al. (2007). b. Pemeliharaan dan Perbanyakan Monascus purpureus Stok biakan disimpan pada suhu 4 0 C. Sedangkan kapang yang digunakan untuk penelitian dikultur pada inkubator suhu 30-31 0 C. Berikut kultur M. purpureus yang dibiakan dalam tabung reaksi yang disajikan pada Gambar 3.2. Gambar 3.2 Monascus purpureus Usia Kultur Enam Hari pada Tabung Reaksi (Sumber: Dokumentasi Pribadi ) c. Pembuatan Kurva Produksi Spora Monascus purpureus Pembuatan kurva produksi spora M. purpureus bertujuan untuk mengetahui jumlah spora yang diproduksi oleh M. purpureus. Adapun cara yang dilakukan yaitu dengan mengambil koloni M. Purpureus yang tumbuh di cawan Petri menggunakan pelubang gabus berdiameter 0,6 mm. Potongan miselium M. Purpureus dari koloni yang tumbuh pada cawan Petri ini kemudian diinokulasikan

29 pada medium PDA miring dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 30-31 o C. Jumlah spora diamati setiapa hari dengan cara memasukkan 9 ml aquades ke dalam PDA miring (Tim QC APH golongan jamur, 2009). Melepaskan spora dengan cara mengeruk secara perlahan suspensi spora dengan menggunakan jarum ose sampel dihomogenkan dengan vortex dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi kosong, kemudian diteteskan satu tetes pada bidang hitung haemocytometer, lalu menutupnya dengan gelas penutup, Selanjutnya menghitung spora M. Purpureus di bawah mikroskop. Kemudian dengan perbesaran 400x, hingga didapatkan bidang hitung pada haemocytometer.spora yang dihitung hanya yang terletak pada kotak hitung (1 + 2 + 3 + 4 + 5) dengan perbesaran 400x. penghitungan spora hanya di daerah bertanda kotak seperti yang tersaji dalam Gambar 3.3. Gambar 3.3 Haemocytometer (Sumber: http://toolboxes.flexiblelearning.net.au/) Dalam daerah yang diberi tanda kotak itu, terdapat 25 persegi seperti Gambar 3.4.dari ke-25 persegi itu, dipilih lima kotak saja untuk dijadikan tempat menghitung spora, yaitu kotak 1, 2, 3, 4, 5.

30 Gambar 3.4 Kotak Penghitungan Spora M. purpureus (Sumber: Henderson, 2010) Setiap kotak 1, 2, 3, 4, 5 memiliki empat kotak kecil. Perhitungan spora mengikuti aturan seperti yang dijelaskan dalam Gambar 3.5. Gambar 3.5 Alur Penghitungan Spora M. purpureus (Sumber: http://b110-wiki.dkfz.de/) Setelah didapatkan jumlah spora M. Purpureus pada kotak hitung 1, 2, 3, 4 dan 5, lalu dihitung jumlah spora/ml pada bidang hitung dengan rumus sebagai berikut:

31 x (mm 2 ) t (mm) d 103 Keterangan: S: Jumlah spora/ml X: Jumlah spora yang dihitung (1 + 2 + 3 + 4 + 5) L: Luas kotak hitung (0,04 x 5 = 0,2 mm 2 ) t: Kedalaman bidang hitung (0,1 mm) d: Faktor pengenceran 10 3 : Volume suspense yang diambil (1 ml = 10 3 mm 3 ) (Sumber: Modifikasi dari Tim QC APH Golongan jamur) d. Persiapan Sebagai Subtrat Biji durian yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji durian yang berasar dari durian lokal dengan jenis perwira yang diperoleh dari penjual durian di daerah Sinampeul Majalengka, Jawa Barat.Seperti yang tersaji dalam Gambar 3.6. Gambar 3.6 Biji dan Buah Durian Jenis Perwira (Sumber: Dokumentasi Pribadi ) Biji durian dicuci, kemudian merebusnya selama 10 menit dalam air mendidih, ditiriskan, selanjutnya kulit biji durian dikupas. Memotong biji durian dengan ketebalan 1 cm (Srianta, 2012). Selanjutnya ditaburi dengan garam untuk menghilangkan lendir, dicampurkan, selanjutnya diaduk-aduk dibawah air mengalir sampai mengeluarkan busa, kemudian mencuci potongan biji durian dengan air mengalir sampai lendir berkurang dan

32 ditiriskan, mengoven sampai kering. Menghaluskan hasil pengeringan dengan mesin penggiling dan mengayaknya hingga diperoleh tepung biji durian. Seperti yang tersaji dalam gambar 3.7. Gambar 3.7 (Sumber: Dokumentasi Pribadi) e. Persiapan Medium Fermentasi Substrat yang digunakan sebanyak 10 gram tepung biji durian. Kemudian dimasukan ke dalam botol fermentasi.kemudian diautoklaf pada 121 0 C selama 15 menit. Lalu didinginkan sampai suhu kamar.kemudian ditambahkan 4 ml larutan nutrisi yang mengandung (dalam gr/l): 2 g KH 2 PO 4, 5 gr NH 4 NO 3, 1 gr NaCl, dan 1 gr MgSO 4.7H 2 O. dilarutkan dengan aquades, ditambahkan ke dalam subkultur lalu kelembaban substrat ini diatur hingga di mencapai 65% dengan menambahkan sejumlah aquades dan tingkat keasaman sebesar ph 6,5. Setelah semua proses telah selesai lalu botol fermentasi tersebut di tutup dengan alumunium foil. Kemudian di autoclave pada 121 0 C selama 20 menit dan dinginkan sampai suhu kamar (Babitha et al., 2007)

33 f. Persiapan Inokulum Spora Monascus purpureus Inokulum spora M. purpureus dibuat dengan cara mengikis koloni M. purpureusdari permukaan PDA yang berusia 6 hari dengan menggunakan 10 ml aquades steril. Kegiatan ini dilakukan secara aseptik. Lalu suspensi spora yang telah dibuat kemudian divorteks hingga homogen dan dihitung jumlah sporanya menggunakan haemocytometer. Untuk mendapatkan banyaknya suspensi spora yang diinokulasikan maka digunakan rumus sebagai berikut. Keterangan : x n : Banyaknya suspensi spora yang digunakan : Konsentrasi yang digunakan 10 : 10 gram substrat yang digunakan Untuk konsentrasi inokulum 0% substrat tepung biji durian tidak diinokulasikan dengan suspensi spora M. purpureus. Untuk konsentrasi 5% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram diinokulasikan dengan 0,5 ml suspensi spora. Untuk konsentrasi 10% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram diinokulasikan dengan 1 ml suspensi spora. Kemudian untuk konsentrasi 15% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram diinokulasikan dengan 1,5 ml suspensi spora (Babitha, 2007). g. Analisis Kandungan Amilum, Protein Verietas Sinampeul Analisis kandungan amilum (pati) dilakukan di Laboratorium Teknologi Industri Pangan UNPAD dengan menggunakan metode Met Luff School. Sedangkan analisis kandungan protein pada

34 tepung biji durian dilakukan di Laboratorium Teknologi Pangan UNPAS dengan menggunakan metode Kjeldahl. 3. Tahap Penelitian a. Fermentasi Substrat dengan Kapang Monascus purpureus Medium fermentasi yang telah disterilkan tadi dibiarkan hingga suhunya turun hingga ke suhu ruangan. Lalu diinokulasikan dengan suspensi spora kapang M. Purpureus yang jumlah sporanya 10 6 spora/ml dengan konsentrasi inokulum yang terdiri dari 0%, 5%, 10%, 15% (v/b). Botol fermentasi ditutup dengan alumunium foil steril agar tidak terjadi kontaminasi. Fermentasi akan dilakukan pada suhu 30-32 C selama 14 hari dalam kondisi statis (Carvalho,2007). b. Sampling Pengambilan Substrat Sampling pengambilan substrat tepung biji durian yang telah difermentasi oleh Monascus purpureus diambil mulai hari ke-1 hingga hari ke-14 (Carvalho,2007). c. Penghitungan Absorbansi Pigmen M. purpureus Penghitungan asorbansi pigmen merah dilakukan dengan cara mengambil 1 gram sampel yang telah difermentasi dan dikeringkan. Lalu ditambahkan dengan 5 ml ethanol 90%, lalu dishaker dengan kecepatan 200 rpm selama 1 jam. Setelah itu, pisahkan larutan hasil campuran ethanol dan sampel dengan memasukannya ke dalam tabung 1,5 ml, kemudian disentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan lalu dimasukkan ke dalam tabung cuvet dan diukur dengan menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm (pigmen merah), 400 nm (pigmen kuning) dan 470 nm (pigmen

35 jingga). Spektrofotometer terlebih dahulu dikalibrasi menggunakan ethanol 95% sebagai blanko (Pattanagul, 2007). d. Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian ini berupa nilai absorbansi pigmen M. purpureus pada panjang gelombang 500 nm (pigmen merah), 400 nm (pigmen kuning) dan 470 nm (pigmen jingga). Data yang diperoleh dianalisis menggunakan program SPSS versi 16.0 for window. Setelah dilakukan uji normalitas (Skewness- Kurtosis) dan homogenitas (Levene test), didapatkan hasil bahwa data produksi pigmen M. purpureus pada angkak tepung biji durian berdistribusi normal tetapi tidak homogen, oleh karena itu dilakukan analisis data secara non-parametrik menggunakan uji Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney.

36 G. Alur Penelitian Alur penelitian yang dilakukan yaitu sebagai berikut: Tahap Persiapan a. Pembuatan medium PDA b. Sterilisasi Tahap Pra Penelitian a. Identifikasi Monascus purpureus b. Pemeliharaan dan perbanyakan Monascus purpureus c. Pembuatan kurva produksi spora Monascus purpureus d. Persiapan tepung biji durian sebagai substrat e. Persiapan medium fermentasi f. Persiapan inokulum spora Monascus purpureus Tahap Penelitian a. Fermentasi substrat dengan kapang Monascus purpureus b. Penghitungan absorbansi pigmen Monascus purpureus Analisis Data dan Penarikan Kesimpulan Penulisan Skripsi Gambar 3.8 Diagram alir penelitian