LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA LAPORAN III (DNA REKOMBINAN) KHAIRUL ANAM P051090031/BTK BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 0
DNA REKOMBINAN TUJUAN Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan memahami prinsip teknik teknologi DNA rekombinan. TINJAUAN PUSTAKA Elusi Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya. Fragmen DNA yang tidak tercampur dengan fragmen DNA lainnya diperoleh melalui beberapa tahap. Tahap pertama adalah pemisahan fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi atau hasil PCR, yang dilanjutkan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Tahap selanjutnya adalah mendeteksi fragmen yang akan diisolasi dan memotong gel agarose yang mengandung fragment tersebut. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara melewatkannya pada membran Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat. Sekarang telah banyak perangkat (kit) yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari gel agarose, antara lain: GFX TM PCR DNA dan Gel Band Purification Kit dari Amersham Pharmacia Biotech. Pada praktikum ini dilakukan isolasi DNA dari gel agarose dengan menggunakan metode yang relatif sederhana dan murah. Selain itu juga akan digunakan kit dari gel agarose dengan GFX TM PCR DNA dan Gel Band Purification Kit dari Amersham Pharmacia Biotech untuk memberi gambaran tentang penggunaan kit, walaupun dalam pelaksanaan praktikum ini kit yang digunakan adalah produk lain, namun prosedurnya memiliki kemiripan. Ligasi Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector pengklonan. Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors dan Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005). 1
Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert (fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen. Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli, diantaranya T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan pada E.coli DNA Ligase adalah NAD + (Muladno, 2002). Enzim ligase hanya dapat menggabungkan fragmen DNA yang mempunyai ujung tidak rata (sticky end) yang saling berkomplemen dan ujung rata (blunt end). Enzim ligase mengkatalisasi pembentukan ikatan kovalen antara gula dengan phosphate dari nukleotida yang berdekatan, yang menghendaki satu nukleotida mempunyai ujung 5 phosphate bebas dan nukleotida yang berdekatan mempunyai ujung 3 gugus hidroksil. Enzim ligase tidak membedakan DNA DNA dari organisme yang berbeda. Oleh karena itu, dua fragmen DNA dari organisme yang berbeda pun dapat digabungkan oleh enzim ini. Kedua fragmen ini kemudian menjadi satu molekul DNA yang disebut sebagai DNA rekombinan. DNA rekombinan ini tidak dapat dilihat keberhasilannya kecuali dengan memperbanyaknya di dalam sel inang. Proses ini disebut sebagai transformasi atau cloning gen (Barnum, 2005). Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan berkomplemen. Kecocokan yang sangat spesifik dibutuhkan bila fragmen DNA yang akan disambungkan mempunyai ujung tidak rata (sticky end), karena penyambungannya harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T berpasangan dengan A dan G berpasangan dengan C. Sedangkan fragmen DNA yang mempunyai ujung rata (blunt end) dapat disambungkan dengan sembarang fragmen DNA lain yang berujung rata. Oleh karena itu untuk mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik menggunakan ujung tidak rata sedangkan pengklonan DNA yang tidak memerlukan spesifikasi tertentu menggunakan ujung rata (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Transformasi Transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa fragmen DNA, baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel. Transformasi bakteri mula mula diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1982, berdasarkan kenyataan bahwa suatu bakteri dapat melepaskan fragmen DNA nya ke dalam suatu medium yang kemudian akan masuk ke dalam sel bakteri yang lain 2
dalam kultur tersebut. Di alam, fragmen DNA tersebut biasanya dilepaskan oleh sel bakteri yang mati atau mengalami autolisis. Namun, terdapat sel lain yang ternyata memang melepaskan fragmen DNA pada saat pertumbuhan karena adanya gen tra. Pada percobaan ini, akan dilakukan transformasi pada E. coli yang sensitif terhadap ampisilin dengan plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin. Jika transformasi yang dilakukan berhasil dengan baik, maka E. coli tersebut akan mengekspresikan gen resisten ampisilin sehingga dapat bertahan hidup pada media yang mengandung ampisilin. Polimerase Chain Reaction (PCR) PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dntps yang mencakup datp (nukleotida berbasa Adenine), dctp (nukleotida berbasa Cytosine) dan dttp (nukleotida berbasa Thymine) (Muladno, 2002). PCR adalah suatu metode yang menggunakan komponen komponen replikasi DNA untuk mereplikasi suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam tabung reaksi. Metode ini dikembangkan untuk mempercepat isolasi DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Dua primer oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit daerah DNA yang akan diamplifikasi. Primer menguatkan dan mencangkok target sequens, satu dari setiap strand dari double strand DNA molekul. Primer menetapkan limit daerah yang akan diamplifikasi dan DNA polymerase mereplikasi DNA diantara primer menggunakan empat deoksiribonukelotida (dgtp, datp, dctp, dttp) yang disediakan di dalam tabung reaksi dengan penambahan dntps. Di dalam sebuah siklus amplifikasi (=replikasi), DNA template didenaturasi pada temperature tinggi, annealing primer dilakukan dengan menurunkan temperature dan DNA polymerase memperpanjang DNA dari primer. Pengulangan siklus denaturasi, annealing primer, dan sintesis DNA menghasilkan DNA melalui amplifikasi secara eksponensial. Sekitar 25 sampai 40 siklus pada umumnya digunakan di dalam thermalcycler, yaitu sebuah instrumen yang secara otomatis mengontrol temperature dan waktu. Suatu DNA polymerase khusus Taq polymerase, yang diisolasi dari suatu bakteri thermofilik, Thermus aquaticus, yang hidup di hot spring yang stabil pada 3
temperature tinggi digunakan untuk mendenaturasi DNA template. Produk yang dihasilkan dari PCR dianalisa menggunakan elektroforesis gel agarose (Barnum, 2005). Beberapa komponen yang penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah : DNA target, primer, enzim Taq DNA polymerase, deoksinukleoside triphosphat dan larutan penyangga (buffer). Molekul DNA yang targetnya akan dilipatgandakan jumlahnya dapat berupa untai tunggal atau untai ganda. Jumlah yang digunakan dalam proses PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas hasil PCR, tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah cukup. DAlam menentukan jumlah ini, dapat pula dilakukan ujicoba dengan berbagai ukuran, misalnya 10, 100, atau 1000 pikogram sehingga diperoleh kualitas PCR yang paling baik. Apabila target yang digunakan berupa total DNA genom, sebaiknya DNA tersebut dipotong terlebih dahulu dengan enzim tertentu sehingga potongan DNA yang dihasilkan masih berukuran cukup besar, misalnya enzim Sal I atau Not I yang mempunyai sedikit situs pemotongan di dalam total DNA genom. Primer atau oligonukleotida sebaiknya berukuran paling pendek 16 basa dan biasanya berkisar antara 18 24 basa (Muladno, 2002). Restriksi Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik. Seperti diketahui, di dalam Bioteknologi terdapat dua kategori enzim yang berperan dalam proses rekombinasi DNA, yaitu enzim yang berperan dalam isolasi DNA dan penyiapan DNA rekombinan (di mana dua molekul DNA dikombinasikan). DNA spesifik atau gen diisolasi/diambil dari DNA dengan memotong sugar phosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber yang berbeda dicampur dan dikombinasi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya dua jenis enzim, yaitu: enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai gunting untuk memotong DNA pada situs spesifik dan DNA ligase yang berperan sebagai lem yang merekatkan dua molekul DNA di dalam tabung reaksi. Restriksi endonuklase memotong sugar phosphat backbone DNA pada kedua utasnya. Restriksi endonuklease mengenali urutan spesifik di dalam molekul DNA. Urutan yang spesifik tersebut pada umumnya terdiri dari 4 6 pasang basa dan bersifat palindromik (palindrom). Palindrom merupakan daerah yang memiliki urutan basa yang sama dengan utas pasangannya jika dibaca dari arah yang sama yaitu 5 3 (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempat tempat tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung 4
kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5 atau 3 ) menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut sticky (mudah lengket) atau kohesif (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Protolas Sel tanaman atau fungi pada umumnya dilindungi oleh dinding sel dari selulosa yang keras untuk menopang struktur tanaman atau fungi. Sel tanaman atau fungi yang telah kehilangan dinding selnya disebut dengan istilah protoplas. Protoplas dapat diisolasi dari berbagai macam jaringan ataupun organ tanaman seperti daun, tunas, akar, buah dan miselia fungi (Wikipedia, 2010). Transformasi DNA asing ke berbagai kapang berfilamen juga dapat dilakukan melalui transformasi protoplas yang ke dalamnya dimasukkan plasmid yang dapat memproduksi protein yang diinginkan. Gen gfp Tujuan dari pembuatan organisme transgenik yang dapat berpendar pada dasarnya adalah untuk pemantauan suatu proses eksperimen atau biokimia di dalam sel tubuh makhluk hidup. Untuk proses eksperimen rekayasa genetika misalnya, konfirmasi transformasi dan ekspresi suatu gen asing ke dalam sel inang sangatlah penting. Transformasi adalah proses memasukkan atau mencangkokkan gen asing ke dalam sel makhuk hidup lain, dapat berupa sel bakteri, ragi, tumbuhan, ataupun mamalia. Bagi para peneliti, sangatlah penting untuk dapat mengetahui dengan cepat, apakah proses transformasi itu telah berlangsung baik atau tidak, dan apakah gen target dapat diekspresikan tanpa masalah. Dari itu, di dalam molekuler biologi dikenal reporter gene atau gen pewarta. Yaitu gen yang dapat memberitahukan dengan jelas pada para peneliti bahwa proses transformasi telah berjalan dengan sukses. Gen yang menghasilkan protein yang dapat berpendar hijau atau Green Fluorosceint Protein (gfp) inilah yang banyak dipakai oleh para ilmuwan sebagai gen pewarta yang aslinya berasal dari ubur ubur laut. Gen asing target yang ingin dicangkokkan ke dalam suatu sel organisme biasanya digabungkan dengan gen gfp dalam bentuk gen kimera atau gen gabungan, sehingga nanti akan dihasilkan protein baru fungsional (yang menjadi sifat baru organism tersebut) dalam bentuk protein gabungan dengan 5
gfp. Jadi, jika gen yang digabung dengan gen pewarta berhasil masuk dan fungsional di dalam sel bakteri E. coli misalnya, maka sel E. coli yang berpendar hijau di kegelapan adalah bakteri transgenik yang fungsional yang membawa sifat baru. Proses penapisan klon transgenik yang positif menjadi lebih cepat dan mudah. Dibandingkan dengan gen pewarta lain yang kebanyakan enzim yang memerlukan substrat untuk menghasilkan warna atau pendar cahaya, gfp adalah gen pewarta yang menarik sekaligus mudah dalam hal visualisasi, karena untuk berpendar gfp sama sekali tak memerlukan substrat. gfp menghasilkan sinar hijau fluoresens secara instrinsik, ketika diberi sinar eksitasi pada panjang gelombang biru sekitar 395 nanometer. Jadi hanya dibutuhkan lampu UV gelombang panjang atau sinar biru untuk dapat mendeteksinya dalam kegelapan. gfp juga menjadi gen pewarta idola dalam hal pencitraan proses tracking atau lokalisasi suatu protein. Karena tidak perlu penambahan substrat dan mudah divisualisasi, GFP dapat diaplikasikan untuk memantau jejak protein, kapan dan dimana suatu gen terinduksi menjadi suatu protein, dalam kondisi sel masih hidup. Pada tumbuhan tembakau yang berpendar hijau misalnya. Gen gfp diekspresikan pada virus mosaik yang biasa menyerang tumbuhan tembakau. Banyak hal yang masih belum diketahui tentang interaksi virus ini dengan tembakau. Dalam proses terinfeksinya tembakau dengan virus ini sampai tembakau menjadi sakit lalu mati, para peneliti tanaman tidak mengetahui lokasi awal timbulnya virus dan penyebarannya. Dengan memasukkan virus mosaik yang mengekspresikan gfp, maka tempat penyebaran virus dapat terpantau hanya dengan membawa tanaman tembakau ini ke ruang gelap dan menyinarinya dengan lampu UV secara periodik. (Dr. Is Helianti, MSc) Mikroinjeksi Upaya meningkatkan laju pertumbuhan ikan dengan metode selective breeding telah berhasil dilakukan pada beberapa spesies ikan budidaya, namun diperlukan waktu yang lama untuk mendapatkan laju pertumbuhan yang diharapkan. Saat ini telah dikembangkan metode baru yang berpotensi menggantikan metode selective breeding, yaitu transgenesis, dengan mengintroduksikan gen ke embrio makhluk hidup dengan harapan bahwa gen tersebut akan diwariskan pada generasi berikutnya. Teknik yang umum digunakan dalam transgenesis adalah mikroinjeksi. Teknik mikroinjeksi dilakukan dengan cara menyuntikkan konstruksi gen ke dalam blastodisk telur yang sudah dibuahi dengan bantuan micromanipulator. Dengan teknik ini, gen diinjeksikan ke dalam embrio ikan pada fase 1 sel. 6
BAHAN DAN METODE KERJA Bahan Bahan yang digunakan adalah bakteri rekombinan hasil transformasi, X gal, IPTG, primer forward, primer reverse dan enzim restriksi. Metode Isolasi (Elusi) fragmen DNA plasmid dari gel agarosa Gel hasil elektroforesis plasmid dipotong pada bagian yang mengandung pita DNA yang sesuai dengan yang diinginkan, pemotongan dilakukan di atas transilluminator UV. Potongan gel dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian dipotong potong atau dicacah. Buat corong yang terbuat dari bagian eppendorf yang dasarnya telah dilubangi dan kemudian dilapisi membran nylon hybond untuk menyaring gel. Membran nylon dibasahi dengan 50 ul larutan penyangga elusi. Hasil cacahan gel dimasukkan ke dalam corong yang telah dilapisi membran nylon hybond. 150 ul larutan penyangga elusi ditambahkan melalui membran. Eppendorf disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4 C. 150 ul larutan penyangga elusi ditambahkan lagi lalu disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4 C. 150 ul larutan penyangga elusi ditambahkan lagi lalu diekstraksi cairannya dengan PCI sebanyak 1x volume supernatan. Larutan divorteks selama 1 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4 C. supernatan (fase atas dari hasil sentrifugasi) diambil, lalu larutan diendapkan dengan menambahkan 0,1 volume sodium asetat 3 M, ph 5 dan 2 3 volume etanol absolut). Pelet yang dihasilkan dibilas dengan etanol 70% lalu dikeringkan dengan vakum. Endapan disuspensikan dengan menambahkan 15 20 ul dh 2 0. Ligasi fragmen DNA (insert) dengan vektor 6 ul vektor P Gem T easy dengan Gen 6α sebanyak 7 ul, T4 ligase sebanyak 0,4 ul, buffer T4 ligase sebanyak 1,5 ul, dan dh 2 O hingga volume akhir mencapai 15 ul lalu diinkubasi pada suhu 4 0 C hingga akan dilakukan transformasi. Pembuatan bakteri kompeten Satu koloni bakteri E. coli (DH5α) diinokulasikan dengan menggunakan tusuk gigi steril ke dalam tabung reaksi berisi 2 ml media LB cair yang mengandung ampisilin. Bakteri diinkubasi selama satu malam pada suhu 37 C di dalam penggoyang (environmental shaker) pada 200 250 rpm, kemudian 100 ul biakan bakteri ditumbuhkan di dalam 10 ml LB atau SOB pada kondisi lingkungan yang sama dengan sebelumnya selama 2 3 jam hingga OD600 = 0,4 0,5. Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri lalu dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi dan diinkubasikan di dalam es selama 10 menit. Lalu dilakukan sentrifugasi 7
pada kecepatan 4000 g (3000 rpm) dengan swinging bucket rotor, 4 C, selama 10 menit. Cairan dibuang dan endapan bakteri disuspensikan dengan hati hati dalam 16,5 ml TB (transformation buffer; 3 g Pipes 10 mm, 2,2 g CaCl 2.2H 2 O, 18,2 g KCl 250 mm, 10,9 g MnCl2.4H 2 O 55 mm, 950 ml H 2 O, ph diatur 6.7 dengan KOH dan ditambah H 2 O hingga 1 l). Suspensi bakteri disimpan dalam es selama 10 menit kemudian disentrifus pada 3000 rpm (swinging bucket rotor), 4 C, selama 10 menit. Cairan dibuang, lalu endapannya disuspensikan dengan hati hati dalam 1,4 ml TB. Kemudian ditambahkan 100 ul DMSO dan segera disimpan dalam es selama 10 menit. Dalam keadaan dingin (4 C), 50 ul suspensi bakteri dimasukkan ke eppendorf dan disimpan dalam nitrogen cair. Setelah beku, disimpan dalam freezer 70 C. Pengecekan hasil ligasi dengan transformasi Sebanyak 10 ul (50 100 ng) DNA plasmid dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang berisi 50 ul sel bakteri kompeten yang tepat mencair. Setelah dihomogenkan, suspensi bakteri dipanaskan pada 42 C (heat shock) selama 45 detik dan segera dimasukkan kembali ke dalam es. Suspensi didiamkan dalam es selama 5 menit. Tabung eppendorf dipindahkan ke suhu ruang lalu ditambah dengan 100 ul media cair 2xYT. Eppendorf diinkubasikan di alat penggoyang pada 250 rpm, suhu 37C selama 30 menit 1 jam. Setelah inkubasi, suspensi bakteri diinokulasikan secara merata di atas media LB padat yang mengandung ampisilin. Sterilisasi batang kaca dilakukan dengan mencelupkan ke dalam alkohol kemudian membakarnya dengan api Bunsen dan didinginkan. Untuk menyeleksi adanya sisipan di dalam plasmid yang mengandung gen lacz, ditambahkan 0,1 M IPTG (10 ul/cawan) dan 2% X gal (50 ul/cawan) pada permukaan medium. Cawan diinkubasi pada incubator pada suhu 37 C dengan meletakkan cawan petri pada posisi terbalik (media di bagian atas). Bakteri yang mengandung plasmid yang tersisipi fragmen pada situs pengklonan di daerah lacz akan membentuk koloni berwarna putih, sedang bakteri yang mengandung plasmid yang tidak tersisipi fragmen akan menghasilkan koloni berwarna biru. Bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak akan membentuk koloni. Polimerase Chain Reaction Satu koloni putih yang tumbuh pada media LA, ampicilin, X gal, IPTG disuspensikan ke dalam tabung PCR yang telah berisi 8,5 µl ddh 2 O kemudian di kocok. Tusuk gigi yang digunakan untuk memindahkan bakteri ke dalam tabung PCR kemudian di goreskan kembali pada media baru sebagai stok. Tabung PCR kemudian diisi dengan campuran PCR yang terdiri dari 1 ul dntprimer 2 µm, 0,5 ul Primer F 10 µm, 0,5 ul Primer R 10 µm, 0,4 ul DMSO, 1 ul 10x Buffer Tag, 0,1 ul Tag DNA pol sehingga total larutan yang diperoleh adalah 3,5 ul. Lakukan PCR dengan kondisi Pra PCR pada suhu 94 o C selama 5 8
menit, denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik, annealing (penempelan) pada suhu 56 o C selama 30 detik, pemanjangan 72 o C selama 1,5 menit, pasca PCR 72 o C selama 5 menit, semua proses di atas dilakukan sebanyak 30 siklus selama 2,5 jam. Hasil PCR kemudian di elektroforesis selama 30 menit. Restriksi Restriksi dilakukan dengan menggunakan 2 ul plasmid (50 µg/ml), 2 ul 10x buffer Eco RI, 0,5 ul enzim EcoRI 10 U/ul dan 15,5 ul ddh 2 O, sehingga larutan sampel yang diperoleh adalah 20 ul di dalam masing masing tabung. Kemudian, larutan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 jam, kemudian di elektroforesis selama 30 menit. Transformasi gen gfp pada cendawan Isolasi protoplas Aspergillus niger (A. niger) Kultur miselia dari A. niger yang berumur 6 hari di saring dan masukkan ke dalam larutan enzim yang dan diinkubasi di dalam shkare berkecepatan 80 rpm pada suhu 37 C selama 5 jam. Larutan enzim berfungsi untuk memecah dinding sel fungi sehingga protoplas dari fungi dapat bebas. Purifikasi protoplas Kultur miselia dalam enzim disaring lalu dimasukkan ke dalam falkon, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1.500 rpm pada suhu 4 C selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan ditambahkan manitol ke dalam falkon sampai dengan 2 ml. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 1.500 rpm pada suhu 4 C selama 5 menit, setelah itu supernatan dibuang. Ke dalam falkon ditambahkan larutan HEPES KOH hingga volume 2 ml lalu disentrifugasi pada kecepatan 1.500 rpm pada suhu 4 C selama 5 menit. Pemberian HEPES KOH dilakukan 2 kali lalu disentrifugasi kembali dengan kondisi yang sama. Supernatant yang diperoleh dibuang lalu ke dalamnya ditambahkan larutan manitol 2 ml kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1.500 rpm pada suhu 4 C selama 5 menit. Supernatant yang diperoleh dibuang lalu ditambahkan manitol lagi hingga volume 2 ml, pelet diresuspensi dengan tips secara perlahan. Membuat Layer Masukkan ke dalam falkon sebanyak 4 ml larutan sukrosa 0,6 M dalam HEPES KOH. Secara perlahan lahan, sebanyak 2 ml suspensi protoplas manitol ditambahkan ke dalam larutan sukrosa. Falkon disentrifugasi pada kecepatan 500 rpm pada suhu 4 C selama 20 menit. Setelah disentrifugasi akan terbentuk dua bagian diaman bagian bawah adalah larutan sukrosa yang ditandai dengan adanya 9
buih atau gelembung pada dinding falkon dan bagian atas adalah manitol. Sebanyak kurang lebih 500 ul larutan diambil sebagai larutan yang mengandung protoplas pada bagian tengah dua layer yang terbentuk. Larutan protoplas kemudian ditambahkan manitol sebanyak 1x volume kemudian disimpan di dalam lemari es. Konsentrasi protoplas pada larutan manitol dhitung menggunakan hemositometer di bawah mikoskop cahaya. Transformasi 200ul protoplas (1,9 x 105 sel/ml) dimasukkan ke dalam falkon lalu ditambahkan ke dalamnya plasmid PCaMgfp sebanyak kurang lebih 10 ng/sel dan ditambahkan juga ke dalamnya sebanyak 50 ul PEG. Larutan diinkubasi di dalam es selama 20 menit, kemudian setelah itu ditambahkan lagi larutan PEG hingga mencapai volume 2 ml lalu larutan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 4 ml larutan yang mengandung KCl 0,7 M dan CaCl2 0,05 M ditambahkan ke dalam falkon lalu disentrifugasi pada kecepatan 3.000 rpm pada suhu 25 C selama 5 menit. Supernatant dibuang, lalu pelet diresuspensi menggunakan larutan yang mengandung KCl 0,7 M dan CaCl2 0,05 M sebanyak 400 ul. Larutan disebar pada media padat yang mengandung penanda seleksi hygromicin dengan konsentrasi 200 ug/ml. Hasil transformasi dilihat di bawah mikroskop fluorescence. Digunakan kontrol negative dan positif untuk mengetahui hasil transformasi. Introduksi gen gfp pada telur ikan (mikro injeksi) Prosedur kerja terdiri atas 4 tahap. Pertama adalah pemijahan buatan untuk mendapatkan telur yang dibuahi. Tahap kedua adalah proses mikroinjeksi dengan konsentrasi DNA gen gfp yang diinjeksikan sebesar 50 μg/ml KCl 0,1 M. Tahap ketiga adalah pemeliharaan benih hasil mikroinjeksi dalam akuarium. Tahap terakhir adalah analisa DNA dari ikan yang hidup hasil mikroinjeksi dan perlakuan kontrol, dengan melakukan ekstraksi DNA dari jaringan sirip ekor, dorsal, dan ventral menggunakan kit (Pure gene, USA). Hasil ekstraksi DNA digunakan sebagai cetakan dalam proses amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan primer Forward dari promoter ßactin ikan medaka dan primer tigh Reverse. Hasil PCR kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 0,7%. Setelah proses elektroforesis selesai, kemudian gel agarosa dipotret di bawah cahaya ultraviolet. Parameter yang diamati adalah derajat kelangsungan hidup embrio (DKHe) yang diamati pada saat embrio berumur 20 jam, derajat penetasan (DP), serta derajat kelangsungan hidup benih ikan pada hari ke 21 (DKH21). 10
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Setelah dilakukan restriksi untuk memotong gen dan vektor agar mempunyai ujung yang spesifik, dilakukanlah elektroforesis agar gen atau vektor yang diperoleh dapat diisolasi yang akan digunakan dalam proses ligasi. Gambar 1 adalah hasil dari elektroforesis proses restriksi yang nantinya pita tersebut akan dipotong untuk isolasi fragmen. A Gambar 1. Restriksi plasmid (A: vektor) Dari isolasi fragmen, dilakukan elusi agar DNA yang berupa vektor atau gen target yang sudah terpotong secara spesifik dapat dipisahkan dari gel agarose. Setelah dipisahkan, larutan hasil elusi kemudian kembali dielektroforesis untuk mengukur agar perbandingan vektor dan gen yang dibutuhkan tepat. 11
Gambar 2. Elusi plasmid Pada gambar 2 dapat diketahui bahwa gen yang terpotong ataupun vektor tidak terlihat, dalam arti elusi yang dilakukan tidak berhasil, gen target atau vektor masih banyak terikat pada gel. Dengan menggunakan vektor dan gen target yang telah disediakan oleh pihak laboratorium maka dilakukanlah ligasi dan transformasi. Dari hasil transformasi terbentuk koloni putih dan koloni biru. Seperti yang terlihat pada gambar 3. Gambar 3. Hasil transformasi Dari hasil transformasi, dilakukan cek untuk mengetahui apakah gen target terkandung di dalam plasmid yang ada pada bakteri yang tumbuh pada proses transformasi. 12
Gambar 4. Cek Transformasi Dilakukan cek terhadap hasil transformasi dengan menggunakan metode restriksi atau dengan metode PCR. Maka diperoleh tidak ada gen target yang tersisipi pada vektor (plasmid). Gambar 5. Cek Transformasi ulangan Pada praktikum dengan menggunakan protoplas sebagai sel inang dalam transformasi menggunakan plasmid yang telah disisipi oleh gen gfp (CaM gfp), dilakukan isolasi protoplas yang berasal dari miselia fungi, protoplas yang diperoleh seperti yang terlihat pada gambar 6. 13
Gambar 6. Protoplas Pada praktikum Introduksi gen gfp pada telur ikan dengan metode mikroinjeksi, diperoleh hasil proses introduksi dengan bantuan mikroskop pada perbesaran 100 kali. A B Gambar 6. Mikroinjeksi. A: blstodisk, B: mikromanipulator 14
Pembahasan Elusi Dari elusi yang dilakukan terhadap potongan vektor, dari hasil yang diperoleh tidak ada pita yang terbentuk sehingga vektor yang telah diisolasi dan kemudian dielusi tidak terlarutkan dan masih terikat pada gel. Hal ini mungkin disebabkan terlalu banyaknya gel yang terpotong ataupun banyak DNA dari vektor yang rusak akibat terlalu lama terkena sinar UV keika akan dipotong. Hal ini dapat diatasi dengan meminimalkan waktu pemotongan di atas transuliminator dan juga kuantitas gel dikurangi agar ketika dielusi dengan bufer, banyak dari gen yang ikut terelusi. Ligasi Untuk melakukan ligasi, pada umumnya dilakukan kuantifikasi terhadap gen yang diperoleh dari proses elusi untuk dapat mengoptimalkan proses ligasi dimana perbandingan antara vektor dan gen target adalah 1:3. Proses ligasi ini juga ditentukan oleh proses sebelumnya yaitu prose restriksi dengan enzim spesisfik. Pada praktikum kali ini digunakan enzim Eco RI yang bersifat sticky end sehingga vektor dan gen target dapat secara spesifik berikatan meskipun tetap ada peluang antara vektor dengan vektor berikatan, akan tetapi peluang tersebut tidaklah besar daripada ikatan vektor dengan gen target, karena ikatan vektor dengan vektor akan menghasilkan suatu plasmid yang besar dan akan sulit bila dilakukan transformasi. Penambahan gen target yang lebih banyak untuk memperbesar peluang gen target berikatan dengan vektor. Transformasi Proses transformasi terjadi ketika terjadi perubahan suhu yang amat mendadak, heat shock (dari suhu rendah, 4 C ke suhu yang lebih tinggi, 42 C) dengan bantuan ion kalsium. Ion kalsium berfungsi sebagai ion yang membantu terbukanya protein integral sebagai kanal ion yang dimanfaatkan sebagai tempat keluar masuknya plasmid ke dalam sel inang (bakteri E. coli). Waktu yang dibutuhkan adalah 45 detik, karena apabila terlalu lama ada kemungkinan plasmid yang telah masuk dapat keluar kembali. Hal ini tergantung dari prosedur tiap lab. Sel inang yang digunakan adalah sel inang yang diperoleh pada tahap logaritmik (log phase) karena pada tahap ini masih ada kesempatan bagi sel inang untuk membelah dan memperbanyak diri sehingga ada peluang bagi plasmid yang diperoleh menjadi lebih banyak sebelum disebar pada media. 15
Gambar 7. Kurva yang menggambarkan fase fase pertumbuhan bakteri; lag phase, log phase, stationary phase dan death phase. Dari hasil transformasi dapat dilihat dengan munculnya koloni putih dan biru pada media padat LA (Luria Bertani Agar) + 100 ug/ml ampisilin + 100 ul 0,1 M IPTG + 20 ul 50 mg/ml X Gal. Kontrol positif yang berupa sel kompeten yang diinokulasikan pada media LA saja ditumbuhi dengan koloni E. coli DH5α yang menunjukkan bahwa sel kompeten mampu tumbuh di media LA dan tidak terjadi kontaminasi. Sedangkan pada kontrol negatif yang berupa sel kompeten yang diinokulasikan pada media LA + ampisilin tidak ditumbuhi bakteri menunjukkan bahwa antibiotik yang digunakan masih berfungsi dengan baik. Hal ini terjadi karena E. coli DH5α tipe asli tidak mempunyai gen resisten terhadap ampisilin. Pada gambar 3 terlihat jelas terdapat koloni putih dan koloni biru. Koloni putih merupakan koloni E. coli DH5α yang tersisipi vektor PGEM T Easy + insert gen G α dari kedelai, sedangkan koloni biru merupakan koloni E. coli DH5α yang mungkin tersisipi oleh vektor PGEM T Easy namun tidak tersisipi insert gen G α dari kedelai, bisa terjadi karena kemungkinan kemungkinan yang terjadi pada proses ligasi, seperti vektor menyambung pada vektor itu sendiri atau vektor menyambung dengan vektor lain (terjadi ligasi antar vektor). Terbentuknya koloni putih biru menggunakan prinsip kerja gen LacZ yang mengekspresikan β galaktosidase. Pada vektor PGEM T Easy terdapat Multiple Cloning Site (MCS) yang di antaranya terdapat gen LacZ. Pada gen LacZ terdapat lokasi pemotongan enzim enzim restriksi tertentu. Insert gen G α dari kedelai, jika dapat tersisipkan pada vektor, akan merusak gen LacZ sehingga gen tersebut tidak dapat terekspresikan. Ekspresi gen LacZ ditunjukkan dengan terbentuknya enzim β galaktosidase yang dengan adanya inducer IPTG akan mengurai substrat X Gal sehingga terbentuk indol yang merubah warna koloni menjadi biru. Rusaknya LacZ akibat tersisipi oleh insert gen G α dari kedelai 16
menyebabkan tidak terbentuknya enzim β galaktosidase, sehingga X Gal tidak dapat terurai, indol tidak terbentuk, dan koloni tetap berwarna putih. Koloni putih yang tumbuh di dalam media kemudian disiolasi dan di cek keberhasilan transformasinya. Dengan menggunakan metode koloni PCR seperti yang terlihat pada gambar 4 dan 5, tidak terbentuk pita. Hal ini menandakan koloni putih yang terbentuk tidak atau hanya sedikit sekali mengandung plasmid yang tersisipi gen target. Dengan koloni PCR seharusnya pita yang menandakan gen target dapat terbentuk karena dalam proses amplifikasi dengan PCR menggunakan primer yang spesifik terhadap gen target sehingga apabila tidak terbentuk pita, maka dapat diasumsikan gen target yang tersisip di dalam plasmid berjumlah sedikit. Transformasi gen gfp pada cendawan Transformasi Pada media PDA + Hyg tidak ditumbuhi oleh koloni, yang seharusnya pada media ini A. niger, yang berasal dari protoplas yang telah dimasuki oleh plasmid target yang mengandung gen resisten terhadap antibiotik hygromicin, dapat tumbuh dan dapat memendarkan cahaya pada mikroskop fluorescence. Pada media PDA tanpa hygromicin juga tidak ditumbuhi koloni, yang seharusnya pada media ini dapat ditumbuhi koloni karena tersedianya nutrien untuk pertumbuhan bakteri dan media ini juga tidak ditambahkan agen seleksi antibiotik hygromicin sehingga fungi dapat tumbuh, meskipun fungi tidak memiliki plasmid. Tidak tumbuhnya fungi bisa dikarenakan jumlah protoplas yang terlalu sedikit sehingga peluang A. niger untuk tumbuh kecil, selain itu kemungkinan protoplas yang dimasuki plasmid juga semakin kecil sehingga kemungkinan tumbuhnya fungi yang mengandung gen gfp akan lebih kecil lagi. Kegagalan praktikum bisa dikarenakan kurang banyaknya miselia yang digunakan atau belum cukupnya umur kapang yang digunakan ketika mengisolasi protoplas. Introduksi gen gfp pada telur ikan (mikro injeksi) Dari praktikum ini diharapkan diperoleh sel telur yang terintroduksi oleh gen gfp. Introduksi gen gfp ini adalah tahap orientasi untuk mengetahui tingkat keberhasilan metode. Apabila sel telur berhasil berpendar ketika diperiksa di bawah mikroskop fluorescence, maka ada kemungkinan apabila sel telur diintroduksi menggunakan gen target lain, dapat berhasil dan ikut terbawa dalam genom ikan. 17
SIMPULAN Teknologi DNA rekombinan tidak hanya dilakukan pada sel prokariot akan tetapi bisa juga dilakukan pada sel eukariot bahkan dapat dilakukan pada organisme di tingkat yang lebih tinggi seperti hewan atau tumbuhan. Ada keuntungan dan tujuan tersendiri dalam memanfaatkan teknologi DNA rekombinan pada masing masing tipe sel dan organisme. DAFTAR ACUAN Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. Thomson Brooks/Cole, USA. 323 pages. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation, Bogor. 123 halaman. Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI DIKNAS, Bogor. Gunawan, B. K. 2008. Skripsi: Introduksi dan Persentase Ikan Yang Membawa Gen Gh Growth Hormone Ikan Nila Oreochromis Niloticus Pada Ikan Lele Dumbo Clarias Sp. Generasi F0. Program Studi Teknologi Dan Manajemen Akuakultur, Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor ishelianti.files.wordpress.com/2008/05/gfp.pdf http://id.wikipedia.org/wiki/protoplas 18