PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR (TPP 1207) Disusun oleh : Dosen Pengampu KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PURWOKERTO 2016
ACARA I MIKROORGANISME DARI BERBAGAI HABITAT A. Pendahuluan Di alam banyak dijumpai berbagai jenis dan spesies mikroba. Mikroba dapat hidup disemua tempat, dan penyebaran mikroba sangat luas. Penyebaran dan tempat tumbuh mikroba tergantung dari sifat dan persyaratan tumbuh mikroba yang bersangkutan. Setiap jenis maupun spesies mikroba mempunyai habitat yang berbeda dengan jenis dan spesies mikroba yang lain. Habitan tempat tumbuh mikroba misalnya di udara, dalam tanah, air, di tanaman, dalam makanan, dan bahkan di tubuh makhluk hidup yang lain. Untuk membuktikan bahwa mikroba terdapat di berbagai habitat, maka dari habitan tersebut diambil sampel dan selanjunya ditumbuhkan dalam suatu medium baik padat maupun cair. Untuk menumbuhkan mikroba dengan jenis yang berbeda, maka digunakan jenis medium yang berbeda pula. Medium yang digunakan adalah medium standar untuk pertumbuhan mikroba tertentu. Untuk menumbuhkan bakteri biasanya digunakan medium nutrien agar (NA), menumbuhkan kapang dengan medium potato dextrose agar (PDA), sedang untuk jenis khamir dengan medium malt ekstrak agar (MEA). B. Tujuan Membuktikan bahwa mikroba ada dimana-mana C. Bahan dan alat Bahan : media NA, PDA dan MEA Alat : cawan petri steril, lampu spiritus D. Prosedur 1. Mikroba dari udara a. Siapkan 3 cawan petri steril, dibuat 2 ulangan. 1
b. Medium yang sudah disterilkan dicairkan dalam penangas air, setelah mencair suhu dibiarkan turun hingga 45 50 o C. c. Tuang medium ke masing-masing cawan petri, setiap ulangan berisi medium NA, PDA dan MEA. d. Ratakan medium yang telah dituang dengan cara memutar-mutar cawan petri di atas meja, biarkan dingin dan memadat. e. Cawan petri pada ulangan 1 dibuka diudara terbuka selama 10 menit, sedang pada ulangan 2 tidak dibuka (sebagai kontrol). f. Cawan kembali ditutup dan selanjutnya diinkubasikan dengan cara cawan dibalik, inkubasi pada suhu ruang selama 2 x 24 jam. g. Amati mikroba yang tumbuh dan mikroba apa yang dominan tumbuh pada masing-masing medium (medium NA, PDA, dan MEA) serta gambarkan morfologi koloni (bentuk koloni). 2. Mikroba dari air a. Siapkan 3 cawan petri steril dan air yang akan diuji (air sumur/air sungai). b. Ambil sebanyak 1 ml air sampel teteskan ke dalam masing-masing cawan petri steril yang masih kosong, tutup kembali. c. Medium yang sudah disterilkan dicairkan dalam penangas air, setelah mencair suhu dibiarkan turun hingga 45 50 o C. d. Tuang medium ke masing-masing cawan petri steril, setiap cawan berisi medium NA, PDA dan MEA. e. Ratakan medium yang telah dituang dengan cara memutar-mutar cawan petri di atas meja, biarkan dingin dan memadat. f. Selanjutnya diinkubasikan dengan cara cawan dibalik, inkubasi pada suhu ruang selama 2 x 24 jam. g. Amati mikroba yang tumbuh dan mikroba apa yang dominan tumbuh pada masing-masing medium (medium NA, PDA, dan MEA) serta gambarkan morfologi koloni (bentuk koloni). 2
3. Mikroba dari tanah a. Siapkan 3 cawan petri steril dan tanah yang akan diuji. b. Ambil kira-kira 1 gram tanah dan larutkan dalam 5 ml larutan 0,85% NaCl steril. c. Pipet sebanyak 1 ml larutan tanah teteskan ke dalam masing-masing cawan petri steril yang masih kosong, tutup kembali. d. Medium yang sudah disterilkan dicairkan dalam penangas air, setelah mencair suhu dibiarkan turun hingga 45 50 o C. e. Tuang medium ke masing-masing cawan petri, setiap cawan berisi medium NA, PDA dan MEA. f. Ratakan medium yang telah dituang dengan cara memutar-mutar cawan petri di atas meja, biarkan dingin dan memadat. g. Selanjutnya diinkubasikan dengan cara cawan dibalik, inkubasi pada suhu ruang selama 2 x 24 jam. h. Amati mikroba yang tumbuh dan mikroba apa yang dominan tumbuh pada masing-masing medium (medium NA, PDA, dan MEA) serta gambarkan morfologi koloni (bentuk koloni). 4. Mikroba dari makanan a. Siapkan 3 cawan petri steril dan makanan yang akan diuji. b. Ambil kira-kira 1 gram makanan dan larutkan dalam 5 ml larutan 0,85% NaCl steril. c. Pipet sebanyak 1 ml larutan makanan teteskan ke dalam masing-masing cawan petri steril yang masih kosong, tutup kembali. d. Medium yang sudah disterilkan dicairkan dalam penangas air, setelah mencair suhu dibiarkan turun hingga 45 50 o C. e. Tuang medium ke masing-masing cawan petri, setiap cawan berisi medium NA, PDA dan MEA. f. Ratakan medium yang telah dituang dengan cara memutar-mutar cawan petri di atas meja, biarkan dingin dan memadat. 3
g. Selanjutnya diinkubasikan dengan cara cawan dibalik, inkubasi pada suhu ruang selama 2 x 24 jam. h. Amati mikroba yang tumbuh dan mikroba apa yang dominan tumbuh pada masing-masing medium (medium NA, PDA, dan MEA) serta gambarkan morfologi koloni (bentuk koloni). 4
ACARA II ISOLASI BAKTERI A. Pendahuluan Di alam mikroba pada umumnya berada dalam keadaan tercampur, antara bakteri, kapang dan yeast dan juga antar spesies mikroba yang sejenis. Untuk mendapatkan mikroba secara murni (spesies tunggal) maka perlu mengisolasinya. Ini berarti bahwa spesies tersebut harus dipisahkan dari kelompok mikroba atau spesies yang lainnya. Sel mikroba sangat kecil, sehingga apabila diinginkan untuk diambil satu sel dari suatu kelompok mikroba sangat sulit dan memerlukan peralatan yang mahal. Untuk mengatasi hal tersebut dapat dilakukan dengan menumbuhkan campuran sel pada suatu medium padat di dalam cawan petri. Dengan cara ini setiap sel akan tumbuh membentuk koloni, sehingga memudahkan untuk memisahkannya. Cara dalam isolasi dilakukan dengan metode tuang (pour plate) dan dilanjutkan metode goresan (streak plate) dan diakhiri dengan membuat kultur simpanan pada agar miring (slant culture) untuk mikroba aerob dan agar tegak (stab culture) untuk mikroba anaerob. Metode tuang dimaksudkan untuk menyebarkan campuran mikroba dari bahan yang mengandung mikroba. Dari mikroba yang tumbuh, diambil satu koloni yang selanjutnya digoreskan pada agar dalam cawan untuk memisahkan sel-sel mikroba yang barangkali masih ada jenis atau spesies mikroba yang berbeda. Hal tersebut biasanya dilakukan lebih dari satu kali sampai diperoleh koloni yang murni yang berasal dari satu jenis mikroba dan spesies yang sama. Suatu hal yang menguntungkan adalah bahwa setiap mikroba yang berbeda sifat genetiknya akan membentuk koloni dengan karakter yang berbeda, baik ukuran, bentuk maupun warna koloni. Yang perlu diperhatikan adalah koloni yang akan diambil harus terpisah dari koloni lainnya. Ini berarti bahwa hasil goresan yang baik adalah yang dapat menghasilkan koloni-koloni terpisah dengan jarak lebih dari 2 mm, sehingga mudah diambil. 5
B. Tujuan Mempelajari dan mempraktekan beberapa tahapan dalam isolasi mikroba. C. Bahan dan alat 1. Medium NA. 2. Sampel sebagai sumber mikroba. 3. Alat : cawan petri steril, tabung reaksi, jarum ose, lampu spiritus. D. Prosedur 1. Metode tuang (pour plate) a. Siapkan medium NA steril dengan suhu sekitar 45 50 o C. b. Siapkan cawan petri steril yang masih kosong, teteskan ke dalam cawan 1 ml akuades steril, tetesan diusahakan di tengah cawan. c. Ambil 1 ose bakteri (dari Acara I dalam medium NA) masukkan dalam cawan petri dan campurkan dengan akuades yang sudah diteteskan. d. Tuang medium NA ke dalam cawan, ratakan. e. Bungkus cawan petri dan inkubasikan selama 2 hari dalam posisi terbalik. 2. Metode goresan (streak plate) a. Siapkan medium NA steril dengan suhu sekitar 45 50 o C. b. Tuangkan medium ke dalam cawan petri steril, ratakan dan biarkan dingin dan memadat. c. Ambil 1 ose bakteri (dari Acara I dalam medium NA) goreskan pada permukaan agar dalam cawan petri, selama menggores tutup cawan dibuka secukupnya. d. Salah satu cara menggoreskan mikroba pada agar cawan adalah goresan kuadran. Cawan petri dibagi menjadi 4 bagian, goreskan sebanyak 3 baris pada ¼ bagian pertama. Kemudian goresan berikutnya pada ¼ bagian kedua sebanyak 3 baris menyambung goresan yang pertama, dimana akhir goresan pertama digunakan sebagai awal goresan kedua, demikian seterusnya sampai ¼ bagian keempat. 6
e. Setiap akan digunakan jarum ose dicelupkan dalam alkohol dan dipijarkan, kemudian didinginkan dengan cara ditusukan pada bagian pinggir agar dalam cawan. Demikian pula jika goresan pindah dari bagian pertama ke bagian berikutnya. f. Kemudian cawan petri dibungkus dan selanjutnya diinkubasikan selama 2 hari. 3. Agar miring (slant culture) a. Siapkan medium agar miring steril dalam tabung reaksi. b. Ambil 1 ose bakteri yang telah murni (ambil koloni yang terpisah dari lainnya) goreskan secara zig-zag pada permukaan agar. Goresan dimulai dari ujung tabung (bagian bawah) sampai akhir medium (bagian atas), tabung reaksi ditutup kembali dengan kapas dan plastik. c. Inkubasikan selama 2 hari. 4. Agar tegak (stab culture) a. Siapkan medium agar tegak steril dalam tabung reaksi. b. Ambil 1 ose bakteri dan tusukan ke dalam agar sepanjang kira-kira ¾ bagian. Jarum ose yang digunakan yang ujungnya runcing. Tabung reaksi ditutup kembali dengan kapas dan plastik. c. Inkubasikan selama 2 hari. Pengamatan : amati pertumbuhan mikroba pada berbagai metode dan gambarkan morfologi koloni. 7
ACARA III PENGECATAN GRAM PADA BAKTERI A. Pendahuluan Pengecatan pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga yaitu : 1) pengecatan sederhana, 2) pengecatan diferensial, dan 3) pengecatan struktural. Pengecatan sederhana yaitu pengecatan pada sel dengan hanya menggunakan satu macam zat warna dan proses pengecatan juga hanya satu tahap. Pengecatan ini ditujukan untuk mengamati bentuk sel dengan mewarnai seluruh sel. Pengecatan diferensial menggunakan kombinasi zat warna, hal ini berkaitan dengan perbedaan kimia antar sel. Pengecatan ini mewarnai seluruh sel dari bakteri tipe tertentu. Yang termasuk pengecatan ini adalah pengecatan Gram. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai bagian tertentu dari sel. Tujuan pengecatan ini adalah untuk membedakan bagian-bagian dari sel, contohnya pengecatan pada endospora, flagela, kapsul, dsb. Pengecatan Gram termasuk pengecatan diferensial karena dapat digunakan untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan dari dua kelompok bakteri tersebut disebabkan oleh perbedaan lapisan dinding selnya. Pada bakteri Gram positif menunjukkan warna biru-ungu, sedang bakteri Gram negatif berwarna merah. Dalam pewarnaan diperlukan empat macam reagen, yaitu : 1). Zat warna utama yaitu kristal violet, 2). Mordan adalah senyawa yang digunakan untuk mngintensifkan warna utama yaitu berupa larutan Iodin, 3). Reagen untuk pencuci/ peluntur zat warna adalah pelarut organik yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama, reagen tersebut adalah alkohol atau aseton, dan 4). Zat warna kedua yaitu safranin, digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol. B. Tujuan Untuk menentukan Gram positif dan Gram negatif pada bakteri yang di uji. C. Bahan dan alat 1. Biakan murni Bacillus subtilis dan Eschericia coli. 8
2. Reagen kristal violet, larutan Iodin, etanol 95%, dan safranin. 3. Peralatan : gelas benda dan gelas penutup, pipet tetes, lampu spiritus, mikroskop. D. Prosedur 1. Bersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol sampai bebas lemak dan debu. Ambil kultur bakteri dalam medium cair menggunakan pipet, teteskan diatas gelas benda ± 3 tetes, biarkan agak mengering. 2. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api, sampai mengering. 3. Teteskan pewarna kristal violet dan biarkan selama 1 menit. Cuci dengan air mengalir dan kering anginkan. 4. Tetesi dengan beberapa tetes larutan iodin, biarkan selama 1 menit. Cuci dengan air mengalir dan kering anginkan. 5. Miringkan gelas obyek, cuci dengan etanol selama 20 30 detik atau sampai warna biru tidak luntur lagi. 6. Teteskan cat penutup safranin, biarkan selama 2 menit. Cuci dengan air mengalir dan kering anginkan. 7. Tutup bagian yang ada preparatnya dengan gelas penutup. Amati hasil pengecatan dibawah mikroskop menggunakan lensa obyektif minyak imersi. Catat hasil pengecatan Gram (+ atau -), catat pula bentuk sel dan ciri-ciri yang lain (cara pengelompokan) misalnya sel tunggal, berpasangan, membentuk rantai atau bergerombol. 9
ACARA IV PENGHITUNGAN KOLONI BAKTERI A. Pendahuluan Metoda yang dapat digunakan untuk menentukan jumlah mikroba di dalam bahan pangan antara lain metoda hitungan cawan, metoda MPN (Most Probable Number) dan penghitungan secara langsung dengan mikroskop. Prinsip dari metoda hitungan cawan adalah menumbuhkan mikroba yang masih hidup pada medium agar, sel akan tumbuh dan berkembang biak membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Satu koloni diasumsikan tumbuh dari satu sel. Jumlah koloni yang tumbuh pada setiap cawan petri yang memenuhi syarat untuk penghitungan yaitu antara 30 300, karena jumlah tersebut secara statistik memberikan akurasi yang baik. Pada bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel per ml atau per gram, maka perlu dilakukan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1 : 10 (10-1 ), 1 : 100 (10-2 ), 1 : 1000 (10-3 ), 1 : 10000 (10-4 ) dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengenceran sebaiknya memiliki sifat osmotik yang sama dengan mikroba atau dapat mempertahankan keseimbangan ion-ion dari mikroba. Hal ini disebabkan supaya selama dalam pengenceran tidak terjadi kerusakan sel, juga dijaga supaya tidak terjadi perbanyakan sel. Larutan pengencer yang biasanya digunakan adalah bufer fosfat, larutan garam fisiologis (0,85%) atau 0,1% larutan pepton water. Jumlah koloni bakteri dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: 1 Jumlah koloni = jumlah koloni dalam cawan x ----------------------------- (per ml bahan) faktor pengenceran B. Tujuan Menghitung jumlah koloni bakteri menggunakan metode hitungan cawan. 10
C. Bahan dan alat 1. Kultur bakteri dalam medium cair 2. Larutan 0,85% NaCl 3. Medium NA 4. Alat : tabung reaksi, cawan petri, pipet ukur 1 ml D. Prosedur 1. Siapkan larutan pengencer dan beri label sesuai dengan pengenceran yang ditetapkan yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5 masing-masing ditandai dengan A, B, C, D dan E. 2. Ambil dengan pipet sebanyak 1 ml kultur bakteri yang akan dihitung dan masukkan ke dalam tabung A, kocok perlahan supaya tercampur merata. 3. Ambil dengan pipet yang berbeda sebanyak 1 ml kultur bakteri pada tabung A dan masukkan ke dalam tabung B, kocok perlahan. Lakukan hal yang sama sampai ke tabung E, dan setiap memindahkan kultur dalam pengenceran ini menggunakan pipet yang berbeda. 4. Siapkan cawan petri steril dan medium NA yang siap dituang (suhu sekitar 45 50 o C). 5. Lakukan penanaman (plating) kultur bakteri yang sudah diencerkan pada medium agar dari tabung dengan pengenceran tinggi. 6. Ambil masing-masing sebanyak 1 ml kultur dalam tabung C, D dan E dan teteskan ke dalam cawan petri steril yang masih kosong. Ke dalam cawancawan tersebut tuang medium NA, goyangkan/putar-putar cawan agar bakteri tersebar merata. 7. Inkubasikan pada suhu 37 o C selama 2 hari. Pada akhir inkubasi hitung jumlah koloni bakteri dalam cawan, pilih cawan petri yang memenuhi syarat perhitungan koloni. Jumlah bakteri dalam sampel dapat dihitung menggunakan rumus. 11
ACARA V AKTIVITAS MIKROBA A. Pendahuluan Aktivitas mikroba diartikan sebagai kegiatan yang berkaitan dengan pertumbuhan, perkembang biakan dan pembentukan sel-sel baru. Semua aktivitas sel tersebut dilakukan oleh berbagai enzim yang terdapat dalam sel mikroba. Untuk berlangsungnya aktivitas tersebut, sel mikroba akan menggunakan komponen-komponen dalam lingkungannya (substrat/medium) sebagai sumber enersinya. Jika di dalam substrat terdapat senyawa sederhana seperti monosakarida, asam amino atau asam lemak, maka mikroba langsung dapat menggunakannya. Namun jika di dalam medium dimana mikroba tumbuh terdapat senyawa makromolekul seperti polisakarida, protein dan lemak, maka untuk dapat menggunakan senyawa-senyawa tersebut mikroba akan mengeluarkan enzim untuk mendegradasi makromolekul menjadi molekul yang sederhana. Berlangsungnya reaksi-reaksi oleh enzim tersebut dapat diketahui dengan berbagai cara, diantaranya dengan melihat produk akhir dari reaksi enzim tersebut atau dihasilkannya senyawa hasil aktivitas enzim. Karbohidrat merupakan sumber enersi utama bagi kebanyakan mikroba. Masing-masing mikroba berbeda dalam kemampuannya menggunakan berbagai karbohidrat, dan dalam caranya memecah karbohidrat. Misalnya, metabolisme glukosa akan dihasilkan berbagai asam organik seperti asam asetat, asam laktat maupun asam organik yang lain. Demikian juga dari pemecahan glukosa tersebut ada yang dihasilkan gas (metana, hidrogen, karbon dioksida) atau tidak. Hasil akhir pemecahan karbohidrat tersebut dapat dilihat melalui berbagai pereaksi. Terbentuknya asam dapat diketahui dengan terjadinya perubahan ph medium, hal ini dapat diketahui dengan menambahkan indikator pada medium sebelum dilakukan inokulasi, sedang dihasilkannya gas dapat ditampung menggunakan tabung Durham. Misal indikator Bromo Thymol Blue, dalam kondisi basa berwarna biru, sedang dalam kondisi asam berubah menjadi kuning. 12
Seperti juga pemecahan pada makromolekul misalnya pati oleh enzim amilase dapat diketahui dengan menambahkan larutan yod pada akhir inkubasi. Jika berwarna biru disekitar koloni berarti pati belum dihidrolisis oleh enzim, tetapi apabila disekitar koloni nampak zona jernih dan tidak berwarna, maka mikroba telah menghidrolisis pati dengan enzim amilase (mikroba mengeluarkan enzim amilase). Sedang untuk pengujian hidrolisis protein biasanya digunakan medium skim milk agar, jika disekitar koloni mikroba tampak jernih berarti terjadi hidrolisis pada protein. B. Tujuan Mempelajari aktivitas mikroba dalam pemecahan mono dan disakarida, polisakarida (pati) serta polipeptida (protein). C. Bahan dan alat 1. Medium cair yang mengandung glukosa, fruktosa, sukrosa dan laktosa serta indikator bromo thymol blue. 2. Medium padat : medium agar pati dan skim milk agar, larutan yod. 3. Kultur murni Bacillus subtilis dan E. coli 4. Jarum ose, lampu spiritus D. Prosedur 1. Uji pemecahan mono dan disakarida a. Siapkan medium cair dalam tabung reaksi yang berisi glukosa, fruktosa, sukrosa dan laktosa yang telah diberi indikator dan tabung Durham, masing-masing dua ulangan. b. Pada masing-masing tabung diinokulasikan dengan 1 ose kultur murni B. subtilis dan E. coli. c. Inkubasikan selama 2 hari. d. Amati perubahan yang terjadi, jika menghasilkan asam-asam organik akan terjadi perubahan warna biru menjadi kuning, terbentuknya gas dapat diamati dalam tabung Durham. 13
2. Uji hidrolisis pati a. Siapkan medium agar pati yang telah dicairkan dalam penangas air dan suhunya turun menjadi 45 50 o C, tuang ke dalam cawan petri steril, ratakan dan dinginkan supaya memadat. b. Buat garis dibagian bawah cawan, membagi menjadi dua bagian. c. Ambil 1 ose B. subtilis dan 1 ose E. coli yang masing-masing digoreskan pada ½ bagian cawan petri (bentuk goresan lurus, panjang 2 cm). d. Inkubasikan selama 2 hari. e. Amati adanya zona jernih dengan meneteskan larutan yod pada sekitar koloni bakteri. 3. Uji hidrolisis protein a. Siapkan medium skim milk agar yang telah dicairkan dalam penangas air dan suhunya turun menjadi 45 50 o C, tuang ke dalam cawan petri steril, ratakan dan dinginkan supaya memadat. b. Buat garis dibagian bawah cawan, membagi menjadi dua bagian. c. Ambil 1 ose B. subtilis dan 1 ose E. coli yang masing-masing digoreskan pada ½ bagian cawan petri (bentuk goresan lurus, panjang 2 cm). d. Inkubasikan selama 2 hari. e. Amati adanya zona jernih di sekitar koloni bakteri. 14
15