LAPORAN BIOKIMIA KI 3161 Percobaan 1 REAKSI UJI TERHADAP ASAM AMINO DAN PROTEIN Nama : Ade Tria NIM : 10511094 Kelompok : 4 Shift : Selasa Siang Nama Asisten : Nelson Gaspersz (20512021) Tanggal Percobaan : 17 September 2013 Tanggal Pengumpulan : 24 September 2013 LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2013
REAKSI UJI TERHADAP ASAM AMINO DAN PROTEIN I. Tujuan - Menentukan hasil uji reaksi terhadap protein dan asam amino dari albumin dan gelatin dengan uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji Ninhidrin, uji Biuret, pengandapan dengan logam, pengendapan dengan garam, dan denaturasi protein. II. Teori Dasar Asam amino adalah molekul organik yang mengandung gugus karboksil (-COOH) dan gugus amino (-NH 2 ). Pada asam amino, gugus amino terikat pada atom karbon yang berdekatan dengan gugus karboksil (C-α) atau dapat dikatakan juga bahwa gugus amina dan gugus karboksil dalam asam amino terikat pada atom karbon yang sama. Rantai samping atau gugus R dapat membuat asam amino bersifat asam, basa, hidrofilik (polar), dan hidrofobik (nonpolar). Sifat kimia suatu asam amino dapat diramalkan berdasarkan sifat kimia gugus R-nya dengan reaksi menggunakan reagen-reagen tertentu. Protein adalah polimer asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Protein merupakan makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme. Struktur protein terdapat 4 macam, yaitu primer, sekunder, tersier, dan kuarterner. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen, dan beberapa mengandung sulfur, serta fosfor. III. Data Pengamatan a) Uji Asam Amino (Percobaan 1-4) Jenis Uji Millon Hopkins- Cole Ninhidrin Hasil Pengamatan Albumin Terbentuk endapan merah dan gel putih di bagian atas. Gelatin Warna larutan merah kejinggaan. Albumin Terbentuk 2 fasa. Fasa bawah : kuning, Fasa atas : gel putih. Setelah + H 2 SO 4 : terbentuk cincin ungu di antara 2 fasa. Gelatin Terbentuk 2 fasa. Albumin Larutan berwarna biru keunguan (setelah dipanaskan). Negatif. Gelatin Larutan tidak mengalami perubahan.
Reaksi Sistein & Sistin Sistein Sistin Larutan membentuk 2 fasa. Fasa atas berwarna merah keunguan (setelah ditambahkan NH 4 OH) yang lama-kelamaan berubah menjadi kuning kehijauan. Fasa bawah bening. Larutan berwarna hitam (setelah dipanaskan). b) Uji Protein (Percobaan 5 8) Jenis Uji Biuret Pengendapan dengan Logam Pengendapan dengan Garam Denaturasi Protein Hasil Pengamatan Larutan menjadi ungu (setelah ditambahkan CuSO 4 ) HgCl 2 : Terbentuk 2 fasa. Fasa bawah : membentuk gel putih. Pb-asetat : Larutan membentuk gel putih. Filtrat : Larutan menjadi biru keunguan Endapan : Warna putih kekuningan. Saat penambahan air endapan tidak larut. Warna berubah menjadi merah keorenan (Setelah ditambah reagen millon) Sebelum dipanaskan : Semua larutan bening Setelah dipanaskan : Tabung HCl dan Tabung Buffer terdapat gel putih. Tabung NaOH tetap bening. Pada suhu kamar : tidak terjadi perubahan. Setelah penambahan buffer : Tabung HCl membentuk 2 fasa. Bawah : endapan putih, Atas : larutan buffer. Tabung NaOH membentuk gel berwarna putih IV. Pembahasan Pada percobaan kali ini dilakukan uji terhadap asam amino dan protein. Uji yang dilakukan pada asam amino adalah uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji Ninhidrin, dan reaksi Sistin dan Sitein. Untuk uji yang dilakukan untuk mengecek keberadaan protein adalah uji Biuret, pengendapan dengan logam, pengendapan dengan garam, dan denaturasi protein. Bahan atau sampel utama yang diuji adalah albumin dan gelatin.
Albumin adalah segala jenis protein monomer yang larut dalam air dan larutan garam, dan mengalami koagulasi saat terpapar panas. Substansu yang mengandung albumin, seperti putih telur (albuminoid). Sedangkan gelatin adalah derivat protein dari serat kolagen yang ada pada kulit, tulang, dan tulang rawan. Susunan asam aminonya hampir mirip dengan kolagen, dimana glisin sebagai penyusun 2/3 asam amino utama dan 1/3 asam amino yang tersisa diisi oleh prolin dan hidroksiprolin. Untuk uji yang pertama yang dilakukan dalam percobaan ini adalah uji Millon. Reagen Millon adalah larutan merkuri dan ion merkuro yang terlarut dalam asam nitrat dan asam nitrit. Ketika ditambahkan pada asam amino akan terbentuk gel (endapan) putih, yang berubah warna menjadi merah saat dipanaskan (garam merkuri dan tirosin yang ternitrasi). Perubahan warna ini dapat terjadi jika asam amino yang diuji memiliki gugus fenol (seperti Tirosin). Pada percobaan yang dilakukan didapatkan hasil positif pada gelatin dan albumin. Perubahan warna terjadi dari bening menjadi merah kejinggaan pada gelantin dan pada albumin terbentuk endapan merah dan gel putih di bagian atas. Uji yang kedua yaitu uji Hopkins-Cole. Reagen pada uji ini mengandung asam glioksilat (CHO-COOH) dan serbuk magnesium dalam air. Asam amino yang dapat memberikan uji positif dengan reagen ini adalah Triptofan. Gugus aldehid dari asam glioksilat akan berkondensasi dengan Triptofan. Asam kuat (H 2 SO 4 ) ditambahkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Dan terbentuk cincin ungu di antara kedua fasa pada larutan. Pada percobaan, didapatkan hasil positif pada albumin. Larutan albumin dan gelatin membentuk 2 fasa. Pada albumin terdapat cincin ungu di antara kedua fasa, sedangkan pada gelantin tidak terdapat cincin ungu dan larutan tetap bening. Uji Ninhidrin adalah uji yang dilakukan selanjutnya. Uji ini dapat dilakukan untuk menguji keberadaan asam amino. Ketika larutan yang mengandung asam amino dipanaskan, maka akan terjadi perubahan warna menjadi ungu (violet). Uji ini memberikan hasil positif untuk albumin maupun gelatin. Namun, pada percobaan ini didapatkan hasil negatif pada gelatin. Hal ini dapat dikarenakan
Selanjutnya adalah reaksi Sistin dan Sistein. Reaksi Sistein bereaksi spesifik untuk mengetahui gugus sulfuhidril. Reaksi sistein (reaksi Nitroprusida) yang terjadi adalah sebagai berikut. [Fe 3+ (CN 5 NO) 2- + NH 3 + RSH NH 4+ [Fe 2+ (CN 3 NOSR) 2 Warna Salmon Warna Merah Warna merah salmon terbentuk antara natrium nitroprusida dalam amoniak. Pada percobaan, warna salmon berubah menjadi merah. Namun, warna yang dihasilkan lama kelamaan berubah menjadi hijau kekuningan hingga kuning. Reaksi ini memberikan hasil positif, atau dapat diartikan bahwa pada sistein terdapat gugus sulfuhidril. Sistin adalah sistein-sistein yang saling berikatan. Reaksi Sistin bereaksi spesifik untuk mengetahui ikatan disulfida. Pada Sistin digunakan NaOH dan Pb-asetat. Pada reaksi yang dilakukan pada percobaan didapatkan larutan berubah dari bening menjadi hitam. Warna hitam yang terbentuk dikarenakan Pbasetat bereaksi dengan Sulfur dari ikatan disulfida yang putus dan membentuk PbS (hitam). Selanjutnya, uji protein yang dilakukan adalah uji Biuret. Uji positif dengan reagen Biuret akan memberikan warna ungu (violet). Uji didasarkan pada pembentukan kompleks Cu 2+ dengan gugus -CO dan NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Dari percobaan, didapatkan hasil positif pada larutan albumin yang mengalami perubahan warna menjadi ungu.
Pada Pengendapan dengan Logam, setelah penambahan Pb-asetat dan HgCl 2 tetes demi tetes, protein akan mengendap karena kelarutan protein dalam larutan logam tersebut terbatas. Pada percobaan, dari kedua larutan yaitu Pb-Asetat dan HgCl 2 didapatkan endapan putih. Namun, terdapat perbedaan di antara kedua larutan. Di atas endapan HgCl 2 didapatkan cairan bening, sedangkan pada Pb-Asetat endapan putih yang terbentuk bercampur dengan cairan sehingga larutan terlihat keruh. Selain itu, juga dilakukan Pengendapan dengan Garam. Garam-garam anorganik dapat mengendapakan protein karena kemampuan ion garam terhidrasi sehingga berkompetisi dengan protein untuk mengikat air. Hasil dari percobaan adalah pada larutan albumin ditambahkan (NH 4 ) 2 SO 4 hingga jenuh sehingga terbentuk endapan asam amino sulfat. Penambahan ini membuat protein mengalami peristiwa salting-in. Salting-in dilakukan dengan menambahkan garam yang tidak jenuh atau pada konsentrasi rendah sehingga protein menjadi bermuatan dan larut dalam larutan garam. Kelarutan protein akan terus meningkat sejalan dengan peningkatan konsentrasi garam, apabila konsentrasi garam ditingkatkan terus, maka kelarutan protein akan turun, pada konsentrasi garam yang lebih tinggi, protein akan mengendap. Penyaringan dilakukan sehingga didapatkan endapan dan filtrat. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam air untuk menguji kelarutannya. Dari perlakuan ini, terlihat bahwa endapan tidak terlarut dalam air. Peristiwa ini dikenal dengan salting-out. Hal ini terjadi karena proses persaingan antara garam dan protein untuk mengikat air. Grup ion pada permukaan protein menarik banyak molekul air dan berikatan dengan sangat kuat. Endapan dalam air yang terbentuk diuji dengan reagen Millon dan didapatkan hasil positif. Endapan mengalami perubahan warna menjadi merah setelah dilakukan pemanasan. Pada filtrat yang diperoleh diuji dengan reagen Biuret. Dari uji ini juga didapatkan hasil postif. Warna filtrat berubah dari bening menjadi ungu (violet). Uji terakhir yang dilakukan dalam percobaan ini adalah Denaturasi Protein. Dari hasil percobaan didapatkan larutan Buffer dan larutan HCl membentuk gel atau endapan putih setelah dipanaskan, sedangkan larutan NaOH tetap bening. Pada larutan basa, tidak terbentuk endapan protein. Hal ini disebabkan karena ukuran ion OH - dari NaOH jauh lebih besar dari ion H + sehingga ion OH - sulit untuk memutuskan ikatan peptida sehingga diperlukan konsentrasi yang lebih tinggi bila digunakan untuk memutuskan ikatan peptida
tersebut. Selanjutnya, setelah ditambahkan Buffer pada larutan NaOH dan larutan HCl, kedua larutan membentuk endapan. Namun, pada HCl terbentuk 2 fasa, yaitu di bagian bawah endapan putih dan larutan buffer bening di bagian atas. Sedangkan pada NaOH, larutan buffer bercampur dengan endapan putih yang terbentuk sehingga larutan menjadi keruh. V. Simpulan Dari uji asam amino dan protein yang dilakukan didapatkan hasil uji adalah sebagai berikut. 1. Pada gelantin didapatkan hasil positif pada uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji Ninhidrin, sedangkan pada albumin hasil uji positif didapatkan pada uji Millon dan Hopkins-Cole. 2. Pada sistin dan sistein didapatkan hasil positif pada reaksi sistin dan sistein. 3. Dari hasil uji Biuret, Pengendapan dengan Logam, Pengendapan dengan Garam, dan Denaturasi protein didapatkan hasil positif dan disimpulkan bahwa albumin mengandung protein. Jenis Uji Millon Hopkins- Cole Ninhidrin Reaksi Sistein & Sistin Kesimpulan Albumin Terbentuk endapan merah dan gel putih di bagian atas. Gelatin Warna larutan merah kejinggaan. Albumin Terbentuk 2 fasa. Fasa bawah : kuning, Fasa atas : gel putih. Setelah + H 2 SO 4 : terbentuk cincin ungu di antara 2 fasa. Gelatin Terbentuk 2 fasa. Albumin Larutan berwarna biru keunguan (setelah dipanaskan). Negatif. Gelatin Larutan tidak mengalami perubahan. Larutan membentuk 2 fasa. Fasa atas berwarna merah keunguan (setelah ditambahkan Sistein NH 4 OH) yang lama-kelamaan berubah menjadi kuning kehijauan. Fasa bawah bening. Sistin Larutan berwarna hitam (setelah dipanaskan).
Biuret Pengendapan dengan Logam Pengendapan dengan Garam Denaturasi Protein Larutan menjadi ungu (setelah ditambahkan CuSO 4 ) HgCl 2 : Terbentuk 2 fasa. Fasa bawah : membentuk gel putih. Pb-asetat : Larutan membentuk gel putih. Filtrat : Larutan menjadi biru keunguan Endapan : Warna putih kekuningan. Saat penambahan air endapan tidak larut. Warna berubah menjadi merah keorenan (Setelah ditambah reagen millon) Sebelum dipanaskan : Semua larutan bening Setelah dipanaskan : Tabung HCl dan Tabung Buffer terdapat gel putih. Tabung NaOH tetap bening. Pada suhu kamar : tidak terjadi perubahan. Setelah penambahan buffer : Tabung HCl membentuk 2 fasa. Bawah : endapan putih dan Atas : larutan buffer. Tabung NaOH membentuk gel berwarna putih VI. Daftar Pustaka Lehninger, A. L. 1982. Principles of Biochemistry (Terjemahan oleh Maggy Thenawidjaya). Jakarta: Erlangga. Mathews, C. K. dan Holde, K. E. 1990. Biochemistry. Redwood City, USA: The Benjamin/ Cummings Publishing Co. http://www.askiitians.com/iit-jee-carbohydrates-amino-acids-peptides/tests-of-proteins/, diakses tanggal 21 September 2013 pukul 21.25 WIB. http://www.emeraldinsight.com/journals.htm?articleid=866373&show=html, diakses tanggal 22 September 2013 pukul 14.41 WIB. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1264467/pdf/biochemj01024-0075.pdf, diakses tanggal 22 September 2013 pukul 15.50 WIB. http://www.chem.ucalgary.ca/courses/351/carey5th/ch27/ch27-3-3.html, diakses tanggal 22 September 2013 pukul 16.41.
VII.Lampiran 1) Uji Millon (Setelah dipanaskan) 2) Uji Hopkins-Cole Albumin - Gelatin Albumin Gelatin Albumin Gelatin 3) Uji Ninhidrin (Setelah dipanaskan) Gelatin - Albumin Albumin - Gelatin
4) Reaksi Sistein dan Sistin Sistein Sistin Sebelum dipanaskan Setelah dipanaskan 5) Uji Biuret
6) Pengendapan dengan Logam 7) Pengendapan dengan Garam Pb-asetat - HgCl 2 Filtrat (Setelah ditambahkan reagen Biuret) Endapan Setelah ditambah air dan reagen Millon Setelah dipanaskan
8) Denaturasi Protein Sebelum penambahan buffer Setelah penambahan buffer Buffer NaOH HCl Buffer NaOH HCl