3 Metode Penelitian 3.1 Alat Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah peralatan gelas standar meliputi: labu erlenmeyer, cawan petri, gelas ukur, gelas kimia, botol reagen, tabung reaksi, batang pengaduk, pipet seukuran, dan pipet tetes (Pyrex, Germany, Duran Schott); jarum ose; tabung mikrosentrifuga volume 1,5 dan 0,5 ml (Eppendorf); pipet mikro berbagai ukuran antara lain 0,5-10 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl, beserta tipnya. Penyiapan reagen-reagen untuk ph tertentu dilakukan dengan menggunakan phmeter (Expandomatic IV, Beckman). Pengukuran masa zat-zat kimia dilakukan dengan menggunakan neraca analitik (E. mettler, Switzeerland). Sterilisasi bahan-bahan dan peralatan gelas tahan panas dilakukan dengan menggunakan autoclave (H 7101, China). Pembuatan media, inokulasi bakteri, dan pekerjaan lainnya yang membutuhkan lingkungan steril dilakukan di dekat nyala api yang telah disterilisasi dengan menyemprotkan larutan etanol 70% atau di dalam ruang laminar. Inkubasi biakan sel media padat dilakukan di dalam inkubator suhu 30 o C (Fisher 503 ). Inkubasi biakan sel media cair dilakukan menggunakan shaking incubator (Dubnoff GCA). Penyimpanan biakan yang memerlukan suhu 4 o C ditempatkan dalam refigerator. Penyimpanan protein dilakukan pada suhu -20 o C di dalam Freezer (Kelvinator). Homogenisasi kultur sel dan larutan dilakukan dengan vortex (Fisher Vortex Genie). Pengukuran dan pengujian aktivitas protein dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Hitachi, Model 100-60). Pemisahan sel dari suspensi dan pengendapan protein dari larutan dilakukan dengan menggunakan sentrifuga. Pemisahan pada suhu kamar dilakukan dengan menggunakan mikrosentrifuga (Beckman Microfuge ETM). Amplifikasi 16s rdna (PCR) dilakukan dengan menggunakan Bio-Rad Gene Cycler TM. 14
3.2 Zat Kimia Zat kimia yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: amilopektin, aquabides,aquades, asam suksinat, basa tris, etanol 95%, glisin, cibacron brilliant red 3b-a, coomasie brilliant blue R250, asam suksinat, glisin, basa tris, asam dinitrosalisililat (DNS), gliserol 87%, isopropanol, CaCl 2, NaOH, NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4, HCl, I 2, KI, K-Na tartrat, soluble starch, pati kentang (Avebe, The Netherlands), pati jagung (HONIG), pati beras dan pati singkong (Rosebrand), pati sagu (Papua), dan bahan kimia lainnya yang biasa digunakan untuk isolasi protein dan karakterisasi protein. 3.3 Bakteri dan Media Pertumbuhan Bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah bakteri yang diisolasi dari Danau Kakaban, Kalimantan Timur. Media pertumbuhan untuk bakteri tersebut adalah Marine Broth (MB) cair (pepton 0,25% (b/v), ekstrak ragi 0,05% (b/v)) yang mengandung 0,05% (b/v) pati. Marine Broth padat dibuat dengan menambahkan 1% (b/v) pati dan 2% (b/v) bakto agar ke dalam Marine Broth cair. Pelarut yang digunakan adalah campuran air laut dan aquades dengan perbandingan 1:1. Pembuatan stok gliserol dilakukan dengan mencampurkan 850 μl kultur cair dan 150 μl gliserol 87% di dalam tabung mikro steril. Stok gliserol disimpan pada suhu -70 o C. 3.4 Pembuatan Red Amylopectine Sejumlah 12,5 gram amilopektin dilarutkan dalam 250 ml aquabides. Campuran tersebut dipanaskan dan diaduk hingga homogen. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 30 ml larutan NaOH 4 M dan 2,5 gram cibacron brilliant red 3b-a. Selanjutnya larutan tersebut ditambah HCl 4 M hingga ph larutan mencapai ph 7,0. Ke dalam larutan tersebut ditambah 500 ml etanol 95% (sedikit demi sedikit) sehingga terbentuk endapan berwarna merah muda. Endapan yang diperoleh diresuspensi dengan 200 ml aquabides. Ke dalam larutan homogen tersebut ditambah 500 ml etanol 95% hingga diperoleh kembali endapan. Endapan ini diresuspensi dengan 200 ml aquabides dan disterilisasi. 15
3.5 Penapisan Aktivitas α Amilase Penapisan aktivitas -amilase dilakukan dengan teknik degradasi red amylopectine. Isolat bakteri dari Danau Kakaban diremajakan dengan menumbuhkannya ke dalam media MB padat yang mengandung red amylopectine 0,02% (v/v). Peremajaan bakteri tersebut dilakukan dengan cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri pada media padat yang telah disiapkan dalam cawan petri steril. Media yang sudah diinokulasi tersebut diinkubasi pada suhu 30 o C sehari semalam. Hasil penapisan aktivitas α-amilase positif ditunjukkan dengan adanya warna terang dengan latar belakang merah di sekitar kultur bakteri. 3.6 Penapisan Aktivitas α Amilase Pendegradasi Pati Kentang Penapisan aktivitas -amilase dilakukan dengan teknik pembentukan kompleks pati-iodin. Isolat bakteri dari Danau Kakaban diremajakan dengan menumbuhkannya ke dalam media MB padat yang mengandung pati kentang 0,05% (v/v). Peremajaan bakteri tersebut dilakukan dengan cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri pada media padat yang telah disiapkan dalam cawan petri steril. Media yang sudah diinokulasi tersebut diinkubasi pada suhu 30 o C sehari semalam. Hasil penapisan aktivitas α-amilase positif ditunjukkan dengan adanya daerah terang dengan latar belakang biru/ungu di sekitar kultur bakteri. Pada penapisan aktivitas -amilase pendegradasi pati kentang ini digunakan pati kentang terlarut dan pati kentang mentah. 3.7 Sterilisasi pati Sebanyak 5 gram pati direndam dalam etanol 70% selama 15 menit. Suspensi tersebut didekantasi hingga tersisa pati yang masih basah. Pati tersebut dikeringkan dalam oven 70 o C selama sehari semalam. Pati yang sudah kering disterilisasi dengan radiasi sinar ultraviolet selama 30 menit. Pati yang telah steril disimpan pada wadah steril bertutup. 3.8 Penentuan jenis pati penginduksi α amilase Salah satu isolat bakteri dari Danau Kakaban yang mempunyai aktivitas α-amilase diinokulasi pada 2 ml media MB cair dan diinkubasi dalam shaking incubator pada 30 o C, 150 rpm sehari semalam. Kultur bakteri tersebut kemudian dipindahkan sebanyak 15 (v/v) 16
ke dalam 25 ml MB cair yang mengandung 0.05% (b/v) dari jenis pati yang berbeda (beras, jagung, kentang, sagu, dan singkong). Sampel diinkubasi dalam shaking incubator pada 30 o C, 150 rpm sehari semalam. Media MB yang sudah diinkubasi sehari semalam, disentrifugasi pada 7000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan α- amilase ekstraseluler yang selanjutnya digunakan pada uji aktivitas α-amilase dengan metode Fuwa. 3.9 Isolasi dan Produksi α Amilase Salah satu isolat bakteri dari Danau Kakaban yang menunjukkan aktivitas α-amilase diinokulasi pada 2 ml media MB cair dan diinkubasi dalam shaking incubator pada 30 o C, 150 rpm sehari semalam. Kultur bakteri tersebut kemudian dipindahkan sebanyak 15 (v/v) ke dalam 25 ml MB cair yang mengandung 0.05% (b/v) pati beras. Sampel diinkubasi dalam shaking incubator pada 30 o C, 150 rpm sehari semalam. Kultur yang sudah diinkubasi sehari semalam, disentrifugasi pada 7000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan -amilase ekstraseluler dan selanjutnya digunakan untuk analisis zimogram, SDS-PAGE, uji aktivitas α-amilase dan uji kadar protein total dengan menggunakan metode Bradford. 3.10 Fraksinasi Amonium Sulfat dan Dialisis Sebanyak 150 ml α-amilase ekstraseluler dimasukkan gelas kimia 500 ml. Ke dalam gelas kimia tersebut dimasukkan 56 gram (NH 4 ) 2 SO 4 sedikit demi sedikit hingga semua garam larut dan homogen dengan melakukan pengadukan menggunakan magnetic stirer. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi pada 4 o C, 10.000 rpm selama 15 menit. Pelet enzim yang diperoleh diresuspensi dengan larutan bufer Tris-Cl 50 mm ph 7,0 dan dimasukkan pada membran selofan untuk dilakukan dialisis. Dialisis dilakukan dengan merendam suspensi enzim tersebut pada larutan bufer Tris-Cl 5 mm ph 7,0. Larutan bufer dialisis diganti setiap satu jam sekali hingga semua enzim terbebas dari amonium sulfat. 3.11 SDS-PAGE dan Analisis Zimogram Sebanyak 5 μl sampel protein enzim dicampur dengan 20 μl bufer sampel SDS 5X (250 mm bufer Tris-Cl ph 6,8, 10% (b/v) SDS, 0,5% (b/v) bromfenol biru dan 50% (v/v) gliserol). Campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur pada stacking gel SDS-PAGE 5% 17
yang telah disiapkan. Elektroforesis gel SDS-PAGE dijalankan pada 150V, 400 ma selama 60 menit. Running buffer yang digunakan pada elektroforesis SDS-PAGE terdiri dari 3,03 g basa Tris, 18,8 g glisin dan 1 g SDS di dalam satu liter aquades (Running buffer 1X). Analisis zimogram dilakukan setelah protein enzim dielektroforesis pada 10% gel SDS- PAGE. Gel SDS-PAGE hasil elektroforesis dicuci tiga kali dengan aquades selama 30 menit kemudian direndam dalam larutan 1% pati terlarut dan diinkubasi pada 50 o C selama 30 menit. Aktivitas α-amilase ditandai dengan munculnya pita bening dengan latar belakang biru/ungu pada gel setelah penambahan larutan KI/I 2. 3.12 Uji Aktivitas α Amilase Pendegradasi Pati Kentang Aktivitas α-amilase ditentukan dengan metode Fuwa (Fuwa, 1954). Sebanyak 50 μl larutan pati kentang 0,125% ditambah 50 μl larutan enzim, lalu diinkubasi pada 30 o C selama 10 menit. Reaksi enzimatis dihentikan dengan penambahan 100 μl HCl 0,1 M. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 100 μl larutan KI/I 2 dan 700 μl larutan bufer Tris-Cl 50 mm ph 7,0. Larutan divorteks dan diukur serapannya pada λ 600. Pada pengujian ini juga digunakan enzim yang diinaktivasi sebagai kontrol. Aktivitas α-amilase juga ditentukan dengan Uji DNS. Sebanyak 50 μl larutan pati kentang 0,125% ditambah 50 μl larutan enzim, lalu diinkubasi pada 30 o C selama 10 menit. Reaksi enzimatis dihentikan dengan penambahan 100 μl reagen DNS. Campuran tersebut diinkubasi pada 100 o C selama 10 menit. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 800 μl larutan bufer Tris-Cl 50 mm ph 7,0. Larutan divorteks dan diukur serapannya pada λ 500. Untuk pembuatan kurva standar digunakan larutan glukosa dengan konsentrasi 10-100 mg/l. 3.13 Penentuan ph Optimum Penentuan ph optimum dilakukan dengan uji DNS. Sebanyak 50 μl pati kentang terlarut 0,125% dalam bufer universal (ph 3,0 s.d ph 10,0) ditambahkan dengan 50 μl larutan enzim, lalu diinkubasi pada 50 o C selama 10 menit. Reaksi enzimatis dihentikan dengan penambahan 100 μl reagen DNS. Campuran tersebut diinkubasi pada 100 o C selama 10 menit. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 800 μl aquades. Larutan divorteks dan diukur serapannya pada λ 500. 18
3.14 Pengaruh Konsentrasi Garam terhadap Aktivitas α Amilase Pengaruh konsentrasi garam terhadap aktivitas α-amilase dilakukan dengan metode Fuwa. Sebanyak 50 μl larutan pati 0,125% (b/v) yang mengandung NaCl ataupun CaCl 2 dengan rentang konsentrasi 0-1500 mm ditambah 50 μl larutan enzim, lalu diinkubasi pada 30 o C selama 10 menit. Reaksi enzimatis dihentikan dengan penambahan 100 μl HCl 0,1 M. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 100 μl larutan KI/I 2 dan 700 μl larutan bufer Tris-Cl 50 mm ph 7,0. Larutan divorteks dan diukur serapannya pada λ 600. Sebagai kontrol digunakan enzim yang diinaktivasi dengan penambahan HCl 1 M terlebih dahulu. 3.15 Identifikasi Isolat Bakteri Danau Kakaban Pada identifikasi ini dilakukan beberapa tahap, antara lain isolasi DNA kromosom, amplifikasi gen 16S rdna dengan PCR dan penentuan urutan nukleotida 16S rdna. Identifikasi bakteri juga dilakukan dengan pengujian morfologi dan fisiologi isolat tersebut. 3.15.1 Isolasi DNA kromosom Isolat bakteri dari Danau Kakaban diinokulasi pada 1 ml media MB cair dan diinkubasi pada 30 o C, 150 rpm sehari semalam. Setelah itu, media tersebut disentrifuga pada 13000 rpm selama 5 menit. Pelet yang diperoleh diresuspensi dengan 480 μl EDTA 50 mm, 120 μl lisozim (10 mg/ml) dan diinkubasi pada 37 o C selama satu jam. Larutan resuspen disentrifugasi pada 13000 rpm 4 o C selama 2 menit dan diambil peletnya. Pelet tersebut dilarutkan kembali dengan penambahan 600 μl nucleic lysis dan diinkubasi pada suhu 80 o C selama lima menit. Setelah didinginkan pada temperatur kamar, larutan tersebut ditambah 200 μl protein precipitation solution dan dicampurkan pada kecepatan tinggi selama 20 detik (vorteks, Fisher Vortex Genie). Hasilnya diinkubasi dalam es selama lima menit dan disentrifugasi pada 13000 rpm 4 o C selama 3 menit. Supernatan yang diperoleh, dimasukkan kedalam tabung mikro yang mengandung 600 μl isopropanol. Supernatan tersebut diresuspensi dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama dua menit, diambil peletnya. Pelet tersebut ditambahkan 600 μl etanol 70% pro-analisis dan dicampur dengan baik. Campuran disentrifugasi pada 13000 rpm 4 o C selama 2 menit dan dibuang supernatannya. Pelet dikeringkan pada kertas penyerap selama 10-30 menit. Kedalam pelet tersebut ditambahkan 100 μl DNA rehydration dan diinkubasi pada 65 o C selama 60 menit. Sebanyak 5 μl larutan DNA tersebut dicampur dengan 1 μl loading 19
buffer dan disuntikkan pada sumur gel agarosa 1% yang mengandung etilen bromida (EtBr). Elektroforesis gel agarosa dijalankan pada 400 ma, 55 V selama 30 menit. 3.15.2 Amplifikasi gen 16s rdna Amplifikasi gen 16s rdna dilakukan dengan Polymeration Chain Reaction (PCR). Amplifikasi tersebut terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama adalah denaturasi DNA. Denaturasi dilakukan pada 94 o C selama tujuh menit. Amplifikasi dilanjutkan dengan penempelan primer pada templat DNA. Tahap ini sering dikenal dengan annealing. Primer yang digunakan terdiri dari primer maju (B8F, GGTTACCTTGTTACGACTT) dan primer mundur (1492R, AGAGTTTGATCATGGCTCAG). Pada tahap annealing ini suhu diturunkan sampai 48 o C. Suhu dinaikkan kembali pada 72 o C untuk tahap elongasi. Hasil amplifikasi gen diidentifikasi dengan elektroforesis gel agarosa. 3.15.3 Pemurnian Gen dan penentuan urutan nukleotida Pemurnian gen dengan metode GFX digunakan untuk memurnikan gen hasil amplifikasi dengan PCR. Sampel gen hasil PCR ditambah larutan bufer DF dengan perbandingan 1:5. Campuran tersebut dimasukkan pada kolom DF dan dilakukkan sentrifugasi pada 13.000 rpm selama 30 detik. Kedalam campuran dimasukkan 600 μl larutan bufer pencuci dan dilakukan sentrifugasi pada 13.000 rpm selama 30 detik dan disentrifugasi lagi selama 2 menit. Kolom Df dipindah ke tabung mikro yang baru. Ke dalam kolom DF dimasukkan 50 μl ddh 2 O, dibiarkan selama 2 menit dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 2 menit. Urutan nukleotida ditentukan dengan metode dye-end terminator oleh MACROGEN-Korea. 3.15.4 Penentuan Hubungan Kekerabatan Penentuan hubungan kekerabatan dilakukan dengan menggunakan program BLAST. Hasil penentuan urutan nukleotida gen pengkode 16S rdna dimasukkan ke dalam program BLAST. Hasil penjajaran dari program ini akan menghasilkan urutan nukleotida dari jenis bakteri lain yang sudah ada di NCBI yang memiliki kemiripan cukup tinggi. 20