BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan Bahan yang digunakan memiliki kualitas pro analisis atau pro biologi molekular, yaitu : primer M. tuberculosis forward: 5 GGATCCGATGAGCAAGCTGATCGAA3 (Proligo) dan primer M. tuberculosis reverse: 5 GAATTCCTTTTGCGTCTGCTGACC3 (Proligo), Taq DNA polimerase (MD Bio), buffer Taq (MD Bio), deoksinukleotida trifosfat dntp (MD Bio), MgCl 2 (MD Bio), air suling atau air suling ganda, kit GFX TM( (Amersham), agarosa (Boehringer Mannhein), larutan dapar TAE (Tris base, EDTA, asam asetat glasial), etidium bromida (Merck), T4 DNA ligase (Amersham), dapar ligase (Amersham), vektor pgem-t Kit (Promega), media M9 (natrium fosfat (Merck), kalium fosfat (Merck), natrium klorida (Merck), ammonium klorida (Merck), bakto agar (Difco, magnesium fosfat (Merck), kalsium klorida (Merck), glukosa (Merck)) mengandung vitamin B1 (media Luria Bertani (ekstrak ragi (Difco), tripton (Difco), NaCl (Merck)), bakto agar (Difco), ampisilin (Indofarma), X-gal (Sigma), IPTG (Sigma), asam etilen diamin tetraasetat (EDTA) (Merck), sodium dodesil sulphate (SDS) (Merck), natrium asetat (Merck), natrium hidroksida (Merck), sukrosa (Merck), enzim restriksi EcoRI dan BamHI (Roche), CaCl 2 (Merck), Tris-Cl (Merck), etanol absolut (Merck), marka DNA 1kb (MD Bio) dan High Speed Plasmid Mini Kit (Geneaid). 3.2 Alat Bunsen, inkubator 37 o C, sentrifuga (Mikro 200R Hettich), tabung mikrosentrifuga (Eppendorf) 100 ul, 500 ul dan1,5 ml, neraca timbang (Mettler Toledo, PB303), inkubator goyang, vortex, Thermal cycler (Applied Biosystem), jarum ose, pinset, elektroforesis DNA (Tipe EPS 200 Pharmacia Biotech), laminar air flow (the Germfree Laboratries Inc, model BBF6 S/N 6C-15-B-4119, USA), pipet mikro, oven pengering (Heraus, tipe B 5402), otoklaf (All American Model 25X Amerika), sarung tangan, tip, water bath, lampu ultraviolet (UVP model R-25G), DNA Sequencer automatic, dan peralatan gelas laboratorium mikrobiologi. 12
13 3.3 Mikroba Bakteri yang digunakan adalah Mycobacterium tuberculosis dan Escherichia coli JM109. 3.4 Amplifikasi DNA Pengkode Chaperonin 60.1 Proses amplifikasi DNA pengkode chaperonin 60.1 dilakukan dengan metode polymerase chain reaction (PCR). Sebelumnya disintesis 1 pasang primer pada ujung 5 primer forward ditambah dengan urutan DNA yang dikenali oleh enzim restriksi BamHI (5 GGATCCG3 ) dan pada ujung 5 primer reverse ditambahkan urutan DNA yang dikenali oleh enzim restriksi EcoRI (5 GAATCC3 ). Perancangan primer dilakukan dengan menggunakan program primer select di DNA Star. Untuk mengetahui primer tersebut menempel pada gen lain pada M. tuberculosis maka digunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Proses amplifikasi dioptimasi berupa variasi suhu penempelan primer, konsentrasi ion Mg 2+, konsentrasi primer, konsentrasi dntp dan Taq polimerase yang digunakan pada setiap reaksi. Proses amplifikasi melibatkan 3 tahap secara berurutan yaitu tahap denaturasi awal (94 o C, 5 menit, 1 siklus), denaturasi (94 o C, 1 menit), tahap penempelan primer (55, 56, 57, 58, 59 dan 60 o C selama 30 detik dan tahap pemanjangan fragmen DNA (72 o C, 1 menit) sebanyak 25 siklus dan tahap pemanjangan akhir fragmen DNA (72 o C, 5 menit, 1 siklus). Variasi kondisi dan komposisi PCR dapat dilihat pada Tabel 1. Produk PCR kemudian dikarakterisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% dalam dapar TAE (Tris base, EDTA, asam asetat glasial) 1X dibandingkan dengan marka DNA 1 kilobasa (kb).
Tabel 3.1 Variasi Kondisi dan Komposisi PCR PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Cetakan DNA (nanogram) 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 Primer Forward (pikomol) 30 30 30 30 30 30; 15 ; 7,5 30; 15 ; 7,5 30 30 Primer Reverse (pikomol) 30 30 30 30 30 30; 15 ; 7,5 30; 15 ; 7,5 30 30 MgCl 2 (mm) 2;3;4;5 2;3;4;5 2;3;4;5 2 2 2 2 2 2 dntp (mm) 1 1 1 1 ; 0,8; 0,6 1 1 1 1 1 Taq DNA Polimerase (Unit) 1,5 1,5 1,5 1,5 0,5 ; 1; 1,5 1 1 1 1 Suhu penempelan ( C) 55 56 57 57 57 57 58 59 60
15 3.5 Pemurnian DNA Pengkode Chaperonin 60.1 Hasil PCR Menggunakan Kolom GFX TM Produk PCR dimurnikan menggunakan kolom GFX TM sesuai protokol kit GFX TM. Kolom GFX ditempatkan di atas tabung pengumpul dan ditambahkan 500 μl dapar penjerat lalu produk PCR dimasukkan ke kolom GFX dan dicampur dengan cara di pipet naik turun. Kolom berisi campuran kemudian disentrifuga pada 13.000 rpm selama 30 detik selanjutnya ditambahkan 500 μl dapar pencuci ke dalam kolom dan disentrifuga pada kondisi sama. Kolom GFX ditempatkan di atas tube 1,5 ml. Matriks pada kolom GFX dielusi dengan 50 μl aquabidest steril dan diinkubasi selama satu menit pada suhu kamar, kemudian disentrifuga pada 13.000 rpm selama satu menit. Larutan hasil pemurnian pada tabung Eppendorf 1,5 ml kemudian dikarakterisasi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% b/v dalam dapar TAE 1X. Hasil elektroforesis diwarnai dengan etidium bromida kemudian pita DNA divisualisasi dibawah sinar ultra violet dan jarak migrasi pita DNA dibandngkan dengan marka 1 kilo basa (kb). 3.6 Ligasi DNA Pengkode Chaperonin 60.1 ke Vektor Kloning pgem-t Produk PCR yang telah dimurnikan diligasikan ke vektor pgem-t, menggunakan enzim T4 DNA ligase. Sebanyak 50 ng vektor pgem-t, 1 μl T4 DNA ligase (3 unit/μl), DNA sisipan dan 5 μl Dapar ligase 2X dicampur. Proses ligasi dilakukan pada suhu 4 o C selama 24 jam. Tabel 3.2 Jumlah DNA Yang Disisipkan Untuk Reaksi Ligasi Perbandingan jumlah DNA Jumlah DNA yang disispkan (ng) terhadap vektor 1 : 1 27,82 3 : 1 83,45 6 : 1 166,9 8 : 1 222,53 16 : 1 445,06 3.7 Transformasi pgem-t rekombinan yang mengandung DNA Pengkode Chaperonin 60.1 ke E. coli JM 109 Plasmid hasil ligasi kemudian ditransformasi ke E. coli JM 109 kompeten yang telah diberi perlakuan khusus yang disebut sel kompeten. Proses transformasi dilakukan dengan metode heat shock. Escherichia coli JM 109 dikultur pada media padat M9 yang
16 mengandung vitamin B1 dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 o C. Satu koloni tunggal disuspensikan ke dalam medium 5 ml cair Luria Bertani (LB) dan diinkubasi pada 37 o C, 150 rotasi per menit (rpm) semalam. Sebanyak 500 L kultur dimasukkan ke 10 ml media cair LB, diinkubasi pada 37 o C, 150 rpm hingga mencapai OD 600 0,3-0,4. Kultur disentrifuga pada 4500 rpm selama 5 menit. Pelet diresuspensi dalam 500 L larutan CaCl 2 0,1 M dingin kemudian disentrifuga pada 4500 rpm selama 5 menit. Pelet diresuspensi dalam 50 L CaCl 2 0,1 M dingin, lalu larutan diinkubasi dalam es selama semalam. Semua pengerjaan dilakukan secara aseptik. Sebanyak 4 L hasil ligasi dimasukkan ke 200 L sel kompeten. Sebagai kontrol positif digunakan pgem-t tanpa DNA sisipan, dan sel kompeten tanpa plasmid digunakan sebagai kontrol negatif. Campuran kemudian diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Selanjutnya dilakukan transformasi dengan metode heat shock pada suhu 42 o C selama 90 detik. Setelah itu campuran diinkubasi dalam es selama 20 menit, baru ditambah 800 L media LB cair suhu ruang dan diinkubasi pada 37 0 C, 150 rpm selama 2 jam. Suspensi bakteri disebarkan pada media LB padat yang mengandung ampisilin (0,1 mg/ml), 50 L X-gal 20 mg/ml, dan 100 L IPTG 100 mm, kemudian diinkubasi pada 37 0 C satu malam. 3.8 Karakterisasi pgem-t Rekombinan Plasmid pgemt rekombinan diisolasi sesuai dengan protokol Speed Plasmid Mini Kit. Sel E. coli JM 109 yang mengandung plasmid pgemt rekombinan ditumbuhkan dalam 1,5 ml media cair LB yang mengandung 0,1 mg/ml ampisilin selama satu malam. Selanjutnya kultur disentrifuga 13.000 rpm 1 menit untuk mendapat pelet sel. Pelet sel diresuspensikan dengan 200 μl dapar PD1 diikuti dengan penambahan 200 μl dapar PD2 dan dicampur dengan cara membolak balikan tabung sebanyak 10 kali. Kemudian campuran dibiarkan pada suhu kamar selama 2 menit hingga lisat berwarna jernih. Ke dalam campuran ditambahkan 300 μl dapar PD3 dan dicampur dengan cara membolak balikan tabung. Campuran kemudian disentrifuga 13.000 rpm 3 menit. Kolom PD diletakkan di atas tabung pengumpul kemudian supernatan dimasukkan ke dalam kolom PD dan disentrifuga 13.000 rpm 30 detik. Kolom kemudian dicuci dengan 400 μl dapar W1 dan disentrifuga 13.000 rpm 30 detik. Kolom dicuci kembali dengan 600 μl dapar pencuci dan disentrifuga 13.000 rpm 30 detik. Kolom kemudian disentrifuga kembali
17 13.000 rpm 3 menit. Kolom PD kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 ml steril dan dielusi dengan 50 μl dapar elusi. Plasmid hasil isolasi menggunakan kit High Speed Plasmid Mini Kit kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 0,8 % b/v dalam dapar TAE 1x, pada tegangan 80 V selama satu jam. Analisis migrasi dilakukan bersama dengan plasmid pgem-t sirkular yang tidak mengandung DNA sisipan. Kemudian dilakukan analisa PCR dimana plasmid hasil isolasi dijadikan sebagai cetakan menggunakan primer universal SP6 dan T7 untuk pgem-t. PCR melibatkan 3 tahap secara berurutan yaitu tahap denaturasi (94 o C) selama 1 menit, tahap penempelan/annealing (48 o C) selama 1 menit dan tahap pemanjangan fragmen DNA (72 o C) selama 1 menit, reaksi dilakukan 30 siklus. Hasil PCR kemudian dikarakterisasi menggunakan elektroforesis agarosa. Plasmid hasil isolasi dipotong secara tunggal dan ganda menggunakan enzim BamHI dan EcoRI. Reaksi diinkubasi pada suhu 37 C selama semalam. Hasil pemotongan kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 1 % b/v dalam dapar TAE 1x, pada tegangan 80 V selama satu jam. Penentuan urutan nukleotida gen sisipan dilakukan dengan metode sanger menggunakan dye terminator.