Seminar Dewinta G

Seminar Dewinta G34063443 Dewinta, Achmad Farajallah, dan Yusli Wardiatno. 2010. Pola Distribusi Geografis pada Udang Mantis di Pantai Jawa Berdasarkan Genom Mitokondria. Seminar disampaikan tanggal 11 September 2010, Departemen Biologi FMIPA IPB. PENDAHULUAN Latar Belakang Udang mantis atau udang ronggeng merupakan anggota Filum Arthropoda, Subfilum Crustacea, Ordo Stomatopoda, yang terdiri atas empat famili, yaitu Odontodactylidae, Lysiosquillidae, Harpiosquillidae dan Squilidae. Sebagaimana udang pada umumnya, kelompok udang ini dicirikan dengan tubuh yang bersegmen, di belakang kepala terdapat karapas pendek, kaki beruas-ruas, ukuran tubuh yang besar dan mata seringkali berbentuk T (Carpenter dan Niem 1998). Habitat sebagian besar udang mantis adalah pantai, senang hidup di dasar air terutama pasir berlumpur. Cara hidup udang mantis dengan menggali dan bersembunyi di dasar air untuk berburu mangsa. Salah satu udang mantis yang bernilai ekonomi tinggi adalah Harpiosquilla harpax dari Famili Harpiosquillidae. Udang ini diekploitasi untuk diperdagangkan sebagai makanan eksotik. Jenis udang mantis lain yang sering diperdagangkan adalah Lysiosquillina maculata, Squilla empusa, dan S.mantis (Moosa 1997). Karakteristik dari stomatopoda sebagai hewan pemangsa memiliki dua metode untuk menangkap mangsa. Kedua metode inilah yang kemudian akan membedakan kelompok fungsional stomatopoda yang sangat luas, yaitu smashers (galak) dan spearers (sangat baik). H. Harpax sendiri tergolong kedalam spearers (Ahyong 1997). H. harpax banyak ditemukan di Pantai Utara Pulau Jawa, Selat Malaka sampai ke Laut Pasifik (Ahyong et al. 2008). Ciri-ciri H. harpax adalah tubuh terdiri atas tiga bagian yaitu kepala, thoraks dan abdomen, karapas dengan median carina, distal page 1 / 286

segmen dari uropod memiliki garis tengah warna putih atau sedikit hitam, carina intermediat tidak terlalu tajam, rostal dilengkapi dengan projeksi anterior, panjang total mencapai 30 cm, mata sangat besar dan berbentuk T, telson berduri dan median carina pada telson memiliki dua bintik hitam (Carpenter dan Niem 1998). Udang betina mampu menelurkan 50.000 hingga 1 juta telur, yang akan menetas setelah 24 jam menjadi larva nauplius (Choi dan Hong 2001). Tahap perkembangan larva pada udang mantis terdiri dari empat fase. Fase pertama yaitu nauplius, larva nauplius tidak dapat berenang sehingga terbawa arus kemana saja arus bergerak, terutama arus sejajar garis pantai, bermetamorfosis dalam enam stages berkisar selama dua hari. Fase ke dua yaitu protozoea, mempunyai tujuh pasang anggota tubuh, bermetamorfosis dalam tiga stages berkisar selama tujuh hari. Fase ketiga yaitu mysis bermetamorfosis dalam tiga stages berkisar selama tujuh hari. Fase terakhir yaitu postlarva, pada fase ini udang mulai memiliki karakteristik udang dewasa, dilanjuti menjadi juvenil dan udang dewasa (Choi, 2001). Pergerakkan arus ini bergantung kepada arah/sudut gelombang yang datang. Pada kawasan pantai yang diterjang gelombang menyudut, terhadap garis pantai, arus yang dominan terjadi adalah arus sejajar pantai. Pergerakan arus sejajar dengan garis pantai inilah yang menyebabkan pola penyebaran terus mengikuti garis pantai. Persebaran larva yang hanyut terikut arus terus mengalami persebaran yang sangat luas bahkan antar samudera (Barber et al. 2002). Dalam penelitian ini populasi H. harpax berusaha dipelajari menggunakan penanda genetik genom mitokondria, yaitu ruas genom yang dikenal dengan d-loop atau control region. Genom mitokondria hewan merupakan genom sitoplasmik yang diwariskan secara uniparental, dan tidak mengalami rekombinasi. Genom mitokondria atau mtdna terdiri atas 2 gen penyandi rrna, 22 trna, dan 13 gen penyadi protein yang terlibat dalam rangkaian rantai respirasi selular, dan satu ruas yang berfungsi sebagai pengontrol transkripsi yang dikenal sebagai d-loop. Ruas d-loop dikenal mempunyai laju mutasi yang lebih cepat dibanding ruas-ruas gen lainnya, sehingga sangat cocok untuk digunakan sebagai penanda genetik untuk mempelajari fenomena intraspesifik (Cook 2005). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman genetik udang mantis Harpiosquilla harpax di Pantai Jawa, berdasarkan genom mitokondria. page 2 / 286

BAHAN DAN METODE Metode Koleksi Udang dan Identifikasi sampel. Udang mantis H. harpax sebanyak delapan ekor koleksi bapak Dr. Yusli Wardiatno dari Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan IPB yang dipreservasi dalam etanol. Kepastian spesies udang mantis sebagai Harpiosquilla harpax diidentifikasi berdasarkan kunci identifikasi (Carpenter dan Niem 1998). Ekstraksi dan Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan dari otot tungkai. Otot tungkai yang disimpan dalam etanol dicuci dengan air destilata dua kali kemudian dihomogenasi dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, ph 8). Sel-sel otot dilisis menggunakan proteinase K 0,125 mg/ml dan sodium dodesil sulfat 1%. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genomic DNA mini kit for fresh blood. Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA. Bagian d-loop dari mtdna diamplifikasi menggunakan primer yang didesain menggunakan Primer 3 ( http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) dengan referensi beberapa mtdna anggota stomatopoda yang ada di Gen Bank ( www.ncbi.nlm.nih.gov). Primer forward AF180berada pada urutan 15102 nt dan primer reverse AF181 berada pada urutan 15127 terhadap mtdna H.harpax, dengan target DNA hasil amplifikasi berukuran 929 bp. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 50 μl. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi predenaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan 30 siklus yang terdiri atas denaturasi suhu 94oC selama 1 menit, penempelan primer suhu 54oC selama 1 menit, pemanjangan 72oC selama 2.30 menit dan diakhiri pemanjangan akhir suhu 72oC selama 7 menit. Produk PCR diuji menggunakan PAGE 6%, kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Tegelstrom 1986). Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequencing. Produk PCR berupa pita tunggal di atas gel poliakrilamid dan berukuran sesuai desain primer dimurnikan, untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. PCR untuk page 3 / 286

sequencing menggunakan primer yang sama seperti amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan nukleotida yang diperoleh kemudian diedit secara manual. Runutan-runutan nukleotida yang telah diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi, yaitu H. harpax yang ditangkap dari Pantai Vietnam dengan No akses AY699271 (Miller dan Austin 2006) menggunakan program Clustal W 1.8 yang tertanam dalam program MEGA versi 4.00. Analisis Filogeni. Analisis keragaman nukleotida dan filogenetik dilakukan menggunakan MEGA (Kumar et al. 2008) berdasarkan model subtitusi Kimura-2 -parameter. Analisis kekerabatan antar sampel menggunakan metode neighbour joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi Hasil identifikasi berdasarkan buku identifikasi Carpenter dan Niem (1998) menunjukkan bahwa sampel udang yang digunakan adalah spesies H. harpax. Amplifikasi dan Visualisasi DNA Dari kedelapan sampel yang digunakan, semuanya berhasil diamplifikasi. Amplifikasi menggunakan pasangan primer AF180 dan AF181 menghasilkan pita tunggal berukuran sekitar 1100bp (Gambar 1). page 4 / 286

Gambar 1. Produk PCR berupa pita tunggal yang diuji dengan menggunakan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6%. Keterangan: M = DNA marker 100 bp, No urut sesuai dengan Gambar 2. Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA SequencingPanjang basa nukleotida DNA setelah ruas penempelan primer dibuang dan diedit, yakni sekitar 800-an. Setelah disejajarkan, runutan nukleotida yang bisa dilanjutkan dianalisis berada pada posisi 13496 nt sampai 14273 nt berdasarkan referensi mtdna H. harpax (Miller dan Austin 2006) sepanjang 787 nt. Dari 787 nukleotida, sebanyak 645 nt sama untuk semua sampel. Dari 142 nt yang berbeda, sebanyak 9 nt merupakan insersi/delesi yang hanya ditemukan pada satu sampel dan 84 nt substitusi yang hanya ditemukan pada satu sampel sehingga sebanyak 93 nt tidak diikutkan dalam analisis berikutnya karena tidak bersifat parsimoni. Sisanya sebanyak 49 nt yang terdiri dari dua jenis mutasi, yaitu subsitusi dan insersi/delesi kemudian digunakan dalam menghitung keragaman genetik (Gambar 2). Gambar 2. Runutan nukleotida yang saling berbeda antar sampel yang digunakan dalam analisis keragaman genetik dan membangun pohon filogeni. Nomor urut page 5 / 286

nuleotida ditulis secara vertikal (5 baris paling atas) mengacu pada genom mitokondria H. harpax No. akses AY699271. Secara filogeografi H. harpax di Perairan Cirebon terpisah dengan H. harpax di Perairan Vietnam. Hal ini dibuktikkan oleh nilai jarak genetik terjauh adalah antara H. harpax Vietnam dan H. harpax 3 yaitu sebesar 10,5%, sedangkan jarak genetik paling dekat adalah antara H. harpax 1dan 6 (kelompok 1) yaitu sebesar 1,8%. Keragaman genetik H.harpax di Perairan Cirebon berdasarkan ruas d-loop memiliki nilai lebih besar yaitu 5.1% (±0,005) (Tabel 1) bila dibandingkan dengan keragaman genetik Halocyprida sp berdasarkan ruas C01 yaitu sebesar 2,27%. Nilai keragaman genetik d-loop yang lebih besar membuktikkan bahwa ruas d-loop memiliki laju mutasi lebih tinggi dibandingkan ruas-ruas pada mtdna lainnya dan mutasi yang tinggi berbanding lurus dengan tingginya keragaman (Cook 2005). Rata-rata komposisi nukleotida A=41,2% ; T=38,7% ; G=7,9% ; C=12,3%. Persentase A+T (79,9%) lebih besar daripada C+G (20,2%). Banyaknya basa A+T pada genom mitokondria d-loop dibandingkan C+T berkaitan dengan d-loop sebagai promotor titik awal transkripsi bagi utas berat maupun utas ringan (Hoelzoel et al. 1994). Hal lain yang menyebabkan basa AT lebih tinggi disebakan oleh adanya sekuens yang berulang dan panjangnya urutan T (Cook 2005). Analisis Filogeni Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootstrap1000x mengelompokkan udang H. Harpax dalam satu percabangan dan H. Harpax Vietnam berada di luar percabangan. Struktur populasi yang digambarkan oleh mtdna ini setidaknya membagi populasi H. harpax di perairan Cirebon menjadi dua yaitu kelompok 1 dan kelompok 2. H. harpax 1,4,6 dan 10 termasuk ke dalam kelompok 1 dan saling berkerabat dekat. H. harpax 2, 3, 5, dan 8 termasuk ke dalam kelompok 2 dan saling berkerabat dekat. Titik nenek moyang (anchestral node) menunjukkan bahwa kekerabatan H. harpax 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 dan 10 adalah berasal dari satu nenek moyang/indukkan. Sedangkan populasi H harpax dari perairan Cirebon berbeda nenek moyang/indukan dengan H. harpax di perairan Vietnam (Gambar 3). Hal ini disebabkan oleh pola penyebaran udang mantis sangat berkaitan erat dengan arus laut. Arus pada Laut Jawa bergerak ke arah Kalimantan sedangkan arus dari Laut China Selatan bergerak ke Vietnam sehingga pergerakan arus dari Cirebon dan Vietnam tidak searah. Penyebaran udang mantis melalui tingkat larva yang terbawa page 6 / 286

arus dan bergerak mengikuti garis pantai. Teluk Vietnam yang berada di sisi utara dari Laut China Selatan tidak terhubung/ saling terpisah dengan Laut Jawa (Cirebon), sehingga memiliki garis pantai yang tidak berhubungan (McCleave et al. 1984). Hal lain yang menyebabkan H. harpax di Perairan Cirebon berbeda nenek moyang/indukkan dengan H. harpax dari Perairan Vietnam adalah arus dari Indo-Pasifik saling berhubungan karena arus yang datang dari Pasifik menuju lautan Indonesia yang juga melewati Vietnam bergerak bolak-balik, hanya saja dikarenakan adanya bencana alam yang pernah terjadi menyebabkan pola penyebaran H. harpax hanya berkisar ±40km, sehingga menyebabkan keragamannya homogen dan pola penyebaran yang terbatas/tidak luas (Barber et al. 2002). Dari data yang ada, kelompok 1 dan 2 mungkin sebagai spesies yang berbeda dalam genus Harpiosquilla. Hal ini diperkuat dengan adanya beberapa perbedaan yaitu seperti intermediat carina pada bagian thoraks tanpa/ dilengkapi dengan duri, dari segi warna ada yang lebih gelap dan terang, dan segmen distal pada uropod ada yang tidak/ bewarna sedikit hitam (data tidak diperlihatkan). Hal ini juga disebabkan oleh spesies H. harpax yang tertangkap di Perairan Cirebon seringkali tertangkap bersamaan dengan H. raphidae. Gambar 3. Hasil rekontruksi pohon filogeografi pengelompokan sampel H. harpax berdasarkan ruas d-loop mtdna menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000x. page 7 / 286

Tabel 1.Jarak genetik antar sampel (di bawah diagonal) dan standar error (di atas diagonal) berdasarkan model subtitusi K2P dengan bootstrap 1000x. No Sampel 1 H. harpax 1 1 2 3 0.01 0.01 0.00 0 1 6 2 H. harpax 2 4 5 6 7 8 9 0.01 0.00 0.00 0.00 0.01 0 5 9 8 1 0.06 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.01 0. 1 7 9 5 9 5 0 1 3 H. harpax 3 0.08 0.04 0.01 0 1 0 4 H page 8 / 286