BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Klasifikasi Ikan Lele Ikan Lele adalah salah satu jenis ikan air tawar yang termasuk ke dalam ordo Siluriformes dan digolongkan ke dalam ikan bertulang sejati. Lele dicirikan dengan tubuhnya yang licin dan pipih memanjang, serta adanya sungut yang menyembul dari daerah sekitar mulutnya. Nama ilmiah Lele adalah Clarias spp. yang berasal dari bahasa Yunani "chlaros", berarti "kuat dan lincah". Dalam bahasa Inggris lele disebut dengan beberapa nama, seperti catfish, mudfish dan walking catfish. Klasifikasi ikan lele berdasarkan Saanin (1984) dalam Hilwa (2004) yaitu sebagai berikut: Filum Kelas Subkelas Ordo Subordo Famili Genus Gambar 2.1 Morfologi ikan Lele Lokal (Clarias batrachus) (Sumber: Lovshin, L.) : Chordata : Pisces : Teleostei : Ostarophysi : Siluroidae : Clariidae : Clarias 2.2 Biologi Ikan Lele Ikan lele merupakan hewan nokturnal dimana ikan ini aktif pada malam hari dalam mencari mangsa. Ikan-ikan yang termasuk ke dalam genus lele 6
7 dicirikan dengan tubuhnya yang tidak memiliki sisik, berbentuk memanjang serta licin. Ikan Lele mempunyai sirip punggung (dorsal fin) serta sirip anus (anal fin) berukuran panjang, yang hampir menyatu dengan ekor atau sirip ekor. Ikan lele memiliki kepala dengan bagian seperti tulang mengeras di bagian atasnya. Mata ikan lele berukuran kecil dengan mulut di ujung moncong berukuran cukup lebar. Dari daerah sekitar mulut menyembul empat pasang barbel (sungut peraba) yang berfungsi sebagai sensor untuk mengenali lingkungan dan mangsa. Lele memiliki alat pernapasan tambahan yang dinamakan Arborescent. Arborescent ini merupakan organ pernapasan yang berasal dari busur insang yang telah termodifikasi. Pada kedua sirip dada lele terdapat sepasang duri (patil), berupa tulang berbentuk duri yang tajam. Pada beberapa spesies ikan lele, duri-duri patil ini mengandung racun ringan. Hampir semua species lele hidup di perairan tawar. Berikut kisaran parameter kualitas air untuk hidup dan pertumbuhan optimum ikan lele menurut beberapa penelitian dalam Witjaksono (2009). Tabel 2.1 Kualitas air optimal untuk perumbuhan lele pada beberapa penelitian Parameter Nilai Satuan Sumber Suhu 22-32 o C BBPBAT (2005) Oksigen Terlarut >0,3 Rahman et al (1992) mg/l >0,1 BBPBAT (2005) ph 6,5-8,5 Boyd (1990) 6-9 Wedemeyer (2001) Amonia (NH 3 ) 0,05-0,2 mg/l Wedemeyer (2001) <0,1 mg/l Rahman et al (2001) Alkalinitas 50-500 mg/l CaCO 3 Wedemeyer (2001) 5-100 mg/l CaCO 3 Boyd (1990) (sumber : Witjaksono 2009)
8 2.3 Jenis-jenis Ikan Lele 2.3.1. Ikan lele Dumbo Di Indonesia lele merupakan jenis ikan yang cukup populer. Lele yang berada di Indonesia bermacam-macam jenisnya. Terutama jenis lele yang biasa dikonsumsi seperti lele Afrika, Dumbo, dan Lokal. Lele Afrika (Clarias gariepinus) merupakan jenis ikan lele yang berasal dari Afrika yang diimpor ke Indonesia untuk dikawin silangkan dengan lele Lokal dan dinamakan lele Dumbo. Gambar morfologi ikan lele Dumbo terdapat pada Gambar 2.2 Gambar 2.2 Ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus) (Sumber: Dokumentasi pribadi) Ikan lele Dumbo memiliki tubuh yang lebih besar 6-8 kali panjang standar dibandingkan lele Lokal dan memiliki gen pertumbuhan yang lebih cepat. Ukuran kepala 3-3,5 kali lebih besar. Kepala agak persegi panjang dan lancip ke garis dorsal. Moncongnya yang bulat melebar. Mata memiliki posisi supero-lateral dan relatif kecil. Gigi pada premaxilla dan rahang bawah kecil, halus dan diatur dalam beberapa baris. Barbels 1/5 sampai ½ kali dari ukuran kepala dan ½ sampai 4/5 kali dari ukuran kepala ketika individu masih kecil. Sirip pektoral hanya bergerigi dibagian luar dan tidak beracun. Jumlah gerigi semakin banyak seiring bertumbuhnya individu. Berwarna abu ungu kemerahan dan bercorak marble. Warnanya akan semakin pucat dan corak tampak lebih jelas apabila stress. Bagian perut, ventral dan sirip yang berpasangan berwarna keputih-putihan. Selain itu juga lele Dumbo dapat dibudidayakan dalam tingkat kepadatan yang tinggi, tingkat kematangan gonad yang relatif lebih cepat dan dapat mengkonsumsi
9 banyak jenis produk samping agrikultur serta dapat mentolerir kualitas air yang buruk. 2.3.2. Ikan lele Lokal Lele Lokal (Clarias batrachus) atau yang sering disebut dengan walking catfish ini merupakan lele habitat asli di Indonesia. Dinamakan walking catfish karena kemampuanya untuk berjalan didaratan untuk mencari makanan atau lingkungan yang cocok. Lele ini berjalan dengan menggunakan sirip pektoral untuk mengangkat tubuhnya dan berjalan menyerupai ular. Gambar 2.3 Ikan Lele Lokal (Clarias batrachus) (Sumber: Dokumentasi pribadi) Lele Lokal memiliki tubuh yang pipih dibagian posterior. Rahang atas yang lebih menjorok. Ujung dari sirip pectoral mengeras menyerupai duri dan kasar dibagian sisi luar serta bergerigi dibagian ujung dalam. Duri atau sirip pektoral mengandung racun, dan memiliki panjang 2 kali dari lebar tubuh. Genital jantan panjang dan meruncing, serta memiliki warna hitam ke abuan walaupun dalam keadaan stress disertai bintik putih. Lele Lokal dapat bertahan hidup dengan berpindah tempat selama tempat itu tetap menjaga lele dalam keadaan lembab dan basah seperti berpindah dari kolam air stagnan, rawa, sungai, atau bahkan lahan padi yang terkena banjir. Ikan lele Lokal mampu bertahan cukup lama di daratan karena memiliki alat bantu pernafasan berupa arborescent. Lele Lokal memiliki tubuh paling panjang rata-rata 30cm, lele Lokal dapat mengkonsumsi ikan kecil, moluska, invertebrata lain, detritus, bahkan gulma air di habitat alaminya.
10 2.3.3. Ikan lele Sangkuriang Lele Dumbo yang ada di Indonesia mengalami penurunan kualitas diakibatkan sering terjadinya perkawinan satu keturunan (inbreeding). Untuk itu Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT) memutuskan untuk melakukan pemurnian kembali. Betina keturunan kedua lele Dumbo asli dari Afrika Selatan (F2) dikawinkan dengan pejantan keturunan keenam yang Lokal (F6). Dari proses pemurnian Back cross ini anakan yang dihasilkan kemudian dinamakan Lele Sangkuriang. Melihat hal diatas bahwa lele Sangkuriang adalah lele Dumbo hasil pemuliaan atau peremajaan. Gambar 2.4 Ikan Lele Sangkuriang (Clarias gariepinus) (Sumber: Dokumentasi pribadi) Secara garis besar ikan lele Sangkuriang memiliki tingkat pertumbuhan dan kualitas dan kuantitas fekunditas yang lebih baik dibanding dengan lele Dumbo sebelumnya. Lele Sangkuriang memiliki fekunditas 33.33% lebih tinggi dibandingkan lele Dumbo dan umur pertama matang gonad yang lebih tua. Pada pemeliharaan umur 5-26 hari ikan ini menghasilkan laju pertumbuhan harian 43.57% lebih tinggi dibandingkan lele Dumbo sedangkan pada pemeliharaan umur 26-40 hari 14.61% lebih tinggi. Pada pembesaran calon tetua tingkat pertama dan kedua, lele Sangkuriang menghasilkan laju pertumbuhan yang lebih tinggi dibandingkan lele Dumbo yaitu 11.36% dan 16.44%. sedangkan pada pembesaran kelas konsumsi, konversi pakan pada lele Sangkuriang mencapai 0.8 dibandingkan lele Dumbo yang mencapai >1 (Sunarma et al. dalam Hilwa 2004).
11 2.3.4. Ikan Lele Albino Lele Albino merupakan lele jenis apa saja yang memiliki gen resesif dari parental, tercermin dari warnanya yang putih akibat gen yang tidak dapat membentuk pigmen melanin. Biasanya ikan lele Albino ini dipertahankan dan diperbanyak oleh beberapa pembudidaya karena tergolong ikan lele hias serta memiliki nilai ekonomis yang lebih tinggi dibandingkan ikan lele konsumsi pada umumnya. Gambar 2.5 Ikan lele Albino (Sumber: Dokumentasi pribadi) Kulitnya berwarna merah keputihan dan ada bercak hitam. Memiliki sirip mengeras pektoral yang tumpul dan tidak berbisa. 2.4 Hubungan Kekerabatan Genetik Setiap populasi di alam akan memberikan respon yang berbeda terhadap lingkungan yang berdampak pada terjadinya perbedaan bentuk, sifat, dan karakter mahluk hidup satu spesies di tempat yang berbeda. Sifat-sifat yang muncul ini yang digunakan untuk mempelajari hubungan kekerabatan. Pendekatan morfologi merupakan sifat yang paling sering digunakan dalam mempelajari hubungan kekerabatan pada suatu populasi atau spesies (Rafsanjani 2011). Kelemahan dari pendekatan secara morfologi adalah tingkat subjektifitas sangat tinggi, dan kondisi lingkungan yang harus selalu dijaga (Hu dan Quiros 1991 dalam Rafsanjani 2011). Pendekatan lain yang sering digunakan berupa isoenzim dan enzym. Isoenzim dapat membentuk lokus-lokus yang pada gel yang merupakan hasil dari elektroforesisi protein (Abdelhamid, 1988; Rognon et al. 1996; Agnese et al. 1997).
12 Beeching et al (1993) mengemukakan bahwa setiap makhluk hidup memiliki DNA sumber informasi dan selalu konsisten pada setiap sel di jaringan tubuh. DNA tidak terpengaruhi oleh lingkungan luar. Urutan DNA menunjukan variasi yang lebih tinggi dibandingkan asam amino dalam enzim oleh karena itu DNA merupakan sumber polimorfisme yang baik dan sangat potensial. Hal tersebut menjadikan keunggulan untuk DNA dalam menganalisis hubungan kekerabatan genetik. 2.5 Tinjauan Umum Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.5.1 Teknik PCR Menurut Erlich (1989), PCR adalah suatu teknik yang sangat tepat dan teknik yang paling sering digunakan untuk biologi molekuler karena mudah, cepat, dan murah. Teknik amplifikasi DNA dari sumber DNA yang terbatas dan kualitas DNA yang rendah dapat dilakukan. DNA yang dihasilkan merupakan DNA yang spesifik dari sejumlah kecil gen-gen yang berbeda. DNA diambil dari sampel ikan Lele yang akan diteliti, penambahan primer RAPD dilakukan sebagai penanda genetik pada PCR. Hasil yang dikeluarkan berupa pita-pita DNA ikan Lele yang sudah diperbanyak dengan urutan sesuai dengan primer yang diberikan. Pita-pita DNA tersebut yang akan dianalisisis untuk diketahui kekerabatanya. Pada proses amplifikasi DNA oleh PCR diperlukan enzim yang dinamakan dengan taq polymerase. Enzim ini diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus yang hidup pada kolam kolam air panas (Erlich 1989). Menurut Weaver (2004) enzim tersebut adalah enzim yang sangat stabil pada suhu rendah maupun suhu tinggi, sehingga pada proses PCR tidak diperlukan penambahan enzim baru untuk setiap perubahan suhu. 2.5.2 Prinsip Kerja PCR Proses PCR terbagi dalam tiga tahapan, yaitu tahap denaturasi DNA (denaturing), tahap penempelan primer pada DPA (annealing) dan tahap pemanjangan (elongation). Tahap-tahap tersebut yang terjadi selama proses amplifikasi DNA berlangsung pada PCR. Tahap pertama pada PCR adalah
13 denaturasi DNA (denaturing), pada tahap pertama DNA diberikan kondisi tinggi berkisar antara 93 o C-100 o C. tahap denaturasi bertujuan untuk mengubah sifat DNA yang disebabkan suhu tinggi. Perubahan sifat DNA terlihat pada lepasnya rantai ganda DNA menjadi single helix (Dunham 2004). Tahap kedua adalah annealing atau penempelan primer pada rantai DNA. Primer akan menempel pada masing-masing DNA yang berpisah. Letak menempelnya primer akan spesifik sesuai dengan urutan basa pada primer dan urutan basa pada DNA. Tahap penempelan primer pada DNA bekerja pada kisaran suhu 37 o C - 63 o C. spesifitas penempelan primer pada rantai DNA bergantung pada suhu yang digunakan. Suhu optimal untuk proses penempelan primer berkisar 3 o C - 5 o C di bawah melting temperature (Tm) atau suhu lebur dari primer yang digunakan. Semakin tinggi suhu yang digunakan spesifitas akan semakin tinggi, namun amplifikasi akan lebih efisien jika proses penempelan dilakukan pada suhu lebih rendah dari suhu Tm (Dunham 2004). Tahap ketiga adalah tahap pemanjangan primer (elongation) dengan bantuan enzim taq polymerase dan campuran deoxyribonucleoside triphospate (dntp). Pemanjangan primer dilakukan pada suhu 72 o C (Dunham 2004). Nukleotida bebas digunakan untuk menjadi bahan dasar pemanjangan primer, nukleotida akan dipasangkan pada urutan basa yang sesuai dengan yang dibutuhkan pada pemanjangan primer. Enzim taq polymerase berfungsi sebagai perangkai dan penempel nukleotida pada primer. Setelah selesai tahap pemanjangan DNA, proses PCR diulang dari tahap awal denaturing annealing elongation, tiga tahapan tersebut biasanya disebut dengan 1 siklus. Pada proses PCR umumnya dilakukan lebih dari 1 siklus untuk menghasilkan fragmen DNA spesifik yang banyak. 2.6 Penanda Genetik Suatu penanda adalah karakter atau sifat yang diturunkan atau diwariskan pada keturunannya dan dapat berasosiasi maupun berkorelasi dengan genotip tertentu dan dapat digunakan untuk mengkarakterisasi atau mendeteksi suatu genotip tertentu (Rafsanjani 2011). Penanda genetik dapat diwariskan secara tegas
14 pada keturunanya dan terpaut dengan sifat yang dikehendaki. Pada perkembangan penanda genetik dapat dikelompokan sebagai penanda sitology, penanda morfologi, dan penanda molekuler. Penanda molekuler dikelompokan kembali menjadi dua bagian penanda isoenzim dan penanda molekuler (Mulyani 2003 dalam Rafsanjani 2011). Penanda morfologi merupakan penanda yang mengacu pada karakter morfologi yang terlihat secara jelas pada individu dan diturunkan mengikuti hukum Mendel (Liu 1998). Setiap individu mempunyai gen-gen yang khas yang diekspresikan menjadi morfologi individu tersebut. Penampakan morfologi dapat dikaitkan dengan gen-gen yang spesifik dan penanda genetik dalam kromosom. Penampakan morfologi mudah diamati dan sejak jaman dahulu dijadikan sebagai penanda genetik untuk melihat kekerabatan. Penanda morfologi mempunyai kelemahan dalam mengidentifikasi keanekaragaman subjektifitas pada penanda morfologi sangat tinggi, tidak efektif, sulit dan rentan dengan kondisi lingkungan (Mulyani 2003 dalam Rafsanjani 2011). Penanda protein merupakan penanda genetik pada tingkat protein, teknik yang sering digunakan adalah isoenzim. Setiap gen-gen pada DNA menghasilkan protein yang spesifik dengan komposisi asam amino yang spesifik dengan melihat protein yang dihasilkan maka dapat terpetakan gen yang terdapat pada kromosom. Elektroforesis digunakan untuk melihat pita protein berdasarkan muatan dan jenis protein. Kelemahan analisis keragaman menggunakan isoenzim adalah jumlah lokus penanda ini terbatas dan tidak terdapat pada semua jaringan, serta tergantung pada tahap perkembangan organisme yang bersangkutan (Liu 1998). Perkembangan teknologi biologi molekuler menghasilkan metode penanda genetik yang lebih efisien dan lebih cepat. Penanda genetik molekuler DNA. Secara garis besar tidak berbeda dengan penanda genetik lainya. Keunggulan dari penanda molekuler DNA menurut Liu (1998) dapat dikembangkan dengan cepat dan dalam jumlah yang lebih banyak. DNA pada setiap sel individu sama dan konsisten, maka pengambilan sampel DNA dapat dilakukan pada setiap bagian tubuh individu. DNA tidak terpengaruh dengan lingkungan dan umur atau tingkat perkembangan individu tidak berpengaruh terhadap DNA. Analisis dapat
15 dilakukan setiap saat tidak bergantung pada waktu. Dibandingkan dengan penanda morfologi teknik penanda molekuler DNA lebih mudah dan murah. Penanda DNA adalah sebagian kecil daerah yang khas pada DNA yang menunjukan pita polimorfisme yang berbeda ada masing-masing individu dalam satu spesies (Liu 1998). Pita dapat dideteksi melalui dua pendekatan, yaitu hibridisasi asam nukleat contohnya RFLP atau melalui amplifikasi segmen DNA dengan berbasis PCR (mikrosatelit, AFLP, dan RAPD) Erlich (1989). 2.7 Metode Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD) Penanda genetik molekuler berupa penanda DNA sudah banyak dilakukan untuk mempelajari hubungan kekerabatan mahluk hidup. Metode untuk menganalisis penanda DNA semakin berkembang dan semakin efisiem dalam penggunaan dan biaya. Metode dengan biaya yang efisien dengan hasil yang akurat merupakan metode yang dicari. Salah satu teknik pendekatan untuk mendeteksi adanya polimorfisme pada DNA dapat dilakukan dengan metode Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Penanda RAPD menggunakan primer pendek (8-12 pasangan basa (bp) berupa oligonukleotida acak (Liu dan Dunham, 1998a; Liu et al, 1998a, 1999b). penanda RAPD sangat berguna untuk menentukan hubungan genetik, dan konstruksi peta hubungan genetik. (Grattapaglia dan Sederoff, 1994; Liu dan Dunham, 1998a,b). Buwono (2004) menyebutkan setiap primer membuat pola satu amplifikasi yang dipisahkan pada gel agarose dan divisualisasikan dengan pewarnaan ethidium bromide. Pita-pita yang muncul pada gel agarose merupakan DNA genom hasil amplikasi oleh primer RAPD. Setiap pola pita merupakan karakter informatif untuk hubungan kekerabatan genetik. Penanda RAPD diungkapkan dan mencetak sebagai alel dominan. Amplifikasi DNA dinilai berdasarkan ukuran dan kemunculan pita pada gel agarose. Polimorfisme terjadi ketika sebuah pita muncul dalam satu jenis orangtua dan tidak ada dalam yang lain. Bahkan jika sebuah pita homolog ada pada orangtua yang lain, dimunculkan sebagai sebuah pita dengan ukuran yang berbeda, itu akan mencetak hasil sebagai penanda yang berbeda
16 meskipun sebenarnya merupakan lokus sama atau umum yang berlokasi sama dari urutan DNA. Secara teknis, RAPD bukan gen atau alel karena RAPD bukan kode untuk menghasilkan produk gen. Kerugian potensial untuk analisis RAPD adalah bahwa ini pola pita dominan gagal untuk membedakan antara heterozigot dan homozigot individu (Dunham 2004). 2.8 Analisis Polimorfisme Untuk Mendeteksi Potensial Inbreeding Inbreeding adalah reproduksi dari perkawinan dua induk genetik terkait kuat (Arthur et al. 2005). Inbreeding menghasilkan homozigositas yang tinggi, yang dapat meningkatkan kemungkinan keturunan yang dipengaruhi oleh sifat resesif. Kejadian ini umumnya mengarah pada penurunan variasi genetik ovulasi, yang disebut depresi inbreeding (Arthur et al. 2005). Pertemuan gen-gen resesif pada induk yang berdekatan akan diturunkan pada keturunanya yang dapat mengurangi kualitas genotip yang berpengaruh pada fenotip. Pengurangan kualitas genotip suatu individu menyebabkan penurunan kualitas genotip suatu populasi. Damayanti (2007) dalam Rafsanjani (2011) menyebutkan suatu populasi dengan keragaman genetik yang rendah dapat diumpamakan sebagai suatu populasi dengan individu yang saling bersaudara satu sama lainya. Sehingga dalam jangka panjang perkawinan yang akan terjadi di dalam kelompok tersebut akan merupakan perkawinan antara saudara atau Inbreeding yang akan menyebabkan penurunan kualitas reproduksi dan menyebabkan suatu individu menjadi sensitif terhadap pathogen. Oleh karena itu, inbreeding harus dicegah. Pencegahan inbreeding dapat dilakukan dengan mengetahui informasi genetik individu dari suatu populasi. Informasi genetik individu dapat digunakan sebagai bahan untuk diteliti. Perkembangan teknik molekuler seperti penemuan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) yang mampu mengamplifikasi untai DNA hingga mencapai konsentrasi tertentu dan penemuan metode sequencing DNA dapat digunakan untuk meneliti informasi pada individu dan populasi. Penggunaan metode RAPD PCR dapat menghasilkan hasil analisa genetik yang lebih cepat dan lebih akurat untuk menentukan hubungan kekerabatan pada individu.
17 Pita-pita pada gel agarose yang merupakan hasil amplifikasi DNA genom, Pola-pola pita tersebut dapat dikelompokan menjadi dua kategori yaitu pita polimorfik dan pita monomorfik. Pita polimorfik adalah gambaran pita DNA yang muncul pada ukuran tertentu, tetapi pada sampel lain tidak ditemukan pita DNA pada ukuran tersebut. Pita monomorfik adalah pita yang terdapat pada beberapa sampel hingga tidak memiliki variasi (Williams dan Ronald 1990). Hubungan setiap sampel DNA kemudian ditentukan dengan menghitung indeks kesamaan berdasarkan data numerik larik yang teramplifikasi. Indeks kesamaan ini dihitung dengan menggunakan program NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System). NTSYS dapat digunakan untuk menemukan pola struktur dari data yang beragam dari data sampel yang dihasilkan dari 1 atau lebih populasi. Kekerabatan diantara strain ikan Lele dianalisis dengan menggunakan jarak genetik berdasar program UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Average). Data yang dihasilkan dari penggunaan program tersebut berupa konstruksi pohon filogeni yang disajikan dalam bentuk fenogram (Buwono 2011). Tujuan akhir pencegahan inbreeding adalah untuk pemuliaan mahluk hidup guna keperluan manusia. Pencegahan inbreeding menjadikan kekerabatan hayati menjadi sangat tinggi pada suatu populasi berdampak positif terhadap kualitas genetik populasi. Rifai et al (1994) dalam Rafsanjani (2011) menyebutkan pentingnya pemuliaan mahluk hidup berguna untuk keperluan pembudidayaan oleh manusia, karena itu upaya memahami dan mempertahankan keragaman genetik suatu populasi sangat penting dalam konservasi karena keragaman genetik yang tinggi akan sangat membantu suatu populasi beradaptasi terhadap perubahan-perubahan yang terjadi di lingkungan sekitarnya, termasuk mampu beradaptasi terhadap penyakit-penyakit yang ada di alam.