UJI KARBOHIDRAT SECARA KUANTITATIF

UJI KARBOHIDRAT SECARA KUANTITATIF

Analisa Karbohidrat Uji Kualitatif Uji Kuantitatif o o o o o o o o Uji Molisch Uji Seliwanoff Uji Anthrone Uji Benedict Uji Barfoed Uji Iodin Uji Pembentukan Osason Uji Fehling o o o o Cara Kimiawi Cara Enzimatis Cara kromatografi Cara Optic (fisis)

II. Uji Karbohidrat secara Kuantitatif Penentuan karbohidrat dari kelompok polisarida dan oligisakarida, perlu perlakuan pendahuluan, yaitu hidrolisa sehingga diperoleh monosakarida. Hidrolisa Oligo / polisakarida monosakarida (Pati) Asam atau enzim (glukosa) Penentuan monosakarida: kimiawi fisik enzimatik kromatografi

Cara kimiawi 1. Metoda oksidasi dengan kupri Dasar : reduksi kuprioksida menjadi kuprooksida karena adanya gula reduksi Reagen : - Reagen Luff (campuran CuSO 4, Na 2 CO 3, dan asam sitrat) - Reagen soxhlet (campuran CuSO 4 dengan K Na tartrat) K-Na tartrat : pencegah pengendapan CuSO 4 dalam reagen

kuprioksida - sebagai oksidator - direduksi oleh gula reduksi membentuk kuprooksida (endapan merah bata) Penentuan kuprooksida yang terbentuk: Menimbang setelah dikeringkan Melarutkan kembali, kemudian dititrasi Menentukan selisih kuprioksida sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi Penentuan gula reduksi dalam larutan: Cara luff Schoorl Cara Munson Walker Cara Lane-Eynon

Cara Luff Schoorl Yang ditentukan adalah CuO sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi = (titrasi blanko titrasi sampel) Reaksi : R COH + CuO Cu 2 O + R COOH H 2 SO 4 + CuO CuSO 4 + H 2 O CuSO 4 + 2KI CuI 2 + K 2 SO 4 2CuI 2 Cu 2 I 2 + I 2 I 2 + Na 2 S 2 O 3 Na 2 S 4 O 6 + NaI I 2 + amilum : biru

Metode oksidasi dengan larutan Ferrisianida alkalis Dasar : reduksi ferisianida ferrosianida oleh gula reduksi. 2K 3 Fe(CN) 6 + 2KI 2K 4 Fe(CN) 6 + I 2 2K 4 Fe(CN) 6 + 3 ZnSO 4 K 2 Zn 2 [Fe(CN) 6 ] 2 + 3 K 2 SO 4 gula reduksi ditentukan : berdasar I 2 berdasar NaS 2 O 3 untuk titrasi Indikator : amilum (warna biru hilang) K 4 Fe(CN) 6 yang terbentuk dihitung dari selisih antara K 3 Fe(CN) 6 sebelum dan sesudah reaksi reduksi. Perlu dilakukan percobaan standarisasi

Metoda Iodometri Kelebihan I2 dititrasi dengan Na 2 S 2 O 3 Reaksi : Sampel Spesifik untuk aldosa, ketosa hanya sedikit yang teroksidasi Harus dihilangkan zat yang dapat bereaksi dengan Iodin : etanol, aseton, mannitol, gliserin, Na laktat, Na format dan Urea

Laktosa secara kimiawi 25 ml susu + reagen filtrat 5 ml filtrat + reagen titrasi dengan Na 2 S 2 O 3 48,4 100 Kadar laktosa/100 ml susu = A x x 100 25 100 A = (Tb Ts) x N x 0,171 x 5 A = Kadar Laktosa (g/100 ml) Tb = titrasi blanko Ts = titrasi sampel Susu dengan kadar protein = 3,2%, lemak = 3,5% dari 100 ml susu 48,4 ml filtrat

Penentuan Sukrosa Langsung dengan Polirimeter/refraktometer Kimia : hidrolisa (tentukan jumlah gula reduksi) C 6 H 12 O 11 + H 2 O C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6 Sukrosa fruktosa glukosa (342) (180) (180) Sukrosa = 0,95 x gula reduksi BM Sukrosa 342 FK = = 2 BM gula reduksi 360 Penting : Cek dulu kemungkinan adanya gula reduksi dalam sampel sebelum hidrolisa.

Penentuan pati Prinsip : pati dihidrolisa dengan asam/enzim gula reduksi ditera jumlahnya [C 6 H 10 O 25 ] m + mh 2 O m C 6 H 12 O 6 pati glukosa BM = m.162 BM = 180 m BM pati FK = m. BM gula reduksi m x 162 = = 0,9 m x 180

Cara Enzimatis Terutama untuk penentuan gula dalam campuran karena enzim bersifat spesifik Misal: penentuan glukosa dan fruktosa Dasar : glukosa dan fruktosa difosforilasi menjadi glu 6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P) dengan bantuan enzim heksokinase dan Adenosin 5-trifosfat (ATP)

Glu + ATP G-6-P + ADP Fruk + ATP F-6-P + ADP G-6-P-DH G-6-P + NADP glukonat 6P + NADPH + H + NADPH yang terbentuk setara dengan glukosa yang bereaksi diukur dengan spektrofotometer (λ = 334, 340, 365 nm) PGI F-6-P G-6-P G-6P-DH G-6-P + NADP glukonat-6-p + NADPH + H + Ditera

Penentuan Laktosa dan Galaktosa Dasar : Laktosa + H 2 O β galaktosidase Glukosa + β galaktosa Gal DH β galaktosa + NAD asam galatonat + NADH + H+ ditera (I) pada λ= 334, 340, 365 nm

C. Cara Khromatografi Khromatografi kertas/tlc : diukur besarnya Rf tiap komponoen karbohidrat Jarak perpindahan molekul zat Rf = Jarak perpindahan pelarut Harga Rf tiap jenis gula tertentu untuk perlakuan yang sama dipengaruhi : - Macam zat pelarut - Ukuran bejana - Suhu - Macam fase tetap/stasioner - Sifat zat yang dianalisa

Kromatografi kertas untuk karbohidrat Zat penyangga : kertas yang tersusun oleh selulosa murni (misal: kertas whatman no.1 kecepatan merambat zat sedang), dipotong sesuai kebutuhan. Teteskan sampel (sekecil mungkin), penetesan 3-4 x (tetesan besar terjadi tailing/pemisah tidak sempurna) Masukkan kertas ke dalam wadah berisi pelarut pelarut merambat pada kertas sampai tanda (Solvent front)

Identifikasi : Cara fisis : menyinari kertas dengan sinar UV pada λ: 254 370 nm Kimiawi : semprot dengan larutan kimia misal: -gula reduksi: anilinpthalat, AgNO3 - Larutan khloroglusional dan HCl dapat digunakan -gula non reduksi: naphtoresorcinol dlm asam fosfat. untuk: Aldosa pentosa (violet) Ketosa pentosa (hijau tua) Ketoheksosa (kuning coklat) Metil pentosa (hijau )

Uap Iodin Semprotkan pada kertas diruang asam Setelah kering akan timbul noda berwarna Hitung Rf, bandingkan dengan standar Zat pelarut: zat murni atau campuran Untuk penentuan gula sederhana: Campuran butanol : asetat : air atau asam asetat : pyridin : air (4:1:5)

Cara fisis (Cara optic) Penentuan index bias dengan refraktometer tiap jenis gula punya index bias tertentu. Keuntungan: interval skala index bias cukup besar 1,30 1,75 sampel sangat sedikit (beberapa tetes) ketelitian : ± 0,0002 dinyatakan dengan 20 n D = pengukuran pada t = 20 o C dengan sinar Natrium sebagai sumber sinar monokromatis.

Pengaruh konsentrasi terhadap (α) sangat kecil diabaikan Suhu berpengaruh perlu koreksi : [ ] D [ ] D α = α [ 1 0,000184( t 20) ] t t

Penentuan karbohidrat dengan polarimeter Dasar: Karbohidrat bersifat optis aktif (mampu memutar bidang sinar terpolarisasi), karena mempunyai C asimetri Keuntungan Sampel tidak mengalami kerusakan Dapat dilakukan cepat Agar hasil teliti, maka: Larutan harus jernih dan tidak berwarna Larutan tidak mengandung bahan asing yang bersifat optis aktif Konsentrasi sampel yang optimum: tidak terlalu pekat amupun encer

Penentuan dengan polarimeter Hukum biot: kapasitas rotasi tiap individu gula sebanding dengan konsentrasi larutan dan panjang cairan dalam tabung [α] t D α C I [ α] D t 100 = lc α : putaran/ritasi spesifik : suhu pengukuran (oc) : sinar Na (589 nm) : sdf putar yang diamati : konsentrasi (g sampel/100 ml pelarut) : panjang tabung (dm)

Penentuan Serat Kasar Serat kasar : Senyawa yang tidak dapat dicerna dalam organ pencernaan manusia maupun binatang. Dalam analisa : diperhitungkan banyaknya zat yang tidak larut dalam asam/basa encer pada kondisi tertentu.

Langkah penentuan serat kasar 1. Defatting : menghilangkan lemak dalam sampel dengan pelarut lemak 2. Digestion : - pelarutan dengan asam - pelarutan dengan basa dalam keadaan tertutup pada temperatur terkontrol (mendidih) segera dilakukan penyaringan untuk mencegah kerusakan lebih lanjut Protein menyulitkan penyaringan perlu digesti pendahuluan dengan enzim proteolitik Residu = serat kasar yang mengandung 97% selulosa dan lignin sisanya adalah senyawa yang belum dapat diidentifikasi