39 METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium Patogen dan Bioteknologi Pangan (Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology) SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung pada bulan Juni 2009 hingga Desember 2010 dan dilanjutkan pada bulan Juni 2010 hingga Juli 2011. Bakteri Uji Bakteri uji yang digunakan pada penelitian ini adalah sebanyak 14 isolat lokal S. aureus (AS, NU1, NU2, NU3, NU4, NU5, NU6, NU7, NU8, NU9, NU10, NU11, NU13 dan NU14) yang diisolasi dari ayam suwir dan nasi uduk sebagai salah satu produk pangan tradisional siap santap dan diperoleh dari daerah Babakan Raya, Bogor serta telah dilakukan uji biokimiawi oleh Apriyadi (2010). Isolat pembanding, yaitu S. aureus ATCC 25923 yang bersifat non-enterotoksigenik digunakan sebagai bakteri pembanding. Bahan dan Media Media-media yang digunakan untuk persiapan kultur bakteri S. aureus adalah TSB (Tryptone Soy Broth) (Becton and Dickinson, USA), TSA (Triptone Soy Agar) (CM 131 Oxoid Ltd., UK) dan BHI (Brain Heart Infussion) (Becton and Dickinson, USA). Beberapa bahan yang digunakan untuk isolasi DNA antara lain antara lain SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) (Merck, Darmstadt, Germany), Tris (hydroxymethyl)-amino methan (Amerscham Bioscience, Sweden), NaCl (Natrium Chloride), sodium asetat, fenol (Sigma, USA), kloroform Merck, Darmstadt, Germany), isoamil alkohol (Merck, Darmstadt, Germany), etanol, lisozim (Bio Basic Inc), proteinase K (Fermentas), HCl (Merck, Darmstadt, Germany) dan akuabidestilata steril. Bahan-bahan yang digunakan untuk elektroforesis antara lain bufer TAE (Tris-asetat-EDTA), agarosa (GE Healthcare
40 Bio-Sciences AB), EtBr (Ethidium Bromide) (Amerscham Bioscience, Sweden), loading dye (Fermentas) serta Ladder DNA 100 bp dan 1 kb (Fermentas). Bahan-bahan yang digunakan untuk amplifikasi gen target, yaitu 16S rrna, gen penyandi enterotoksin stafilokoki A (SEA) dan enterotoksin stafilokoki C1 (SEC1) antara lain Green Dream Taq PCR MasterMix (Fermentas), water nuclease (Fermentas), cetakan DNA (DNA template) dan 3 pasang primer berturut-turut, yaitu 63f/1387r, SEA-1/SEA-2 dan SEC1-1/SEC1-2 (Tabel 10) (Marchesi et al., 1998; Johnson et al., 1991). Primer dipesan dari Alpha DNA (Notre-Dame St. W., Montreal, Quebec) (Johnson et al., 1991). Tabel 10 Pasangan primer oligonukleotida yang digunakan untuk amplifikasi gen target Kode Primer 63f 1387r SEA-1 SEA-2 SEC1-1 SEC1-2 Urutan Basa (5-3 ) CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC GGG CGG WGT GTA CAA GGC TTG GAA ACG GTT AAA ACG AA GAA CCT TCC CAT CAA AAA CA GAC ATA AAA GCT AGG AAT TT AAA TCG GAT TAA CAT TAT CC Gen Sumber Target 16S rrna Marchesi et al., (1998) SEA Johnson et al., (1991) SEC1 Johnson et al., (1991) Alat Alat-alat yang digunakan antara lain penangas air yang bertutup, termometer, inkubator 35 o C, mikroskop, jarum ose, tabung reaksi berulir, labu takar 50 ml, gelas ukur 50 ml, 100 ml dan 1000 ml; pipet mikro 2 ml, 20 ml, 100 ml dan 1000 ml; ph meter, vorteks, hot plate, alat sentrifus 18,000 rpm, pengaduk magnet, perangkat elektroforesis (Bio-Rad), perangkat PCR Applied Biosystem 2720 Thermal Cycler (Foster City, California), Geldoc XR (Bio-Rad), ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer dengan 4-Capillary System (Applied Biosystem) dan spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu). Beberapa software yang digunakan pada penelitian ini yaitu program BioEdit dan Program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) dari situs NCBI (www.ncbi. nlm.nih.gov) untuk menganalisis hasil sekuensing.
41 Pelaksanaan Penelitian Identifikasi secara morfologi dan biokimiawi terhadap 14 isolat lokal S. aureus diperoleh dari tahapan penelitian yang sudah dilakukan oleh Apriyadi (2010). Tahapan penelitian selanjutnya adalah melakukan identifikasi molekular yang meliputi: (a) isolasi DNA genom keempat belas isolat lokal S. aureus dan 1 isolat pembanding (S. aureus ATCC 25923) metode ekstraksi Doyle dan Doyle (1990) dengan beberapa modifikasi, (b) amplifikasi, visualisasi dan sekuensing gen 16S rrna untuk menentukan persen kemiripan antar isolat-isolat lokal S. aureus tersebut dengan menggunakan program BioEdit dan program BLAST dari situs NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) dan (c) amplifikasi gen penyandi enterotoksin stafilokoki A (SEA) serta C1 (SEC1). Diagram alir pelaksanaan penelitian ditampilkan pada Gambar 3. Isolat S. aureus Persiapan kultur bakteri S. aureus dan pewarnaan Gram Spektrofotometri Isolasi DNA genom bakteri S. aureus dengan modifikasi dari metode ekstraksi Doyle dan Doyle (1989) Visualisasi Amplifikasi gen 16S rrna Sekuensing Amplifikasi gen SEA dan SEC1 Gambar 3 Diagram alir pelaksanaan penelitian
42 Persiapan dan Pewarnaan Gram Kultur Bakteri S. aureus Persiapan Kultur Bakteri Persiapan kultur dilakukan dengan cara bakteri S. aureus diinokulasikan ke dalam media TSA miring dan diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35 o C. Penyimpanan kultur dilakukan pada suhu 10 o C selama kurang lebih 2 minggu untuk kemudian dilakukan penyegaran kultur (BAM, 2001). Pewarnaan Gram Bakteri Kultur bakteri S. aureus pada media TSA miring diambil sebanyak satu ose ke dalam gelas objek, yang sebelumnya sudah digenangi akuades steril sebanyak dua ose dan setelah itu difiksasi. Selanjutnya ditambahkan kristal violet satu tetes selama 1 menit, dipastikan semua bagian lapisan digenangi larutan pewarna, lalu dibilas sempurna larutan kristal violet dengan air dan dikeringkan dengan kertas hisap, untuk kemudian ditambahkan iodium/lugol sebanyak satu tetes selama 1 menit. Larutan iodium/lugol dibilas kembali dengan akudes steril dan dikeringkan kembali, untuk selanjutnya ditambahkan alkohol 96% selama 5-15 detik hingga tidak ada lagi sisa pewarna violet yang mengalir. Selanjutnya ditambahkan larutan safranin satu tetes selama 1 menit, setelah itu dibilas dengan akuades steril dan dikeringkan, untuk kemudian diamati di bawah mikroskop (Harrigan, 1998). Identifikasi Molekuler Kultur Bakteri S. aureus Persiapan Kultur Bakteri Kultur bakteri dari media TSA miring diambil sebanyak satu ose ke dalam media BHI untuk kemudian diinkubasi selama semalam. Kultur bakteri S. aureus dari media BHI ini akan digunakan untuk melakukan isolasi DNA genom bakteri.
43 Isolasi DNA Genom Bakteri Isolasi DNA genom bakteri S. aureus dilakukan dengan metode Doyle dan Doyle (1990) yang telah dimodifikasi. Sel bakteri dari media BHI yang telah diinkubasi semalam dipanen melalui perlakuan sentrifugasi. Sebanyak 1.5 ml kultur bakteri dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 2.0 ml dan disentrifugasi pada 8,000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 o C. Pelet yang diperoleh diresuspensi dalam 1 ml NaCl 0.85% dan disentrifugasi pada 8,000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 o C. Pelet yang diperoleh kembali diresuspensi dalam 1 ml bufer TES dan disentrifugasi pada 8,000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 o C. Pelet yang diperoleh diresuspensi dalam 900 µl bufer TE, 100 µl SDS 10% dan 2 µl lisozim (2 mg/ml), untuk kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 jam. Selanjutnya, ditambahkan 2.5 µl proteinase-k (10 mg/ml) dan diinkubasi kembali pada suhu 65 o C selama 30 menit, dimana tiap 10 menit tabung dibolak-balik. Tahap selanjutnya ditambahkan 900 µl larutan phenol : chloroform : isoamilalcohol (PCI) (25:24:1), divorteks selama 3 menit dan disentrifugasi pada 8,000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 o C. Fase cairan (top layer) 400 µl dipindahkan ke tabung Eppendorf 2.0 ml yang baru, lalu ditambahkan 400 µl bufer TE, 40 µl SDS 10% dan larutan PCI (25:24:1) dengan volume yang sama (840 µl). Selanjutnya disentrifugasi pada 8,000 rpm selama 10 menit dengan suhu ruang (25 o C) untuk memisahkan fase campuran. Setelah itu, top layer dipindahkan kembali sebanyak 400 µl ke tabung Eppendorf 1.5 ml yang baru, lalu ditambahkan 0.1 volume sodium asetat 3 M ph 4.8 (40 µl) dan 2.0 volume etanol 100% (880 µl), kemudian dibolak-balik hingga tercampur merata. Tabung diinkubasi pada suhu -20 o C selama 1 jam, lalu DNA dipresipitasi dengan mensentrifugasi pada 13,500 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 o C. Pelet ditambahkan 500 µl etanol 70% dan tabung dibolak-balikkan beberapa kali. Setelah itu disentrifugasi kembali pada 13,500 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 o C. Pelet DNA dikeringkan dan diresuspensi dalam 40 µl akuabides steril. Untuk penyimpanan jangka panjang, larutan DNA disimpan pada suhu -20 o C. Verifikasi DNA dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1.5% dan 1x bufer TAE pada voltase 50 selama 45 menit. Gel kemudian diwarnai dengan
44 Ethidium Bromide (EtBr) dan divisualisasi pada panjang gelombang 302 nm (Geldoc XR, Bio-Rad). Uji kuantitas DNA genom hasil isolasi berupa kemurnian dan konsentrasi dilakukan dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang (λ) 260 nm dan 280 nm. Menurut Suharsono dan Widyastuti (2006), perhitungan kemurnian DNA diperoleh dari rasio nilai absorbansi (A) pada λ 260 nm dengan nilai absorbansi λ 280 nm atau seperti yang dirumuskan sebagai berikut: Kemurnian DNA = A λ 260 A λ 260 Perhitungan konsentrasi DNA diperoleh dari hasil perkalian antara nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dengan lima puluh dan faktor pengenceran seperti yang dirumuskan sebagai berikut: Konsentrasi DNA = A λ 260 x 50 x faktor pengenceran Amplifikasi Gen 16S rrna Bakteri Amplifikasi gen 16S rrna bakteri S. aureus dilakukan dengan menggunakan satu pasang primer, yaitu 63f dan 1387r (Marchesi et al, 1998). Protokol PCR yang digunakan adalah pre-pcr (95 o C, 3 menit), denaturasi (94 o C, 30 detik), penempelan primer (55 o C, 30 detik), elongasi atau pemanjangan primer (72 o C, 1 menit) dan post-pcr (72 o C, 5 menit) dengan siklus amplifikasi sebanyak 30 kali. Sebanyak 10 µl hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1.5% (w/v), dengan menggunakan 1x bufer TAE (Tris HCl- acetic acid-edta) pada voltase 50 selama 45 menit.
45 Sekuensing Gen 16S rrna Bakteri Fragmen DNA hasil PCR dimurnikan sebelum dilakukan sekuensing. Pemurnian produk PCR perlu dilakukan untuk mengurangi pengotor-pengotor berupa Mg 2+, DNA template dan dntp yang berlebih yang dapat mengganggu proses perunutan basa nukleotida sehingga dapat menimbulkan kesalahan dalam pembacaan hasil sekuensing (Applied Biosystem, 2002). Gen penyandi dari produk PCR yang telah diisolasi dan dimurnikan selanjutnya di-sekuensing dengan menggunakan ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer dengan 4-Capillary System (Applied Biosystem), dimana tahapan ini dilakukan di PT. Macrogen Inc., Seoul, Korea Selatan. Hasil sekuensing diolah dengan program BioEdit, kemudian dianalisis dengan menggunakan program BLAST dari NCBI (National Center of Biotechnology Information) pada situs (www.ncbi.nlm.nih.gov) untuk dibandingkan dengan data sekuen parsial gen 16S rrna dari beberapa galur S. aureus. Amplifikasi Gen Penyandi SEA dan SEC1 Untuk mengamplifikasi gen penyandi SEA digunakan primer SEA-1 dan SEA-2. Untuk SEC1 digunakan primer SEC1-1 dan SEC1-2 (Johnson et al., 1991). Protokol PCR yang digunakan untuk amplifikasi gen SEA adalah pre-pcr (95 o C, 3 menit), denaturasi (94 o C, 2 menit), penempelan primer (55 o C, 90 detik), elongasi atau pemanjangan primer (72 o C, 1 menit) dan post-pcr (72 o C, 5 menit) dengan siklus amplifikasi sebanyak 30 kali. Protokol PCR untuk amplifikasi gen SEC1 adalah pre-pcr (95 o C, 3 menit), denaturasi (94 o C, 30 detik), penempelan primer (54 o C, 30 detik), elongasi atau pemanjangan primer (72 o C, 1 menit) dan post-pcr (72 o C, 5 menit) dengan siklus amplifikasi sebanyak 30 kali. Hasil PCR sebanyak 10 µl dielektroforesis pada gel agarosa 1.5% (w/v), dengan menggunakan bufer 1x TAE pada voltase 70 selama 60 menit.