DASAR BIOTEKNOLOGI TANAMAN Darda Efendi, Ph.D Nurul Khumaida, Ph.D Sintho W. Ardie, Ph.D Departemen Agronomi dan Hortikultura, Faperta, IPB 2013
Marka = tanda Marka (marka biologi) adalah sesuatu/penanda yang dapat membedakan satu individu atau populasi dengan individu/populasi lainnya.
Marka Morfologi (marka klasik atau marka terlihat), berupa marka fenotipik: Marka biokimia (berupa variasi enzim karena perbedaan alel), Misalnya warna/bentuk daun, bunga, bentuk biji, isozymes/isoenzim, perbedaan enzim yang bisa dideteksi dengan elektroforesis dan pewarnaan khusus. Marka DNA/Marka Molekuler/Marka Genetik; Potongan/fragmen DNA pada lokasi tertentu dalam genom.
Marka Level Analisis Morfologi Fenotipe Biokimia Produk dari gen Molekuler Sekuen DNA Marka morfologi dapat dilihat dengan mata Marka biokimia dan marka molekuler tidak terlihat, sehingga dibuat suatu metode/teknik untuk memunculkan perbedaan marka tersebut berdasarkan pita-pita yang muncul pada gel agarose hasil elektroforesis.
Penggunaan Marka Phenotyping dan Genotyping Keterkaitan Evolusi Deteksi Kontaminasi dalam Populasi Diaknosis penyakit Bukti Forensik Marker Assisted breeding (Pemuliaan dengan bantuan Marka) dll
Marka fenotip: bentuk/warna daun, bulu batang/daun, gerigi daun, warna batang & cabang, warna kulit dan daging umbi, warna petal dan sepal, dll. Bersifat resesif Sangat dipengaruhi oleh lingkungan Sulit dibedakan; terkadang sangat subjektif Adanya fenotipe antara Sulit dilakukan automatisasi
Merah Delima Beda warna kulit buah Citra Beda ukuran buah
Bentuk Umbi Warna daun muda & daun tua Warna kulit luar Warna korteks
Berbagai bentuk molekul dari enzim dengan aktivitas katalis yang mirip/identik, terjadi pada organisme yang sama Jumlah lokus yang tersedia terbatas Metoda pengujian yang unik Variasi alel yang terbatas Keuntungannya karena bersifat Codominant
Didasarkan pada adanya variasi dalam untaian DNA, yang bisa terjadi karena: Mutasi basa tunggal Insersi/delesi (penambahan/pengurangan DNA) Penataan ulang DNA dalam genom Tersedia dalam jumlah yang banyak Tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan tahap perkembangan tanaman. Dapat dilakukan pada berbagai tahap perkembangan tanaman, sehingga dapat dilakukan sedini mungkin.
Marka berbasis hibridiasasi: RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats; minisatellites) Marka berbasis PCR RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) AFLP (Amplification frgment Length Polymorphism) CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism Site) SSR (Simple Sequence repet (microsatellite) SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Marka berbasis sekuen DNA
Pada marka molekuler yang bisa kita lihat bukanlah DNA, tetapi ada/tidak adanya pita fragmen DNA pada gel hasil elektroforesis. Polimorfik: marka yang menghasilkan pita yeng berbeda sehingga dapat membedakan individu yang diuji: Dominan (AA = Aa vs aa) Codominan (AA vs Aa vs aa) Monomorfik: marka yang tidak bisa membedakan individu yang diuji.
Kodominan Dominan
Marker Plant A Plant B Plant C - Monomorphic bands Polymorphic bands + Presens of a band, 1 Absence of a band, 0
Ko-dominan Uji nondestruktif/ tidak merusak Complete penetrance Bisa terjadi dan teramati sedini mungkin Polimorfik tinggi Acak sebarannya di genom Uji bisa diautomatisasi
Restriction fragment length polymorphism (RFLP or riflip) Sepotong DNA Homolog yang bervariasi panjangnya setelah dipotong dengan enzim restriksi.
Isolasi DNA Pemotongan DNA dgn enzim restriksi Pemisahan DNA berdasar molekulnya dengan elektroforesis Denaturasi DNA/pemisahan untai ganda Blot DNA untai tunggal ke membran Persiapan probe (akan berhibridisasi dg DNA yang ada pada pita hasil elektroforesis) Hibridisasi DNA di membran dengan probe (SOUTHERN BLOT) Foto dengan autoradiografi
Untaian DNA dengan tempattempat yang dikenal oleh enzim restriksi Fragmen-fragmen setelah dipotong oleh enzim restriksi Molekul DNA paling pendek = bobot molekul paling rendah, maka bergerak paling jauh dari titik awal pada gel elektroforesis
Enzim restriksi BamHI memotonga DNA pada sekuen CGATCC; terbentuk pita ukuran 4 kb Sekuen CGGTCC tidak dikenal oleh BAmHI sehingga DNA tidak terpotong disini; terbentuk pita 9 kb. Contoh pita RFLP
Pengekspresian potongan DNA dari RFLP
Keuntungan Highly polymorphic Co-dominant inheritance Many loci can be established Kerugian: The technique is laborious Time-consuming Expensive Usually uses isotope
RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) RAPD adalah marka berbasis PCR yang menggunakan primer tunggal berukuran 10 nukleotida untuk mengamplifikasi fragmen DNA secara acak dari DNA contoh. Dulu paling banyak digunakan, sekarang mulai ditinggalkan orang.
Amplifikasi DNA secara acak PCR dengan primer berisi 10 basa Hanya 1 primer per reaksi Amplifikasi terjadi jika ada 2 molekul primer yang berjarak kurang dari 1000 bp, dengan posisi berlawanan arah saling berhadapan.
Hasil PCR kemudian dipisahkan dengan elektroforesis. Kemungkinan terjadi perbedaan antar contoh DNA.
Template DNA Primer menempel pada banyak lokasi template DNA secara acak (random) Hanya primer yang menempel berdekatan, dengan arah berlawanan saling mendekat yang akan mengamplifikasi DNA.
Templat e DNA 100-1,500 bases Pasangan primer yang akan mengamplifikasi fragment DNA pada PCR Tidak ada hasil yang akan teramplifikasi
Cepat, mudah, relatif murah. Banyak lokus yang bisa diidentifikasi dengan cepat. Uji bisa diautomatisasi. Kerugian Polimorfis bersifat dominan (tidak bisa membedakan AA dengan Aa Polimorfis alelnya rendah Hasil kurang konsisten
Perbandingan Beberapa Marka Molekuler