18 BAB I I I BAHAN, ALAT DAN METODE 1. Bahan. 1. 1, Bahan kim ia, Semua bahan k im ia yang digunakan adalah p roduksi S. Merck Darmstadt dengan d e ra ja t "pro ana l i s a ", k ecu ali ap a b ila disebutkan l a i n, '? ia» in HC1 yang di gun akan adalah produksi Takeda, Hor- mon pertumbuhan 2,4-D yang d i gun akan adalah produksi d ari Sigma dan agar yang digunakan adalah Bacto Agax, Difco C e n trifie d, D ifco L ab o rato ries f D e tro it Michigan USA. 1.2, P isan g, P isan g yang digunakan pada p e n e litia n in i a- dalah p isan g ambon masak dengan k r i t e r i a sebagai (1 9 ) berikm t Z ' - selu ru h permukaan berwarna kuning. - nampak b ercak-b ercak sawo matang pada permukaannya. - pada i r is a n m elintang, permukaannya berbentuk b u lat dan sik u -sik u tid ak nampak. Pengambilannya dilakukan di beberapa pasar di Ko tamadya Surabaya. 1. 3, K alus Solanum mammosum L. Kalus Solanum mammo sum L y m g di gun akan pp da p e n e litia n in i d ip eroleh d ari Laboratorium B io -
19 tek n ologi Ju ru san B io lo g i Farm asi, Fak u ltas P a r- masi U n iv e rs ita s A irlan gga, y*ng ditumbuhkan pada media MS* (Ie n a e n i, 1 9 8 6 ). 1. 4. Media. Media yang digunakan pada p e n e litia n i n i ada lah. media MS yang d im od ifik asi (MS')f yang te r d i r i a t a s makroelemen an organ ik, mikroelemen anorganik, vitam in, suplemen organik la in, m isalnya as am amino ( g l i s i n ), hormon pertumbuhan d a ri go- longarn s ito k in in (k in e tin ) dan auksin ( 2, 4-D ). Komposisi kimiawi media MS dan MS' t e r t e r a pada lam piran 4 dan 5. Tabel II.Macam media yang digunakan. Macam media. J J e a ia -MS* + pisang ambon masak t A 10 <f> B 15 * C 20 D 25 Semua media di a ta s tid a k menggunakan sukrose. 2. A la t. - Laminar a i r flow cab in et "Kottermann" 8580. - A utoklaf 25 1 (American P o rtab le Autoclave WAP Co In c. ). - ph-meter P ish e r.
PO - Blender "M aulinex". - B o to l k u ltu r, 0 4 cm, tin g g i 7 cm* - Mikroskop "Olympus". - Timbangan a n a litik " S a r to r iu s ". If Lempeng ja d i K ie s e lg e l 60 P?54, E. Merck. 3. Metode. 3, 1. pembuatan m edia. Pembuatan media dilakukan sesu ai dengan raeto da M urashige^-^. Masing-masing komponen media yang t e r d i r i d a ri makroelemen anorganik, m ikroelemen anorganik, vitam in, hormon pertumbuhan dan as am amino dibuat la ru ta n stok. Dengan mencampur la ru ta n stok ta d i (masing-masing diambil 10 m l), 100 mg m io -in o s ito l, p isan g ambon masak yang t e - lah dihaluskan ditambah a ir su lin g hingga d ip er- oleh sstu l i t e r media. ph la ru ta n media d ia tu r 5,6 dengan menambahkan la ru ta n NaOH 0,1 N atau HC1 0,1 N. S etelah ditambah dengan 1 i* agar, l a ru tan media dipanaskan sambil te ru s diaduk pai mendidih. L aru tan media yang masih panas d i- tuang ke dalam b o to l k u ltu r leb ih kurang 25 ml tia p b o to l, d itu tu p ra p a t dengan aluminium f o i l, dan d iik a t dengan t a l i atau benang. S t e r i l i s a s i media dilakukan pada. au to k laf 121 C selama 20 me n it? ).
21 3-2. Pemindahan k alu s. Pemindahan k alu s dilakukan s e ca ra a s e p tic pa da "lam inar a i r flow c a b in e t". Sebelum digunakan lam inar a i r flow cab in et in i diseraprot dulu dengan etan ol 70 $> sambil udara d ialirlcan selam satu jam. Kalus yang fcudah berumur dua sampai t i ga minggu dipindah ke media yang baru yang komposisinya. Pemindahan k alus untuk t ia p - saraa tla p t e t o l k u ltu r sama banyaknya s e ca ra v is u a l. Pemin dahan k alu s ke media yang baru yang sama komposi sin ya dilakukan sebanyak lim a k a li pemindahan da r i t>emindahan yang pertam a (lim a p a s a s i). 3.3* Penimbangan bobot k alu s. Penimbangan bobot kalus dimulai sete la h medi a d i i s i dengan k alu s, disebmt sebagai b e ra t awal k slu s. Setel'aft kal-a& bfertutiur~satu ming&u sampai empat minggu dilakukan penimbangan l a g i, dan in i d iseb u t sebagai b e ra t akhir k alu s. Cara penimbangan: k alus dikeluarkan d ari b o to l k u ltu r, dibersihkan d ari s is a media kemudian d i- timbang. Kalus yang sudah ditimbang kemudian di~ keringkan untuk d ie k s tra k si. 3*4* A n alisa p r o f il kandungan kalus Solanum mammosum L. 3.4.1. E k strak si s te r o id d ari k alu s. E k strak si s te ro id d ari kalus Solanum
?? mammosum L s e c a ra skem atis t e r t e r a -pada lam piran 2. Kalus h a s il penimb?ngan dikeringkan dalam lem ari pengering pada suhu 40-60 C, d i- serbuk dan dihomogenkan. Ditimbang 5 gram serbuk k alu s, d ire flu k s dua k a li selama 3 jam dengan 50 ml petroleuraeter pada 60-65 C. S etelah d isa rin g, f i l t r a t petroleum e te r dipisahkan dan ampasnya d ire flu k s sa tu k a li selama 2 jam dengan 50 ml aseton pada suhu 80-85 C- F i l t r a t aseton d ip i sahkan dan ampasnya d ih id ro lis a dengan 50 ml HC1 2 N pada suhu 100 C selama 2 j?m. Getelah ^in p trrlk nn 1 K kemudian d i^ arin g dan k e rta s sarin g bersansu sama ampasnya dikeringkan di dalam \ecisri pengering pada suhu 50 C. Kemudian d iref-*; luks satu k a li selama jam dengan 50 ml kloroform. Masing-masing fra k si ( ) Premudian d ia n a lis a dengan KLT '. diuapkan 3.4.2. A nalisa h a s il ek strak si kalus Solanum mam mo sum L dengan KLT. Kromatografi dilakukan pada jad i K ieselg el 60 F 254 dengan lempeng,pen,ampfiik noda an isald eh id a. Lempeng h a s il kromatog r a f i dikeringkan dalam lem ari nengering
selama 5-1 0 raenit pnda suhu 100-105 C. Ekstrak rjetroleum eter d ie lu s i dengan n -h e k s a n a -e tila s e ta t 8 0 :2 0,s te r o l bebas a kan memberlkan warna ungu. E k strak aseto n d ie lu s i dengan kloroform -m etanol 95: 5. P i l t r a t kloroform d ie lu s i dengan k lo ro - f o r m -e tila s e ta t 4:1, diosgenin akan membe rik a n warna kuning k eh ijau an, sedangkan (3 ) so laso d in a raemberikan v:arna biru-unguv Pengumpulan d a ta. 3.5.1. Pemeriksaan makroskopik kal u s. - warna k alu s. - te k s tu r. - jfleferen si-asi -feel. 3-5.2. Pemeriksaan mikroskopik kalu s. - bentuk s e l. 3.5.3. Pemeriksaan pertumbuhan k a lu s. Sebagai param eter pertumbuhan kalus digunakan indeks pertumbuhan yang d id e fi- n isik an seb agai: b e ra t akhir; kalus ^ 100* b e re t awal kalus B e ra t awal k alu s d iperoleh d a ri: ^era t(m edia + k alus) ^era^(media) B e ra t awal k alu s d iperoleh d a ri h a s il pe_ nimbengan s e te la h pemindahan dan b e ra t Tak h ir kalus d in eroleh d^ri h a s il penimbang-
?A an tia p minggu. D ari d ata yang diperoleh kemudian dibuat kurva indeks pertumbuhan ra tsu -ra ta kalus Vs umur k alus (minggu) dan kurva indefcs pertumbuhan r a t a - r a t a k alus Vs p a sa si. 3-5.4- A nalisa s t a t i s t i k. Untuk mengetahui apakah ada perbeda^ an yang bermakna an tar mr-cam media, pasa s i dan umur k alu s, maka dilakukan c a r a a n a lis a v a ria n "d isaan f a k to r ia l a x b x c ", c a r a rengolahan datanya t e r t e r a pada lam piran K eterangan: fa k to r a = macam media fa k to r = p asasi fa k to r c = umur kalus 3.5.5. Pemeriksaan h a s il ek strak si kalus Sola - num mammosum L dengan KLT. - juralah noda. - warna no da. - harga R f#