III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1. Bahan Penelitian 3.1.1 Objek Penelitian Objek penelitian menggunakan semen kambing Peranakan Etawah berumur 2-3 tahun sebanyak lima ekor. 3.1.2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan adalah : N2 cair, aquadest, NaCl fisiologis, alkohol 70%, eosin, acidium citricum, telur, fruktosa, penicillin, streptomycin, gliserol, glutathione. 3.1.3. Peralatan Penelitian Peralatan yang dibutuhkan pada penelitian ini adalah : vagina buatan, mikroskop, erlenmeyer, counteiner, bunsen, kertas hisap, kertas lakmus, object glass, cover glass, gelas ukur, ph meter, kotak styrofoam, Haemocytometer, kamar hitung Neubauer, straw, kulkas. 3.2. Metode Penelitian 3.2.1. Prosedur Penelitian 3.2.1.1. Penampungan Semen Penampungan semen menggunakan metode vagina buatan. Sebelum semen ditampung terlebih dahulu dirangsang menggunakan hewan pemancing (teaser). Sewaktu penampungan suhu di dalam vagina buatan harus menyerupai kondisi vagina asli berkisar antara 38-40ºC. Sesudah diisi air dengan suhu dan tekanan yang
sesuai, bagian vagina buatan diolesi dengan pelicin lebih kurang sepertiga panjang vagina buatan 3.2.1.2. Pemeriksaan Spermatozoa Semen yang diperoleh dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi secara makroskopis meliputi pemeriksan volume (ml), warna, ph (ph special indicator paper; Merck, skala 6,5-10) dan konsistensi. 1. Evaluasi Makroskopis : a) Volume Semen Pemeriksaan volume semen dapat langsung dilakukan dengan melihat skala pada tabung penampung semen. b) Warna Semen Pemeriksaan dilakukan dengan melihat kelainan pada warna semen seperti warna merah akibat kontaminasi darah atau hijau akibat kontaminasi feses. c) ph Semen ph semen diukur dengan menggunakan kertas lakmus dengan cara meneteskan semen ke atas kertas lakmus. Selanjutnya, amati perubahan warna pada kertas lakmus dan bandingkan dengan standar warna ph meter. d) Konsistensi Kekentalan diamati dengan cara memiringkan tabung semen lalu tegakkan kembali. Apabila semen yang mengalir pada dinding tabung lambat, maka konsistensinya tinggi (kental). Namun, jika sebaliknya maka konsistensinya rendah (encer).
2. Evaluasi Mikroskopis : a) Gerakan Massa Teteskan sedikit semen ke atas objek glass kemudian amati dibawah mikroskop dengan pembesaran 4 x 10. Gerakan massa diamati dengan melihat adanya kecenderungan bergerak bersama-sama ke satu arah, membentuk gelombang yang tipis atau tebal, dan bergerak cepat atau lambat. b) Menghitung Konsentrasi Total Sperma Perhitungan konsentrasi dilakukan dengan menggunakan Haemocytometer dan kamar hitung Neubauer. Pertama hisap semen dengan pipet erythrocyte hingga tanda 0,5 lalu hisap larutan NaCl fisiologis hingga tanda 101. Kocok dengan membentuk angka delapan hingga homogen, lalu buang tetesan pertama dan kocok kembali. Teteskan satu tetes pada kamar hitung Neubauer yang telah ditutup dengan objek glass. Kemudian hitung jumlah sel spermatozoa dalam lima kamar menurut arah diagonal. c) Menghitung Motilitas Sperma Prosedur penggunaan sama dengan perhitungan konsentrasi total. Namun pada perhitungan motilitas, cairan pengencer yang digunakan adalah NaCl fisiologis pada evaluasi semen segar dan larutan sitrat pada evaluasi semen post thawing. Pada evaluasi motilitas sperma hitung jumlah sel spermatozoa yang mati pada lima kamar. d) Menghitung Abnormalitas Sperma Penentuan abnormalitas sperma menggunakan metode pewarnaan diferensial yaitu dengan meneteskan satu tetes semen di atas object glass. Kemudian teteskan larutan warna eosin. Selanjutnya amati dibawah mikroskop
dengan pembesaran 10 x 40 atau 10 x 100. Pengamatan dilakukan sebanyak kurang lebih 200 sel spermatozoa. 3.2.1.3. Pembuatan Bahan Pengencer Pembuatan pengencer sitrat-kuning telur menimbang 2,9 gram sitrat natricus dihydrat (Na2C6H5O7.2H2O) dan 0,5 fruktosa masukkan kedalam erlenmeyer kemudian tambahkan 100 ml aquabidestillata, homogenkan dan ukur ph, campur dengan kuning telur dalam perbandingan 80% pengencer dan 20% kuning telur. Telur dipecahkan dengan pisau atau pinset steril. Semua putih telur ditumpahkan dan dipisahkan dari kuning telur. Kuning telur yang masih utuh dan masih terbungkus oleh selaput vitelline ditempatkan pada suatu kertas penyerap atau kertas saring untuk menyerap semua putih telur yang tersisa. Kemudian kuning telur dipecahkan dan dialirkan kedalam suatu gelas pengukur dan meninggalkan sisa-sisa putih telur dan selaput vitelline pada kertas penyerap atau kertas saring. Sesudah itu barulah larutan penyanggah dimasukkan kedalam gelas pengukur yang berisi kuning telur sejumlah perbandingan yang dibutuhkan. Semua bahan diaduk secara perlahan agar tidak menimbulkan busa yang berlebih hingga merata menggunakan batang pengaduk. 3.2.1.4. Pembuatan Semen Cair V X KT X M Perhitungan Jumlah Dosis = KSM V = Volume Semen KT = Konsentrasi Total Sperma M = Motilitas KSM = Konsentrasi Sperma Motil
Perhitungan diatas berfungsi untuk menentukan banyaknya pengencer yang akan ditambahkan pada tabung berisi semen. Cara penambahannya dilakukan sedikit demi sedikit pada dinding tabung, kemudian homogenkan. a) Penambahan Gliserol Setelah semen dicampur dengan pengencer, selanjutnya tambahkan gliserol sebanyak 6%. Penambahan gliserol berfungsi untuk memodifikasi pembentukan kristal-kristal es pada proses pembekuan, sehingga dapat menghambat terjadinya kerusakan sel. b) Penambahan Antioksidan Pengencer yang telah dibuat sesuai dengan kebutuhan semen dibagi menjadi lima untuk masing-masing perlakuan, yaitu dengan penambahan glutathione sebanyak 4 mm, 6 mm, 8 mm, dan 10 mm/100 ml pengencer. Penambahan glutathione dilakukan dengan cara melarutkan terlebih dahulu 600 mg glutathione kedalam cairan pelarut 4 ml. Kemudian glutathione yang telah dilarutkan diambil sesuai kebutuhan setiap perlakuan untuk dicampurkan kedalam pengencer yang telah disediakan. Molaritas = gr x 1000 Mr ml M = Molaritas gr = Massa zat terlarut (gram) Mr = Massa molekul relatif zat terlarut c) Pengemasan Semen (Filling dan Sealing) Semen dikemas menggunakan straw dengan volume 0,25 ml. Tuangkan semen ke dalam cawan untuk pengisian straw, kemudian hidupkan pompa
penghisap agar semen masuk kedalam straw. Selanjutnya ujung straw yang telah berisi semen ditutup menggunakan tepung polyvinyl alcohol. d) Ekuilibrasi dan Freezing Ekuilibrasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh spermatozoa untuk menyesuaikan diri sebelum dilakukan pembekuan. Ekuilibrasi dilakukan dengan cara menempatkan straw pada temperatur 5ºC selama 2-4 jam. Sebelum dibekukan straw dimasukkan ke dalam styrofoam untuk dilakukan proses pre freezing pada N2 cair selama 7-8 menit. Selama penguapan jarak antara straw dari permukaan cairan 3-5 cm. Selanjutnya masukkan straw kedalam kontainer yang berisi nitrogen cair untuk dibekukan dengan suhu mencapai -196ºC. e) Pencairan Kembali (Thawing) Semen yang telah dibekukan, dicairkan kembali untuk mengetahui keberhasilan pembekuan semen. Proses thawing dilakukan dengan cara memasukkan ke dalam bejana berisi air hangat bersuhu 38ºC selama 30 detik. 3.2.2. Peubah yang Diamati a. Motilitas Spermatozoa Motilitas spermatozoa dihitung dengan menggunakan kamar hitung Neubauer yang telah ditetesi larutan semen yang terdiri atas larutan semen dan larutan pengencer sitrat kuning telur. Spermatozoa yang bergerak tidak progresif dan yang mati dihitung sebagai sperma mati. Selisih antara perhitungan pengamatan konsentrasi total spermatozoa dengan spermatozoa mati adalah jumlah spermatozoa hidup.
Persentase motilitas spermatozoa adalah : %Motilitas Spermatozoa = Spermatozoa total Spermatozoa yang mati Spermatozoa total x 100% b. Abnormalitas Spermatozoa Perhitungan abnormalitas sperma dilakukan dengan melihat penyimpangan bentuk morfologi sperma dengan menggunakan pewarnaan diferensial yaitu menuangkan setetes semen diatas objek glass lalu tambahkan larutan eosin 2% dan buat preparat ulas kemudian fiksasi diatas nyala api. Abnormalitas spermatozoa terdiri dari dua kelompok, yaitu abnormalitas primer dan abnormalitas sekunder. Abnormalitas primer ditandai dengan adanya sperma yang memiliki ukuran kepala lebih besar, kepala ganda atau ekor ganda, dan bentuk kepala tidak normal. Abnormalitas sekunder ditandai dengan adanya kepala sperma yang pecah, ekor putus dan ekor melipat. Abnormalitas yang dihitung sebanyak 200 spermatozoa. Persentase abnormalitas sperma dapat dihitung dengan cara : % Abnormalitas Spermatozoa = jumlah spermatozoa abnormal 200 3.2.3. Rancangan Percobaan dan Analisis Statistik x 100% Penelitian ini menggunakan metode eksperimental laboratoris. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 5 ekor kambing sebagai kelompoknya. Perlakuan yang dilakukan terdiri dari 5 perlakuan, yaitu tanpa pemberian glutathione (0 mm), 4 mm, 6 mm, 8 mm, dan 10 mm. Setiap perlakuan diulang sebanyak 5 kali, sehingga terdapat 25 unit percobaan. 1. P0 = semen + pengencer tanpa penambahan glutathione
2. P1 = semen + pengencer yang ditambahkan glutathione 4 mm/100 ml pengencer 3. P2 = semen + pengencer yang ditambahkan glutathione 6 mm/100 ml pengencer 4. P3 = semen + pengencer yang ditambahkan glutathione 8 mm/100 ml pengencer 5. P4 = semen + pengencer yang ditambahkan glutathione 10 mm/100 ml pengencer Model matematik yang digunakan adalah sebagai berikut : Yij = μ + γi + βj + Ɛij Yij = Nilai pengamatan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j μ = Nilai rata-rata umum γi = Pengaruh aditif perlakuan ke-i βj = Pengaruh aditif dari kelompok ke j Ɛij = Galat i = perlakuan ke-i (1,2,3,4,5) j = ulangan ke-j (1,2,3,4,5) ulangan= kelompok Asumsi : a. Komponen-komponen μ, γi, βj, dan Ɛij bersifat aditif. Ʃ b. Nilai-nilai γi (i=1,2,3,4,5) tetap, i γ i=0 ; dan E (γi) = γi. c. Nilai-nilai βj (j=1,2,3,4,5) tetap, j β j =0 ; dan E (βj) = βj. Ʃ d. Ɛij timbul secara acak, menyebar secara normal dengan nilai tengah sama dengan nol dan ragam σ 2. Hipotesis :
H0 : P1 = P2 = P3 = P4 = P5 Berarti tidak ada perlakuan yang berpengaruh terhadap motilitas dan abnormalitas spermatozoza. H1 : P1 P2 P3 P4 P5 Berarti ada minimal satu perlakuan yang berpengaruh terhadap motilitas dan abnormalitas spermatozoza. Data yang diperoleh kemudian dianalisis menggunakan sidik ragam untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap motilitas dan abnormalitas spermatozoza. Tabel 1. Sidik Ragam Sumber Keragaman db JK KT Fhit F0,05 Kelompok r-1 JKK KTK KTP/KTG Perlakuan t - 1 JKP KTP Galat (t-1)(r 1) JKG KTG Total tr-1 JKT Sumber : Gaspersz, 1995 db = Derajat Bebas JK = Jumlah Kuadrat KT = Kuadrat Tengah t = Total Perlakuan r = Ulangan Kaidah keputusan : 1. Bila Fhit Ftabel, maka H0 diterima (non significant) = tidak berbeda nyata) 2. Bila Fhit Ftabel, maka H0 ditolak (significant = berbeda nyata) Jika H0 ditolak, maka selanjutnya untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan dilakukan analisis dengan menggunakan Uji jarak Berganda Duncan, dengan rumus SX = KTG r
LSR = SSR X SX LSR = Least Significant Range (jarak beda nyata terkecil) SSR = Studentized Significant Range SX = Galat Baku KTG = Kuadrat Tengah Galat r = Ulangan Periode Bila selisih antara perlakuan dibanding dengan LSR, kaidah keputusan 1. Bila d nilai LSR, maka non significant 2. Bila d nilai LSR, maka significant d = Selisih antar perlakuan