BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Survei penyakit mosaik dan koleksi sampel tanaman nilam sakit dilakukan di Kebun Percobaan Balai Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) di daerah Gunung Bunder dan Cicurug, Bogor, Jawa Barat. Deteksi virus dilakukan di Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan Maret sampai November 2011. Metode Penelitian Pengambilan Sampel Tanaman Nilam Bergejala Mosaik di Lapangan Sampel tanaman nilam yang bergejala mosaik diperoleh dari Kebun Percobaan Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) di daerah Gunung Bunder dan Cicurug, Bogor, Jawa Barat. Sampel daun yang diambil dari lapangan dideteksi di laboratorium. Deteksi Potyvirus melalui I-ELISA Teknik deteksi diawali dengan menggerus sampel tanaman nilam sebanyak 0,1 g dalam buffer coating ph 9,6 dengan perbandingan 1:5 (b/v). Sebanyak 100 µl sampel tanaman kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing sumuran plat mikrotiter ELISA dan diinkubasi semalam pada suhu 4 C. Cairan sampel tanaman dalam plat mikrotiter dibuang kemudian plat di cuci dengan phosphate buffer saline tween-20 (PBST) sebanyak dua kali kemudian masingmasing sumuran diisi dengan 100 µl skim milk 2%. Plat diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 C. Setelah itu buang dan keringkan plat mikrotiter kemudian masing-masing sumuran diisi dengan antiserum Potyvirus sebanyak 100 µl dan diinkubasikan selama 2-4 jam pada suhu 37 C. Antiserum tersebut telah diencerkan terlebih dahulu menggunakan buffer conjugate dengan perbandingan 1:1000. Plat mikrotiter kemudian dicuci dengan PBST sebanyak tiga kali dan kemudian diisi dengan 100 µl konjugat yang dilarutkan dalam conjugate buffer dengan perbandingan 1:1000. Plat mikrotiter kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 C. Setelah inkubasi selama 2 jam plat
11 mikrotiter dicuci menggunakan PBST sebanyak tiga kali. Masing-masing sumuran kemudian diisi dengan 100 µl PNP yang telah dilarutkan dalam substrate buffer dan diinkubasi pada suhu ruang dan di tempat gelap. Plat mikrotiter kemudian diuji secara kuantitatif menggunakan ELISA reader (Bio-RAD 550) pada panjang gelombang 405 nm setiap 30 menit selama 60 menit. Dalam setiap pengujian disertakan kontrol negatif yaitu tanaman sehat dan bufer. Pengujian dikatakan positif jika nilai absorban sampel yang diuji 2 kali lebih besar daripada kontrol negatif tanaman sehat. Deteksi Fabavirus melalui DAS-ELISA Teknik deteksi diawali dengan mengencerkan antiserum Fabavirus pada coating buffer dengan perbandingan 1:500. Sebanyak 100 µl antiserum dimasukkan kedalam masing-masing sumuran pada plat mikrotiter dan diinkubasikan selama 2-4 jam pada suhu 37 C. Plat mikrotiter kemudian dicuci menggunakan PBST sebanyak 2 kali. Sampel tanaman sebanyak 0,1 g digerus menggunakan extract buffer dengan perbandingan 1:5 (b/v) kemudian 100 µl dimasukan ke dalam masing-masing sumuran dan diinkubasi pada suhu 4 C selama semalam. Plat mikrotiter kemudian dicuci menggunakan PBST sebanyak 3 kali. Pada masing-masing sumuran dimasukkan 100 µl konjugat yang telah diencerkan pada conjugate buffer dengan perbandingan 1:500 dan diinkubasikan selama 4 jam pada suhu 37 C. Masing-masing sumuran dicuci kembali menggunakan PBST sebanyak 3 kali dan kemudian ditambahkan 100 µl PNP yang telah dilarutkan dalam substrate buffer dan diinkubasi pada suhu ruang dan di tempat gelap. Plat mikrotiter kemudian diuji secara kuantitatif menggunakan ELISA reader (Bio-RAD 550) pada panjang gelombang 405 nm setiap 30 menit selama 60 menit. Dalam setiap pengujian disertakan kontrol negatif yaitu tanaman sehat dan bufer. Pengujian dikatakan positif jika nilai absorban sampel yang diuji 2 kali lebih besar daripada kontrol negatif tanaman sehat. Deteksi Diferensial Potyvirus dan Fabavirus Melalui RT-PCR Untuk dapat membedakan Potyvirus dan Fabavirus yang menginfeksi tanaman nilam, dilakukan deteksi virus melalui metode RT-PCR dan
12 menggunakan primer khusus yang dapat digunakan dalam RT-PCR yang dapat mengamplifikasi virus secara terpisah. Ekstraksi RNA total. RNA total diekstraksi dari jaringan daun tanaman nilam bergejala penyakit mosaik dengan menggunakan Bench-Top Protocols for Xprep Plant RNA Mini Kit (PKT Korea). Tanaman yang diekstraksi merupakan tanaman yang telah diuji menggunakan ELISA dan positif Potyvirus dan Fabavirus. Tahapannya adalah sebanyak 0,1 g sampel daun digerus dengan menggunakan mortar dan pistil steril dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 450 µl bufer XPRB yang mengandung 1% mercaptoethanol, kemudian dihomogenkan. Sampel dipipet, lalu dimasukkan ke dalam filter coloumn putih dan ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml, lalu disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Supernatan dipipet tanpa menyentuh pelet dalam tabung koleksi, ukur volume supernatan yang diperoleh lalu dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml baru. Kemudian ditambahkan ethanol 96% (setengah dari volume supernatan) dan dicampur dengan rata. Sampel dimasukkan ke dalam XPPLR mini coloumn merah, kemudian ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml lalu disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian ditambahkan 500 µl wash buffer 1 ke dalam XPPLR mini coloumn, lalu ditutup dengan baik dan disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian ditambahkan 700 µl wash buffer 2 ke dalam XPPLR mini coloumn, lalu ditutup dengan baik dan disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian untuk mengeringkan XPPLR mini coloumn disentrifuse selama 3 menit pada 12000 rpm. Untuk meyakinkan bahwa coloumn telah kering, coloumn dipindahkan pada tabung koleksi baru. Selanjutnya, 50 µl RNAse free water ditambahkan ke dalam pusat membran XPPLR mini coloumn, didiamkan 1 menit lalu disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Siapan RNA total ini digunakan sebagai template dalam reaksi RT-PCR. Sintesis cdna. RNA hasil ekstraksi selanjutnya ditranskripsi balik menjadi cdna (complementary DNA) dengan menggunakan teknik Reverse Transcription
13 (RT). Reaksi RT dibuat dengan total volume 10 µl yang mengandung 2 µl RNA total, 2 µl bufer RT 10X, 0,35 µl 50 mm DTT (dithiothreitol), 2 µl 10 mm dntp (deoksiribonukleotida triphosphat), 0,35 µl M-MuLV Rev, 0,35 µl RNase inhibitor, 0,75 µl oligo (dt), dan 2,2 µl H 2 O. Komponen-komponen tersebut digunakan untuk satu kali reaksi RT. Reaksi RT dilakukan dalam sebuah Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA) yang diprogram untuk satu siklus pada suhu 25 ºC selama 5 menit, 42 ºC selama 60 menit, dan 70 ºC selama 15 menit. cdna hasil RT digunakan sebagai DNA template dalam reaksi PCR. Amplifikasi DNA dengan PCR. Amplifikasi DNA virus dilakukan dengan metode PCR dengan menggunakan pasangan primer yang telah didesain khusus untuk mengamplifikasi virus secara terpisah. Pasangan primer yang spesifik digunakan untuk mendeteksi Potyvirus yaitu CPUP(F) (5 - TGAGGATCCTGGTGYATHGARAAYGG-3, Y = C/T, H = A/T/C, R = A/G), spesifik untuk coat protein pada Potyvirus dan CP9502(R) (5 - GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ) spesifik untuk ujung 3 genom Potyvirus dengan prediksi ukuran produk 800 bp (Singh et al. 2009). Sedangkan pasangan primer yang spesifik digunakan untuk mendeteksi Fabavirus yaitu [BBWVVSSP (5 - GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3, B = C, G, atau T; D = A, G, atau T; Y = C atau T) dan BBWVKMRM (5 -TDGWDCCATCVAGICK CATTTT-3, W = A atau T; V = A, C, atau G; I = Inosine; K = G atau T)] dengan prediksi ukuran produk 322 bp mencakup wilayah dari C-terminal dari large coat protein (LCP) ke N-terminal small coat protein (SCP) (Kondo et al. 2005). Metode yang digunakan dalam penelitian ini untuk mengamplifikasi DNA Potyvirus, Fabavirus, dan keduanya yaitu digunakan pasangan primer Potyvirus, pasangan primer Fabavirus, dan pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus yang dicampur untuk mengamplifikasi DNA Potyvirus, Fabavirus, dan campuran kedua DNA tersebut. Reaksi PCR dengan total volume 25 µl, terdiri atas 1 µl masing-masing primer, 12,5 µl Go Tag Green Master Mix 2x (Promega, Madison, USA), 9,5 µl H 2 O, dan 1 µl DNA template. Amplifikasi ini dilakukan pada Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA). Untuk Potyvirus amplifikasi ini didahului dengan denaturasi
14 awal pada 94 ºC selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan 45 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94 ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 54 ºC selama 2 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC selama 1 menit. Khusus untuk siklus terakhir, ditambahkan 10 menit pada 72 ºC untuk tahapan sintesis, dan siklus berakhir pada suhu 4 ºC. Untuk Fabavirus amplifikasi ini didahului dengan denaturasi awal pada 95 ºC selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 95 ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 51 ºC selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC selama 1 menit. Khusus untuk siklus terakhir, ditambahkan 5 menit pada 72 ºC untuk tahapan sintesis, dan siklus berakhir pada suhu 4 ºC. Untuk pengujian yang dilakukan bersamaan menggunakan primer Potyvirus dan Fabavirus (Mix) amplifikasi ini didahului dengan denaturasi awal pada 95 ºC selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan 10 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 95 ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 51 ºC selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, kemudian dilanjutkan dengan 30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94 ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 54 ºC selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72 ºC selama 2 menit. Khusus untuk siklus terakhir, ditambahkan 10 menit pada 72 ºC untuk tahapan sintesis, dan siklus berakhir pada suhu 4 ºC. Setelah dilakukan PCR, maka hasil yang diperoleh dapat dielektroforesis. Elektroforesis. Agarose sebanyak 0,3 gr dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer 100 ml, lalu ditambahkan 30 ml bufer Tris-Borate EDTA (TBE) 0,5x (0,045 M Tris-Borate, 0,01 M EDTA), untuk pembuatan gel agarose. Kemudian dipanaskan dalam microwave selama 2 menit atau sampai agarose larut. Larutan agar didinginkan terlebih dahulu selama kurang lebih 15 menit, kemudian ditambahkan 1,5 µl ethidium bromida kemudian diaduk. Cetakan gel telah disiapkan terlebih dahulu dan sisir gel diletakkan di bagian atas pencetak gel kemudian larutan agarose dituang ke dalam cetakan. Gel didiamkan sampai mengeras (30-45 menit). Setelah mengeras, gel diambil dan diletakkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TBE 0,5 kali. DNA hasil PCR dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis sebanyak 5 µl dan 100 bp DNA ladder dimasukkan pada sumuran gel elektroforesis yang berada di posisi sebelah kiri
15 sebanyak 5 µl. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 100 volt selama 25 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan transluminator ultraviolet. Pita DNA yang terbentuk pada hasil elektroforesis tersebut difoto dengan menggunakan kamera digital. PCR dilakukan berkali-kali untuk melihat validitas pasangan primer Potyvirus, pasangan primer Fabavirus, dan pasangan primer keduanya. Tabel 1 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi validitas pasangan primer Potyvirus yang digunakan secara terpisah terhadap 3 template cdna yang berbeda (Potyvirus, Fabavirus dan keduanya). Komponen Volume(µl) 1 Volume(µl) 2 H 2 O 9,5 28,5 Gotag Green Master Mix 2x 12,5 37,5 Primer CPUP-F 1 3 Primer CP9502-R 1 3 cdna 1 3 Total Volume (µl) 25 75 1) Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi; 2) Volume total yang diperlukan sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi Tabel 2 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi validitas pasangan primer Fabavirus yang digunakan secara terpisah terhadap 3 template cdna yang berbeda (Potyvirus, Fabavirus dan keduanya). Komponen Volume(µl) 1 Volume(µl) 2 H 2 O 9,5 28,5 Gotag Green Master Mix 2x 12,5 37,5 Primer BBWVVSSP 1 3 Primer BBWVKMRM 1 3 cdna 1 3 Total Volume (µl) 25 75 1) Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi; 2) Volume total yang diperlukan sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi
16 Tabel 3 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk mendeteksi validitas pasangan primer Potyvirus dan Fabavirus yang digunakan secara bersamaan terhadap 3 template cdna yang berbeda (Potyvirus, Fabavirus dan keduanya). Komponen Volume(µl) 1 Volume(µl) 2 H 2 O 7,5 22,5 Gotag Green Master Mix 2x 12,5 37,5 Primer CPUP-F 1 3 Primer CP9502-R 1 3 Primer BBWVVSSP 1 3 Primer BBWVKMRM 1 3 cdna 1 3 Total Volume (µl) 25 75 1) Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi; 2) Volume total yang diperlukan sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi