HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Sampel Tanaman Hasil ekstraksi terhadap 50 g serbuk kering masing-masing sampel menghasilkan data seperti pada Tabel 1. Data pehitungan rendemen hasil ekstraksi selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 3. Tabel 1 Rendemen hasil ekstraksi dengan metode maserasi Sampel Rendemen (%) Etanol 30% Etanol 96% Kedawung 15.35 13.96 Jambu biji 10.93 12.58 Salam 15.21 11.65 Bangle 14.57 13.55 Sirih merah 25.8 11.17 Rendemen simplisia kedawung hasil ekstraksi etanol 30% dan 96% adalah berturut-turut 15.35%, 3.96%. Hasil rendemen ini lebih besar dari estrak n-heksan daun kedawung menggunakan metode refluk sebesar 1.64% dengan bobot daun 100 g (Tjisnajaya et al. 2006). Pelarut etanol merupakan pelarut polar yang melarutkan komponen senyawa polar dan n-heksan pelarut non polar yang melarutkan komponen non polar, sehingga jumlah senyawa yang terekstrak lebih banyak dengan menggunakan etanol. Rendemen ekstrak daun jambu biji dengan pelarut etanol 30% dan 96% didapatkan sebesar 10.93% dan 12.58%. Standar Monografi Nasional Indonesia (MNI) menyatakan bahwa rendemen ekstrak etanol murni daun jambu biji tidak kurang dari 12.3%. Rendemen ekstrak bangle tidak sesuai dengan standar MNI dimana rendemen ekstrak etanol 30% yang dihasilkan sebesar 14.57% dan etanol 96% sebesar 13.55%, sementara menurut standar MNI tidak kurang dari 25%. Hasil ekstraksi etanol 30% daun sirih merah didapatkan sebesar 25.8% dan etanol 96% sebesar 11.17%. Hasil rendemen ini lebih besar dari ekstrak etanol
70% daun sirih merah sebesar 4.42% (1.1195 g) dari 25 g daun sirih merah segar (Alfarabi 2010). Hasil ekstraksi etanol 30% daun salam sebesar 15.21 % dan etanol 96% sebesar 11.65%. Hasil ini lebih sedikit jika dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan Ekawati (2007), dimana rendemen ekstrak etanol 70% daun salam sebesar 18.45% yang diperoleh dari 20 g serbuk kering daun salam menggunakan metode refluk. Rendemen ekstrak yang dihasilkan dari 50 g serbuk kering menggunakan pelarut etanol 30% lebih banyak dibanding 96%. Pelarut etanol 30% lebih polar dibanding 96%, sehingga dapat melarutkan senyawa polar dan senyawa semi polar. Senyawa fenolik dan flavonoid umumnya mudah larut dalam air karena sering kali berikatan dengan gula sebagai glikosida (Harbone 1987). Perbedaan rendemen ekstraksi menunjukkan kandungan senyawa-senyawa metabolit sekunder yang berbeda dari sampel tanaman tersebut. Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Kasar dengan Metode DPPH Berdasarkan pengujian antioksidan menggunakan DPPH, ekstrak kedawung etanol 30% maupun 96% memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi. Hal ini terlihat dari nilai IC 50 yang paling rendah di antara tanaman lainnya yaitu 10.51 µg/ml dan 12.74 µg/ml. Hasil ini jika dibandingkan dengan penelitian Gan & Latiff (2011) yang meneliti aktivitas antioksidan kedawung dari spesies P. speciosa ternyata memiliki IC 50 yang lebih baik (IC 50 3.06 µg/ml). Hal ini disebabkan pengaruh spesies tanaman dan kondisi pengambilan sampel yang berbeda, sehingga aktivitas antioksidannya juga berbeda. Ekstrak tanaman selanjutnya yang memiliki aktivitas antioksidan adalah ekstrak daun jambu biji, namun ekstrak daun jambu biji teraktif adalah ekstrak yang mengunakan etanol 96% dengan nilai IC 50 13.42 µg/ml, sedangkan ekstrak daun jambu biji yang menggunakan etanol 30% masih dikatakan memiliki aktivitas antioksidan walaupun lebih kecil dibandingkan ekstrak daun jambu biji dengan etanol 96%, yaitu senilai 14.50 µg/ml. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak jambu biji yang diperoleh tidak berbeda jauh jika dibandingkan dengan hasil penelitian Indriani (2006) yang meneliti aktivitas antioksidan etanol daun jambu
biji dengan metode TBA (tiobarbituric acid) bahwa aktivitas antioksidan yang diperoleh dapat menghambat oksidasi lipid sebesar 94. 19%. Dataa aktivitas antioksidan keseluruhan menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan kedawung > jambu biji > salam > sirih merah > bangle. Hasil awal yang diperoleh dijadikan dasar pembuatan formulasi, yaitu campuran kedawung dengan daun jambu biji. Hasil uji aktivitas antioksidan dengann metode DPPH dapat dilihat pada Gambar 10 (data selengkapnya pada Lampiran 4). 120 100 IC 50 (µg/ml) 80 60 40 20 0 Gambar 11 Nilai IC 50 ekstrak kasar dengann metode DPPH Uji Fitokimia, Kadar Kuersetin dan Katekin Uji fitokimia, kadar kuersetin dan katekin dari ekstrak etanol 30% dari daun kedawung dan daun jambu bijii dapat dilihat pada Tabel 2. Data pada Tabel 2 menunjukkan bahwaa terdapat kandungan senyawa metabolit yang sama antara ekstrak sampel kedawung dan jambu biji. Ekstrak etanol 30% kedawung dan jambu bijii memiliki kandungan flavonoid, saponin, tanin dan steroid. Flavonoid yang terkandung di dalam sampel diduga sebagai senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan. Hal ini sesuai dengan yang dikemukakan oleh Ayoola et al. (2008) bahwa P. guajava mengandung flavonoid dan tanin yang merupakan senyawa fenol, yang berpotensi sebagai antioksidan. Sunarni et al. (2007) juga
menyatakan bahwa aktivitas antioksidan dari senyawa alamiah seperti flavonoid, disebabkan adanya gugus hidroksi pada struktur molekulnya. Estrak daun jambu biji dan kedawung positif mengandung kadar flavonoid sebagai kuersetin sebesar 3.11% dan 3.60% dalam 0,1 g ekstrak, hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Rohman et al. (2009) bahwa dalam jambu biji terkandung senyawa kuersetin terutama pada bagian buahnya. Tabel 2 Hasil Uji fitokimia, kadar kuersetin dan katekin ekstrak etanol 30% kedawung dan jambu biji Sampel Komponen Kedawung Jambu Biji Flavonoid + + Saponin + + Tanin + + Alkaloid - - Triterpenoid - - Steroid + + Hidroquinon - - Kuersetin (% b/b) Katekin (% b/b) 3.60 0.11 3.11 0.81 Keterangan: (-): tidak terdeteksi komponen, (+): terdeteksi komponen Faktor lain yang menyebabkan adalah hasil uji fitokimia kedua ekstrak positif mengandung flavonoid, adanya kandungan flavonoid memungkinkan kedua ekstrak tersebut memang mengandung kuersetin. Kuersetin adalah flavonoid yang mempunyai beberapa aktivitas farmakologi, diantaranya efek antiinflamasi dan antioksidan. Kuersetin mampu mencegah kerusakan oksidatif dan kematian sel melalui beberapa mekanisme, antara lain menangkap radikal oksigen, perlindungan terhadap peroksidasi lipid dan mengkelatkan logam. Kuersetin yang diidentifikasi dalam ekstrak daun jambu biji menunjukkan adanya aktivitas antioksidan (Tachakittirungrod et al. 2007).
Kedua ekstrak juga mengandung senyawa katekin. Dalam 0,1 g ekstrak kedawung dan jambu biji terdapat katekin sebesar 0.11% dan 0.81%. Katekin juga merupakan senyawa metabolit sekunder yang memiliki aktivitas antioksidan berkat gugus-gugus fenoliknya. Katekin yang memiliki aktivitas antioksidan pada teh hijau mempunyai efek penghambatan pada tahap promosi terbentuknya tumor kelenjar mamma (Gunawijaya et al.1999). Nilai katekin lebih rendah jika dibandingkan dengan senyawa kuersetin, dapat disimpulan bahwa ekstrak jambu biji dan kedawung lebih banyak mengandung kuersetin yang berfungsi dalam aktivitas antioksidannya. Formulasi Ekstrak Terbaik Berdasarkan hasil pengujian awal, maka diperoleh formulasi campuran ekstrak etanol 30% daun kedawung dan daun jambu biji serta formulasi campuran ekstrak etanol 96% daun kedawung dan daun jambu biji (Gambar 11 dan 12) dan data selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 5. Dari data tersebut dilakukan optimasi perbandingan formulasi dengan melihat daya hambatnya terhadap DPPH. Hasil yang didapat menyatakan bahwa formulasi ekstrak daun kedawung dan daun jambu biji (4:1) memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi dibandingkan formulasi yang lainnya yaitu sebesar 97.27%. Hasil penelitian ekstrak etanol 30% tunggal kedawung dan jambu biji pada 50 ppm mempunyai aktivitas antioksidan sebesar 93.33% dan 92.33%. Aktivitas tersebut lebih rendah dibanding vitamin C (98.79%). Aktivitas antioksidan formulasi ekstrak etanol 30% kedawung dan jambu biji (4:1) ini sebanding dengan vitamin C (98.79%) yakni sebesar 97.27%. Formulasi ekstrak terbaik ini aktivitas antioksidannya lebih tinggi daripada ekstrak tunggal.
Aktivitas antioksidan (%) 1000 90 80 70 60 50 40 30 vit C 1:011 1:02 1:03 1:04 2:01 2: 03 2:04 3:01 3:02 3:04 4:01 4:02 4:03 Ekstrak kedawung : jambu biji Gambar 12 Diagram aktivitas antioksidann formulasi ekstrak etanol 30% kedawung dan daun jambu bijii daun Aktivitas antioksidan (%) 1000 90 80 70 60 50 40 30 vit C 1:01 1:02 1:03 1:04 2:01 2:03 2:043:013:02 3:04 4:01 4:02 4:03 Ekstrak kedawung : jambu biji Gambar 13 Diagram aktivitas antioksidann formulasi ekstrak etanol 96% kedawung dan daun jambu bijii daun Profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Ekstrak Jambu Biji dan Kedawung Ekstrak jambu biji dan kedawung dipisahkan dengann menggunakan kromatografi lapis tipis untuk melihat profil KLT dan kandungan kuersetin berdasarkan profil spot yang terbentuk. Spot yang terbentuk pada ekstrak jambu biji dan kedawung dibandingkan dengan spot senyawa murni kuersetin, berdasarkan persamaan nilai Rf. Nilai Rf merupakan perbandingan jarak yang ditempuh komponen dan jarak yang ditempuh oleh pelarut (Markham 1988).
Pola kromatografi lapis tipis pada Gambar 13 menunjukkan ekstrak kedawung dan jambu biji memiliki spot lebih dari satu. Ekstrak jambu biji memiliki 6 spot, sedangkan kedawung 4 spot. Formula terbaik ekstrak yaitu kedawung : jambu biji (4:1) memiliki spot yang hampir sama dengan kedua ekstrak kasarnya. Kuersetin sebagai salah satu flavonoid dan dipakai sebagai penciri memiliki spot tunggal, dengan fase gerak metanol-etil asetat (9:1) dan nilai Rf 0.81. Nilai Rf dari ekstrak kedawung, jambu biji dan formula ekstrak terbaik memiliki nilai Rf yang sama sebesar 0.81 (Lampiran 6). Hal ini menunjukkan bahwa komponen yang terkandung dalam ekstrak kedawung, jambu biji, dan formula ekstrak terbaik positif mengandung kuersetin. 1 2 3 4 Gambar 14 Profil KLT dari ekstrak kedawung (1), jambu biji (2), formula ekstrak terbaik (3), dan kuersetin (4). (Kondisi KLT: plat KLT SiO 2 G 60 F 254, Visualisasi noda: 254 dan 366 nm). Nilai Rf kuersetin ini lebih tinggi dibandingkan dengan penelitian Herowati et al. (2008) dimana dengan fase gerak kloroform-etil asetat (7:3) nilai Rf kuersetin adalah 0.26, sedangkan dengan fase gerak metilen klorida-etil asetat (4:1) nilai Rf kuersetin 0.32.
Komposit Formula Ekstrak dengan Zeolit Data hasil pengujian aktivitas antioksidan dari supernatan dan endapan untuk masing masing komposit zeolit dengan vitamin C dan formula ekstrak dengan menggunakan metode DPPH dapat dilihat pada Tabel 3 dan 4. Hasil uji aktivitas antioksidasi dengan DPPH menunjukkan bahwa supernatan zeolit yang dikompositkan dengan formula ekstrak 0.05 mg/ml memiliki kemampuan menghambat senyawa radikal bebas DPPH (Tabel 3). Hal ini terjadi karena nilai absorbans setiap komposit formula ekstrak dengan zeolit lebih kecil dibandingkan dengan absorbans kontrol negatif (larutan DPPH tanpa ekstrak). Kontrol positif yang digunakan adalah komposit asam askorbat (vitamin C) dengan zeolit. Penjerapan vitamin C oleh zeolit lebih kecil dibanding formula ekstrak, hal ini disebabkan vitamin C juga larut dalam air yang ada dalam rongga zeolit. Asam askorbat merupakan komponen alami yang memiliki sifat sebagai pereduksi.vitamin C larut dalam air dan dapat menangkap radikal bebas yang merupakan hasil samping dari proses oksidasi, sehingga kerusakan jaringan dapat dicegah (Linder 1992). Dengan bertambahnya bobot zeolit aktivitas antioksidan komposit zeolit formula ekstrak terbaik dan vitamin C semakin turun, hal ini disebabkan ada bagian dari formula ekstrak terbaik dan vitamin C yang diserap oleh zeolit. Formula ekstrak terbaik yang diserap zeolit Cikalong lebih besar daripada Bayah. Formula ekstrak lebih mudah diserap oleh zeolit Cikalong daripada Bayah, hal ini dapat dilihat dari struktur molekul zeolit Cikalong dimana struktur zeolit Cikalong (modernit) memiliki rongga yang lebih besar dibandingkan zeolit Bayah (klinoptilolit). Struktur klinoptilolit memiliki dua dimensi rongga yang tersusun dari 10 unit cincin dengan diameter 0.44 x 0.72 nm dan rongga yang tersusun dari 8 unit cincin dengan diameter 0.41 x 0.47 nm, sedangkan rongga modernit tersusun dari 12 unit cincin dengan diameter 0.65 x 0.70 nm dan rongga yang tersusun dari 8 unit cincin dengan diameter 0.26 x 0.57 nm (Ghiara et al. 1999). Besarnya rongga mempengaruhi daya serap zeolit terhadap supernatan, sehingga aktivitas antioksidan supernatan Cikalong lebih rendah dibandingkan zeolit Bayah.
Tabel 3 Aktivitas antioksidan supernatan (filtrat) komposit zeolit dengan vitamin C dan formula ekstrak Komposisi Aktivitas antioksidan supernatan (%) komposit 1 komposit 2 komposit 3 vitamin C 96.06 96.43 96.24 cikalong 100 mg - vit C 95.38 96.17 95.48 cikalong 250 mg - vit C 94.60 95.24 95.06 cikalong 500 mg - vit C 94.01 95.23 94.47 bayah 100 mg - vit C 93.24 94.31 93.41 bayah 250 mg - vit C 90.58 90.39 90.04 bayah 500 mg - vit C 83.12 87.07 85.81 formula ekstrak 93.31 92.13 86.43 cikalong 100 mg - formula ekstrak 46.62 89.55 93.48 cikalong 250 mg - formula ekstrak 13.00 54.19 93.88 cikalong 500 mg - formula ekstrak 0.70 27.88 92.94 bayah 100 mg - formula ekstrak 83.90 93.36 34.65 bayah 250 mg - formula ekstrak 30.14 91.74 11.30 bayah 500 mg - formula ekstrak 11.80 86.77-9.90 Keterangan Komposit 1 = formula ekstrak 0.05 mg/ml - zeolit Komposit 2 = formula ekstrak 0.1 mg/ml - zeolit Komposit 3 = formula ekstrak 0.5 mg/ml - zeolit Konsentrasi formula ekstrak yang semakin meningkat, aktivitas antioksidan supernatan juga semakin meningkat. Hal ini disebabkan oleh proses penjerapan formula ekstrak oleh zeolit. Semakin besar konsentrasi formula ekstrak, jumlah ekstrak yang terlarut akan semakin banyak sehingga makin banyak jumlah ekstrak yang tidak dijerap oleh zeolit. Penjerapan formula ekstrak pada zeolit Bayah lebih sedikit dibanding zeolit Cikalong. Penjerapan pada zeolit Bayah maksimum pada konsentrasi formula ekstrak 0.1 mg/ml, sedangkan zeolit Cikalong masih dapat menjerap formula ekstrak. Semakin besar bobot zeolit, aktivitas antioksidan semakin kecil. Ini menunjukkan penjerapan formula ekstrak semakin banyak dengan bertambahnya bobot zeolit. Hal ini sama seperti
penelitian yang dilakukan Swantomo et al. (2009), semakin besar konsentrasi fenol maka efektifitas adsorpsi fenol semakin kecil sedangkan semakin banyak jumlah zeolit maka effektivitas adsorpsi menjadi lebih tinggi. Pada supernatan komposit zeolit dengan formula ekstrak 0.5 mg/ml, zeolit Cikalong tidak dapat menjerap formula ekstrak tetapi aktivitas antioksidan lebih besar jika dibandingkan dengan kontrol positif. Zeolit Bayah masih dapat menjerap formula ekstrak dengan konsentrasi 0.5 mg/ml walaupun tidak maksimal. Hal ini karena penjerapan optimum pada zeolit Bayah terjadi pada formula ekstrak 0.1 mg/ml. Meskipun penjerapan optimum formula ekstrak pada zeolit terjadi pada konsentrasi formula ekstrak 0.1 mg/ml, namun aktivitas antioksidan masih dapat terdeteksi kecuali pada bobot zeolit 500 mg sudah tidak ada lagi aktivitas antioksidan. Begitu pula dengan vitamin C penjerapan optimum zeolit terjadi pada konsentrasi 0.1 mg/ml. Meskipun penjerapan optimum formula ekstrak pada zeolit terjadi pada konsentrasi formula ekstrak 0.1 mg/ml, namun aktivitas antioksidan masih dapat terdeteksi. Hal ini menunjukkan bahwa zeolit juga memiliki aktivitas antioksidan. Pada endapan komposit zeolit dengan konsentrasi formula ekstrak 0.05 mg/ml ada peningkatan aktivitas antioksidan meskipun tidak terlalu besar. Semakin besar persentase aktivitas antioksidan pada endapan menunjukkan aktivitas antioksidan komposit zeolit dan formula ekstrak semakin meningkat, ternyata aktivitas antioksidan tidak terlalu besar karena aktivitas antioksidan tidak hanya ditunjukkan oleh formula ekstrak tapi juga aktivitas antioksidan ini juga dimiliki oleh zeolit (Tabel 4). Aktivitas antioksidan endapan komposit zeolit dengan formula ekstrak maksimal pada formula ekstrak 0.1 mg/ml. Zeolit Bayah maksimal menjerap formula ekstrak pada bobot zeolit 100 mg dengan kenaikan aktivitas antioksidan sebesar 76.72%. Dengan bertambahnya bobot zeolit Bayah, dikhawatirkan banyak terdapat pengotor yang dapat menghambat proses penjerapan zeolit, karena zeolit yang digunakan adalah zeolit tanpa perlakuan apapun terlebih dahulu. Sebaliknya pada zeolit Cikalong optimal penjerapan formula ekstrak terjadi pada zeolit dengan bobot 500 mg dengan kenaikan aktivitas antioksidan sebesar 58.22%.
Pengotor pada zeolit Cikalong lebih sedikit dari pada zeolit Bayah. Pengotor pada zeolit Cikalong sebesar 26% terdiri dari kuarsa, mika, plagioklas dan montmorilonit, sedangkan pada zeolit Bayah 42.3% terdiri dari kuarsa, montmorilonit dan plagioklas (Sastiono 1993). Penjerapan vitamin C oleh zeolit Bayah maksimum terjadi pada bobot zeolit 100 mg dengan kenaikan aktivitas antioksidan sebesar 74.97%, sebaliknya zeolit Cikalong pada bobot 500 mg dengan kenaikan 48.36%. Hal ini disebabkan karena adanya faktor pengotor yang terdapat pada kedua zeolit tersebut. Tabel 4 Aktivitas antioksidan endapan komposit zeolit dengan vitamin C dan formula ekstrak Aktivitas antioksidan endapan (%) Komposisi komposit 1 komposit 2 komposit 3 zeolit bayah 23.88 3.53-12.40 bayah 100 mg - vit C 27.77 24.68-9.01 bayah 250 mg - vit C 25.69 15.29-9.45 bayah 500 mg - vit C 27.63 23.20-16.73 bayah 100 mg - formula ekstrak 25.75 26.70-3.15 bayah 250 mg - formula ekstrak 26.63 22.10-2.10 bayah 500 mg - formula ekstrak 21.80 21.36-1.77 zeolit cikalong 22.40 6.71-9.01 cikalong 100 mg - vit C 2790 20.44-7.51 cikalong 250 mg - vit C 30.52 19.89-14.70 cikalong 500 mg - vit C 27.16 23.39-11.48 cikalong 100 mg - formula ekstrak 30.05 18.86-6.17 cikalong 250 mg - formula ekstrak 25.15 17.86-1.80 cikalong 500 mg - formula ekstrak 22.74 25.41-1.61 keterangan Komposit 1 = formula ekstrak 0.05 mg/ml - zeolit Komposit 2 = formula ekstrak 0.1 mg/ml - zeolit Komposit 3 = formula ekstrak 0.5 mg/ml - zeolit
Pada endapan komposit zeolit Bayah dan formula ekstrak dengan konsentrasi 0.5 mg/ml, formulasi ekstrak yang terjerap dalam zeolit sangat sedikit tetapi aktivitas antioksidan menunjukkan harga negatif. Hal ini berarti tidak ada aktivitas antioksidan. Pada aktivitas antioksidan endapan komposit zeolit dengan vitamin C 0.5 mg/ml menunjukkan bahwa vitamin C sedikit yang terjerap dalam zeolit Bayah maupun zeolit Cikalong tetapi aktivitas antioksidan menunjukkan harga negatif. Berdasarkan data diatas formula ekstrak setelah dikompositkan dengan zeolit, kapasitas antioksidannya meningkat sehingga zeolit Cikalong dan Bayah dapat digunakan sebagai bahan penopang. Pemanfaatan zeolit alam sebagai bahan penopang dapat meningkatkan aktivitas farmakologi formula ekstrak. Peningkatan aktivitas farmakologi dalam hal ini antioksidan dengan penambahan zeolit sebagai bahan penopang menunjukkan kandungan senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan tidak berubah setelah dikompositkan dengan zeolit alam. Hal ini sesuai dengan yang dikemukakan oleh Farias et al. (2002) bahwa struktur obat tetap tidak berubah setelah interaksi dengan zeolit klinoptilolit.