HASIL DAN PEMBAHASAN. Transformasi ke dalam Agrobacterium

Transkripsi

1 Konfirmasi Koloni Transforman dengan Teknik PCR Koloni Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi dianalisis dengan metode PCR koloni. Koloni yang tumbuh pada media LA diambil dengan menggunakan tusuk gigi kemudian dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf. Pemindahan koloni dilakukan secara steril dalam laminar air flow cabinet. Persiapan PCR koloni dilakukan dengan menyiapkan campuran reaksi sebanyak total tabung yang berisi koloni yang terdiri atas, aquabides 2.75 µl, buffer complete 1.5 µl, dntps 0.3 µl, M13-F 0.15 µl, M13-R 0.15 µl, Taq polimerase 0.15 µl. Tahap pertama PCR adalah program lisis 96 o C selama 5 menit, 50 o C selama 1 menit 30 detik, 96 o C selama 1 menit 30 detik, 45 o C selama 1 menit 30 detik, 96 o C selama 1 menit, dan 40 o C selama 1 menit. Program dihentikan sejenak untuk penambahan sebanyak 5 µl campuran reaksi ke dalam masing-masing tabung Eppendorf. Program PCR kemudian dilanjutkan kembali dengan program PCR yakni, 94 o C selama 30 detik, 55 o C selama 1 menit, 72 o C selama 2 menit. Koloni transforman setelah perbanyakan dengan teknik PCR selesai kemudian dielektroforesis dengan gel agarosa 1%. Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas 2006) Isolasi DNA plasmid dilakukan berdasarkan hasil PCR DNA koloni yang diketahui mengandung plasmid terinsersi fragmen yang diinginkan. Plasmid diisolasi dengan GeneJet TM Plasmid Miniprep Kit. Koloni bakteri yang tumbuh pada media LA dikulturkan ke media LB yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm (bakteri yang ditransformasikan dengan vektor donor). Bakteri diinkubasi pada inkubator bergoyang pada suhu 37 0 C selama semalam untuk pembiakan bakteri. Sampel yang positif mengandung plasmid terinsersi disentrifus dengan kecepatan rpm terlebih dahulu. Pelet dihomogenisasi dengan penambahan 250 µl larutan resuspensi kemudian divortex. Pelet yang telah dilarutkan tersebut ditambahkan larutan lisis sebanyak 250 µl dan dikocok bolak-balik. Sebanyak 350 µl larutan netralisasi ditambahkan ke dalam larutan tersebut kemudian disentrifugasi pada kecepatan dan suhu yang sama selama 5 menit. Kecepatan sentrifugasi pada isolasi DNA plasmid dengan kit Fermentas seluruhnya pada rpm dan suhu 25 0 C. Setiap penambahan larutan dalam tabung dibolak-balik sebanyak 6x. Supernatan dipindahkan ke dalam kolom dan disentrifugasi selama 1 menit. Kolom dicuci dengan 500 µl larutan pencuci dan disentrifus selama 1 menit (dilakukan sebanyak 2x). Kolom dalam keadaan kosong disentrifus kembali selama 1 menit. Kolom dipindahkan ke dalam tabung mikro baru dan ditambahkan 30 µl elution buffer tepat di tengah membran kolom. Kolom diinkubasi selama 2 menit dan disentrifugasi kembali selama 2 menit. DNA plasmid diverifikasi pada gel agarosa 1%. Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens Galur AGL-0 Sebanyak 10 µl DNA plasmid dimasukkan ke dalam Agrobacterium galur AGL-0 lalu didiamkan di dalam es selama 15 menit. Inkubasi kembali di dalam nitrogen cair selama 5 menit dan pada suhu 37 o C selama 5 menit. Tambahkan 1 ml YEP (Yeast Exctract Pepton) lalu dikocok dengan inkubator bergoyang selama 3 jam pada suhu 28 o C. Larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang dihasilkan sebagian dibuang dan sebanyak ± 200 µl supernatan yang tersisa diresuspensikan dengan pelet yang terbentuk lalu disebar ke dalam media LB yang telah berisi antibiotik kanamisin 50 ppm dan rifampisin 50 ppm. Inkubasi selama 2 hari pada suhu 28 0 C dalam kondisi gelap. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Amplifikasi Gen Penyandi Kitinase dengan Primer Spesifik Gateway Pemilihan primer oligonukleotida yang berguna untuk PCR (Polymerase Chain Reaction), hibridisasi oligo dan sekuen DNA merupakan tahap pertama yang dilakukan dalam melakukan konstruksi gen penyandi kitinase ke dalam vektor ekspresi. Primer oligonukleotida disusun berdasarkan perancangan primer pada sistem Gateway yang didasarkan pada urutan gen penyandi kitinase yang telah diperoleh pada penelitian sebelumnya oleh Novianthy (2009). Desain primer yang tepat merupakan salah satu faktor penting dalam keberhasilan isolasi gen dan sekuen DNA (Abd-Elsalam 2003). Penelitian sebelumnya oleh Novianthy (2009) diperoleh gen penyandi kitinase telah berhasil diisolasi dari jamur Trichoderma harzianum (Lorito et

2 9 al. 1996) dengan ukuran gen penyandi kitinase yang diperoleh adalah 1500 pb. Amplifikasi gen penyandi kitinase bertujuan menggandakan gen tersebut secara in vitro menggunakan metode PCR. Amplifikasi dilakukan menggunakan kit dari Invitrogen (2003) dengan primer gateway yang spesifik, yaitu Gateway Kitinase- Forward (KTN-F) dan Gateway Kitinase- Reverse (KTN-R). Kedua primer tersebut dirancang berdasarkan aturan perancangan sistem Gateway, yaitu terdapat empat basa nukleotida GGGG yang diikuti situs attb dan ditambahkan urutan basa nukleotida spesifik gen penyandi kitinase. Urutan situs attb dan urutan basa nukleotida gen penyandi kitinase dapat dilihat pada lampiran 4. Hasil amplifikasi gen penyandi kitinase selanjutnya dielektroforesis dengan konsentrasi gel agarosa 1% untuk mengetahui gen tersebut teramplifikasi atau tidak. Hasil pengujian dengan elektroforesis gel agarosa menunjukkan pita berukuran lebih sedikit dari 1500 pb (Gambar 7). Ukuran pita yang terlihat setelah elektroforesis selanjutnya dibandingkan tingkat kehomologian ukuran pita dengan berbagai gen yang terdapat dalam situs dan gen tersebut merupakan gen penyandi kitinase. Ukuran ini mirip dengan cds berbagai gen yang mempunyai fungsi sejenis dari spesies tanaman lainnya seperti 1318 pb pada kitinase Allium sativum (Van Damme 1993), 1320 pb pada kitinase Poa pratensis (Du & Ha 1999), 1321 pb pada kitinase Zea diploperennis (Tiffin 2004), dan 1333 pb pada kitinase C dari Ananas comosus (Taira & Akimoto 2007). Gen penyandi kitinase yang sudah teramplifikasi kemudian diekstraksi dan dimurnikan. Hasil Ekstraksi dan Pemurnian DNA dari Gel Agarosa Ekstraksi dan pemurnian ini menggunakan kit dari Invitrogen. Penelitian dilakukan sesuai dengan prosedur yang terdapat dalam metode. Ekstraksi dan pemurnian bertujuan untuk memurnikan DNA dari pelbagai pengotor yang tidak diinginkan seperti protein dan RNA yang diperoleh dari pengotor yang mungkin ada pada produk PCR. Hasil pemurnian selanjutnya diuji dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Elektroforegram amplikon pada gambar sebelumnya menunjukkan gen tersebut berada pada ukuran 1500 pb. Pita yang terlihat setelah pengujian amplifikasi kemudian akan diekstraksi dan dimurnikan. Gel diletakkan di atas transluminator ultraviolet (UV) untuk melihat pita yang akan dipotong. Pita DNA yang terlihat terang setelah penyinaran kemudian dipotong dengan pisau scalpel lalu diekstraksi dan dimurnikan. Hasil ekstraksi dan pemurnian diperiksa dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% dan menghasilkan pita berukuran 1500 pb seperti yang terlihat pada Gambar 8. Ukuran pita DNA hasil ekstraksi dan pemurnian hampir sama dengan ukuran pita setelah amplifikasi karena esktraksi dan pemurnian hanya menghilangkan pengotor yang ada pada DNA. Hasil ekstraksi dan pemurnian kemudian direkombinasikan ke dalam vektor donor menggunakan metode Gateway. Gambar 7 Elektroforegram amplikon gen penyandi kitinase dengan primer Gateway; (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (a) gen penyandi kitinase berukuran 1500 pb. Gambar 8 Elektroforegram ekstraksi dan pemurnian gen penyandi kitinase dari gel agarosa; (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (a) gen penyandi kitinase berukuran 1500 pb. Rekombinasi Gen Penyandi Kitinase pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi Rekombinasi gen penyandi kitinase pada vektor donor dan vektor destinasi merupakan

3 10 teknik pengklonan. Pengklonan bertujuan memperbanyak DNA yang tersisip pada sel kompeten. Pengklonan gen penyandi kitinase sampai pada vektor destinasi dilakukan dengan menggunakan metode Gateway. Tahapan pengklonan pada metode Gateway terdiri atas dua rekombinasi, yaitu rekombinasi BP dan rekombinasi LR. Tahapan pengklonan dengan metode Gateway tersebut diawali dengan rekombinasi pada vektor donor dan dilanjutkan dengan rekombinasi ke dalam vektor destinasi. Hasil ekstraksi dan pemurnian disisipkan ke dalam vektor donor (pdonr TM 221) dengan reaksi BP. Gen penyandi kitinase hasil amplifikasi yang memiliki situs attb1 dan attb2 akan direaksikan dengan vektor donor (pdonr TM 221) yang memiliki situs attp1 dan situs attp2 sebagai tempat rekombinasi dengan hasil PCR yang telah mempunyai situs attb1 dan situs attb2 sehingga adanya situs tersebut menyebabkan kemungkinan tidak adanya kesalahan orientasi gen yang direkombinasikan. Reaksi rekombinasi selanjutnya dikatalisis oleh enzim BP Clonase TM sehingga dalam metode Gateway reaksi rekombinasi pada vektor donor disebut reaksi BP. BP rekombinasi kemudian ditransformasi ke dalam sel kompeten Escherechia coli galur XL-1 Blue untuk dibuktikan sudah terjadi rekombinan. Reaksi BP pada metode Gateway dapat dilihat pada lampiran 5. Hasil BP rekombinasi selanjutnya ditransformasi ke dalam sel kompeten Escherechia coli galur XL-1 Blue. Sel dapat dibuat kompeten dengan perlakuan garam CaCl 2, LiCl 2, atau RbCl 2. Garam CaCl 2 dapat meningkatkan porositas dinding sel sehingga afinitas sel terhadap DNA juga dapat meningkat (Howe 1995). Hasil rekombinasi gen penyandi kitinase pada vektor donor kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli galur XL-1 Blue yang ditumbuhkan pada media LA yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm. Penambahan kanamisin dilakukan karena vektor donor yang digunakan mempunyai marka seleksi resisten terhadap antibiotik tersebut. Oleh karena itu, seleksi transforman dilakukan dengan mengamati koloni yang tumbuh setelah masa inkubasi seperti yang terlihat pada Gambar 9. Koloni yang tumbuh dengan metode pengklonan Gateway umumnya terdapat dua jenis koloni yaitu koloni putih dan koloni biru. Koloni putih yang tumbuh pada media seleksi diduga kuat klon entri yang membawa gen penyandi Gambar 9 Koloni yang tumbuh setelah reaksi BP pada metode Gateway. kitinase, sedangkan by product yang tersisipi ccdb akan mati dan tidak tumbuh sebagai koloni putih. Koloni berwarna putih yang tumbuh diduplikasi dan dikultur untuk memperbanyak jumlah plasmid rekombinan. Koloni hasil duplikasi yang tumbuh diambil dengan menggunakan tusuk gigi steril untuk di konfirmasi menggunakan PCR koloni dengan sepasang primer universal M13 karena peta vektor donor (pdonr TM 221) menunjukkan bahwa amplifikasi dengan PCR koloni memerlukan primer M13 Forward dan M13 Reverse (Lampiran 7). Koloni yang terbukti rekombinan setelah pengujian dengan PCR koloni diisolasi DNA plasmidnya kemudian direkombinasikan ke dalam vektor destinasi (vektor ekspresi). Vektor destinasi yang digunakan ada 3, yaitu pgd625, parc983, dan pdest. Plasmid rekombinan yang telah diikat oleh situs attl1 dan attl2 direkombinasikan ke vektor destinasi yang membawa situs attr1 dan attr2. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim LR Clonase TM sehingga dalam metode Gateway reaksi rekombinasi ini disebut reaksi LR. Mekanisme reaksi LR dapat dilihat pada lampiran 6. Vektor detinasi yang telah mengandung gen penyandi kitinase (vektor rekombinan) ditransformasikan ke E. coli galur XL-1 Blue untuk pembiakan sel. Hasil rekombinasi ke vektor destinasi selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli galur XL-1 Blue yang ditumbuhkan pada media LA yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm ke dalam media tersebut. Hal ini dikarenakan pada vektor destinasi mengandung marka seleksi resisten terhadap antibiotik tersebut sehingga seleksi transforman dengan melihat koloni yang dapat tumbuh pada media tersebut (Gambar 10). Koloni putih yang tumbuh pada media LA setelah reaksi LR juga diduplikasi untuk menyimpan duplikat koloni yang telah membawa fragmen gen sisipan agar koloni tidak terkontaminasi dan menghindari terjadinya pertumbuhan bertumpuk (overgrowth) yang mengakibatkan koloni tidak tunggal lagi.

4 11 Gambar 10 Koloni yang tumbuh setelah reaksi LR pada metode Gateway menggunakan vektor destinasi: (a) pgd625, (b) parc983, dan (c) pdest. Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi BP dengan Teknik PCR dan Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas 2006) Hasil rekombinasi ke dalam vektor donor ditransformasikan ke dalam E.coli untuk pembiakan sel. Koloni yang tumbuh setelah transformasi ke dalam E.coli diuji dengan metode PCR koloni untuk memastikan koloni tersebut mengandung plasmid rekombinan. Pengujian koloni tersebut menggunakan sepasang primer universal M13. Penggunaan primer ini karena pada peta pdonr TM 221 terlihat bahwa amplifikasi dengan PCR koloni memerlukan primer M13 Forward dan M13 Reverse (Lampiran 7). Elektroforegram PCR koloni pada Gambar 11 menunjukkan bahwa dari tujuh koloni yang diujikan hanya ada lima koloni yang rekombinan yang ditunjukkan dengan adanya pita setelah elektroforesis. Keberhasilan proses PCR koloni dapat diamati dari ukuran klon transforman. Ukuran pita yang terdapat pada elektroforegram tersebut menunjukkan ukuran sekitar 1500 pb yaitu merupakan hasil koloni rekombinan. Koloni rekombinan yang telah diuji dengan metode PCR koloni selanjutnya dilakukan pengkulturan ke dalam media Luria Bertani (LB) untuk dijadikan sumber nutrisi yang membantu pertumbuhan bakteri. Hasil kultur bakteri yang ditumbuhkan dari media LB cair kemudian diisolasi DNA plasmidnya untuk rekombinasi ke vektor destinasi. Isolasi DNA plasmid dilakukan berdasarkan hasil PCR DNA koloni yang diketahui mengandung plasmid terinsersi fragmen yang diinginkan. Plasmid diisolasi menggunakan Fermentas GeneJet Plasmid Miniprep Kit. Plasmid kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1%. Gambar 11 Elektroforegram PCR koloni gen penyandi kitinase pada vektor donor; (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (1-7) koloni bakteri. Elektroforegram pada Gambar 12 menunjukkan hasil gen sisipan yang berada pada plasmid rekombinan. Elektroforesis hasil isolasi plasmid sebenarnya bertujuan untuk mengecek secara kualitatif keberhasilan isolasi plasmid. DNA plasmid yang telah diisolasi selanjutnya direkombinasikan ke dalam vektor destinasi. Gambar 12 Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan setelah reaksi BP; (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (1-4) koloni terbaik hasil PCR koloni. Hasil Konfirmasi Koloni Transforman setelah Reaksi LR dengan Teknik PCR dan Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas 2006) Pembiakan sel setelah rekombinasi ke dalam vektor destinasi yaitu dengan mentransformasikan vektor rekombinan ke dalam E. coli. Vektor destinasi yang digunakan dalam reaksi LR yaitu pgd625, parc983 dan pdest. Vektor destinasi pgd625 berasal dari tanaman tembakau, sedangkan vektor destinasi parc983 berasal dari tanaman tomat dan vektor destinasi pdest merupakan vektor kosong. Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke dalam E. coli selanjutnya dilakukan PCR

5 12 koloni. PCR koloni dapat mengkonfirmasi sel transforman yang sudah tersisipi DNA rekombinan. Melalui tahapan ini, gen penyandi kitinase yang disisipkan ke dalam vektor destinasi diamplifikasi menggunakan primer spesifik. Elektroforegram PCR koloni setelah reaksi LR pada gen penyandi kitinase yang berukuran 1500 pb menunjukkan bahwa dari sembilan koloni yang menggunakan vektor destinasi pgd625, semua koloni mengandung gen penyandi kitinase. Hal ini ditunjukkan dengan pita yang terang pada ukuran sekitar 1500 pb (Gambar 13). Hasil PCR koloni pada sembilan koloni yang menggunakan vektor destinasi parc983 menunjukkan semua koloni mengandung gen penyandi kitinase berukuran 1500 pb (Gambar 14), dan hasil PCR koloni pada sepuluh koloni yang menggunakan pdest menunjukkan semua koloni berukuran ukuran 1500 pb seperti yang terlihat pada Gambar 15. Tujuan menggunakan tiga vektor yang berbeda pgd625, parc983, dan pdest yaitu untuk mempelajari gen sesuai kebutuhan dalam penelitian dan sebagai cadangan jika tidak terdapat vektor yang berhasil disisipi. Koloni E. coli yang mengandung sisipan gen penyandi kitinase kemudian dilakukan proses isolasi DNA plasmid dari koloni yang positif pada masing-masing vektor. Koloni nomer 3 dan 4 diambil dari koloni yang menggunakan vektor destinasi pgd625, koloni nomer 4 dan 6 diambil dari koloni yang menggunakan vektor destinasi parc983 dan koloni nomer 1 dan 2 diambil dari koloni yang menggunakan vektor destinasi pdest. Secara umum, isolasi plasmid mirip dengan isolasi DNA total, yaitu melibatkan proses pembiakan sel pembawa plasmid, pemanenan sel, pembuatan ekstrak sel, penghilangan protein dan RNA, dan pemekatan DNA dengan presipitasi etanol. Gambar 14 Elektroforegram PCR koloni gen penyandi kitinase dengan vektor destinasi parc983; (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (1-9) koloni bakteri. Isolasi DNA plasmid setelah reaksi LR menggunakan kit dari Fermentas. Elektroforegram pada Gambar 16 menunjukkan gen sisipan yang berada pada plasmid rekombinan. Pengujian plasmid rekombinan yang telah diisolasi dilakukan dengan metode PCR plasmid. Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan setelah reaksi LR menunjukkan dari keenam koloni yang diambil dari ketiga vektor mengandung gen yang telah disisipkan pada plasmid rekombinan dan selanjutnya siap di transformasi ke dalam A. tumefaciens. Gambar 15 Elektroforegram PCR koloni gen penyandi kitinase dengan vektor destinasi pdest; (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (1-10) koloni bakteri Gambar 13 Elektroforegram PCR koloni gen penyandi kitinase dengan vektor pgd625; (M) marker 1 kb plus DNA Ladder, (1-9) koloni bakteri. Gambar 16 Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan setelah reaksi LR; (1-6) koloni terbaik hasil PCR koloni, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder.

6 Hasil Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens Galur AGL-0 Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) bertujuan untuk menguji ekspresi pengaruh gen tersebut ke tanaman. Sel Agrobacterium yang membawa plasmid rekombinan digunakan untuk menginfeksi protoplast tanaman. Penggunaan Agrobacterium galur AGL-0 dilakukan karena galur ini mempunyai virulensi yang tinggi dibandingkan galur Agrobacterium lainnya. DNA plasmid setelah rekombinasi pada vektor destinasi diisolasi kemudian ditransformasikan ke Agrobacterium tumefaciens dengan metode kejut dingin (cool shock). Hal ini dikarenakan terjadi lonjakan suhu es 0 o C ke nitrogen cair yang bersuhu sekitar -196 o C. Lonjakan suhu tersebut akan membuat membrane sel Agrobacterium menjadi tidak selektif terhadap molekul asing sehingga DNA sisipan dapat masuk. Hasil transformasi ke dalam Agrobacterium menunjukkan bahwa koloni bakteri yang tumbuh selama inkubasi ± 2 hari terdapat 1-5 koloni (Gambar 17). Pada saat proses inkubasi, koloni dalam cawan petri dibungkus dengan kertas koran agar kondisi menjadi gelap. Hal ini dilakukan agar koloni Agrobacterium tumefaciens dapat menyesuaikan kondisinya selama hidup di dalam tanah (akar). Seleksi transforman yang sudah ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens dilakukan dengan cara menumbuhkannya di dalam media LA. Koloni yang ditumbuhkan diambil berdasarkan elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan setelah reaksi LR, yaitu plasmid rekombinan nomer 1 (pgd625), plasmid rekombinan nomer 3 (parc983), dan plasmid rekombinan nomer 5 (pdest). Media LA yang digunakan mengandung antibiotik kanamisin dan rifampisin. Sel transforman tersebut akan tumbuh membentuk koloni berwarna putih. Kanamisin pada media LA digunakan karena vektor destinasi yang digunakan membawa marka seleksi berupa gen resistensi terhadap antobiotik kanamisin, sedangkan rifampisin digunakan untuk membunuh E. coli. Koloni yang tumbuh dimedia seleksi lebih sedikit dibandingkan koloni yang tumbuh saat transformasi ke E. coli. Hal ini dikarenakan A. tumefaciens memiliki jumlah salinan yang lebih sedikit (low copy number) dibandingkan E. coli. Koloni yang tumbuh kemudian di PCR koloni untuk menguji gen penyandi kitinase telah berhasil ditransformasi atau tidak. Hasil PCR koloni menunjukkan pita yang terlihat berukuran sekitar 1500 pb seperti yang terlihat pada Gambar 18. Gambar 17 Koloni A. tumefaciens yang tumbuh setelah reaksi LR pada gen penyandi kitinase menggunakan vektor destinasi (a) pgd625, (b) parc983, dan (c) pdest. Gambar 18 Elektroforegram hasil PCR koloni A. tumefaciens; (1-2) dengan vektor destinasi pgd625, (3-7) dengan vektor destinasi parc983, (8) dengan vektor destinasi pdest, (M) marker 1 kb plus DNA Ladder. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Gen penyandi kitinase telah berhasil disisipkan pada vektor ekspresi menggunakan metode Gateway. Elektroforegram hasil PCR koloni Agrobacterium diperoleh ukuran pita sekitar 1500 pb. Gen penyandi kitinase dalam vektor ekspresi telah berhasil ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens galur AGL-0 dan siap ditransfer ke dalam tanaman.