TESIS PEMBERIAN SEL PUNCA MESENKIMAL WHARTON S JELLY

Transkripsi

1 TESIS PEMBERIAN SEL PUNCA MESENKIMAL WHARTON S JELLY INTRAVENA MENINGKATKAN JUMLAH SEL BETA PANKREAS DAN MENURUNKAN KADAR GLUKOSA DARAH PUASA PADA TIKUS (RATTUS NORVEGICUS) JANTAN GALUR WISTAR DIABETES MELITUS NADIA PERMATASARI NIM PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016 i

2 PEMBERIAN SEL PUNCA MESENKIMAL WHARTON S JELLY INTRAVENA MENINGKATKAN JUMLAH SEL BETA PANKREAS DAN MENURUNKAN KADAR GLUKOSA DARAH PUASA PADA TIKUS (RATTUS NORVEGICUS) JANTAN GALUR WISTAR DIABETES MELITUS Tesis ini untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Ilmu Biomedik, Program Pascasarjana Universitas Udayana NADIA PERMATASARI NIM PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK KEKHUSUSAN ILMU ANTI AGING MEDICINE UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016 ii

3 Lembar Pengesahan TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL 21 APRIL 2016 Pembimbing I Pembimbing II Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.And., FAACS Prof. Dr. dr. A.A. G. Budhiarta, Sp.PD-KEMD NIP NIP Mengetahui Ketua Program Magister Ilmu Biomedik Program Pascasarjana Universitas Udayana Dr.dr. Gde Ngurah Indraguna Pinatih, M.Sc., SpGK NIP iii

4 PENETAPAN PUNGUJI Tesis Ini Telah Diuji pada Tanggal 21 April 2016 Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No.:../UN14.4/HK/2016, Tanggal Ketua Sekretaris : Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.And, FAACS : Prof. Dr. dr. A. A. G. Budhiarta, Sp.PD-KEMD Anggota : 1. Prof. dr. IGM. Aman, Sp.FK 2. Prof. Dr. dr. J. Alex Pangkahila, M.SC., Sp.And 3. Dr. dr. Desak Made Wihandani, M.Kes iv

5 UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat, rahmat, karunia serta petunjuk-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul Pemberian sel punca mesenkimal Wharton s Jelly intravena meningkatkan jumlah sel beta pankreas dan menurunkan kadar glukosa darah puasa pada tikus (Rattus norvegicus) jantan galur wistar diabetes melitus dalam rangka memperoleh gelar Magister pada Program Studi Ilmu Biomedik, kekhususan Anti Aging Medicine, di Program Pascasarjana Universitas Udayana, Denpasar Bali. Selama penelitian ini, penulis mendapat banyak pengalaman berharga yang memperkaya wawasan, serta sebagai proses pembelajaran hidup penulis baik dari segi ilmiah maupun dari segi sosial. Semua ini tidak lepas dari peran serta orangorang disekeliling penulis yang senantiasa mendukung dengan tulus dan ikhlas. Pada kesempatan ini, perkenankanlah penulis menyampaikan rasa hormat, penghargaan, dan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.And, FAACS, selaku Pembimbing I, yang dengan penuh perhatian memberikan semangat, bimbingan, waktu dan saran yang sangat berharga selama penulis mengikuti program magister, khususnya dalam penyelesaian tesis ini. 2. Prof. Dr. dr. A. A. G. Budhiarta, Sp.PD-KEMD, selaku Pembimbing II, yang dengan penuh perhatian dan kesabaran memberikan bimbingan, waktu dan saran yang sangat berharga kepada penulis selama penulis mengikuti program magister, khususnya dalam menyelesaikan tesis ini. 3. Prof. dr. IGM. Aman, Sp.FK, selaku Penguji, yang telah memberikan masukan, saran, sanggahan, dan koreksi yang sangat berharga dalam penyusunan tesis ini dan selama penulis mengikuti program magister. 4. Prof. Dr. dr. J. Alex Pangkahila, M.SC., Sp.And, selaku Penguji, yang telah memberikan masukan, saran, sanggahan, dan koreksi yang sangat berharga dalam penyusunan tesis ini dan selama penulis mengikuti program magister. 5. Dr. dr. Desak Made Wihandani, M.Kes, selaku Penguji, yang dengan penuh perhatian dan kesabaran memberikan semangat, masukan, saran, sanggahan, dan koreksi yang sangat berharga dalam penyusunan tesis ini dan selama penulis mengikuti program magister. 6. Dr. dr. Gde Ngurah Indraguna Pinatih, MSc, SpGK, selaku Ketua Program Studi Ilmu Biomedik yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menuntut ilmu di Program Magister Ilmu Biomedik, Universitas Udayana, Denpasar Bali. 7. Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD-KEMD, selaku Rektor Universitas Udayana atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan Program Magister di Universitas Udayana, Denpasar Bali. 8. Prof. Dr. dr. A. A. Raka Sudewi, Sp. S (K), selaku Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana yang telah memberikan kesempatan v

6 kepada penulis untuk menjadi mahasiswi pada Program Magister Ilmu Biomedik, Universitas Udayana, Bali. 9. Indra Bachtiar, PhD, selaku pembimbing dari Stem Cell and Cancer Institute (SCI) PT. Kalbe Farma Tbk., ReGeniC (Regenerative and Celular Therapy) Laboratory Jakarta, yang dengan penuh kesabaran, perhatian dalam memberikan ilmu, semangat, dorongan, saran, doa dan waktu yang sangat berharga untuk penulis dalam menyelesaikan tesis ini. 10. Dr. Harry Murti, selaku staf Stem Cell and Cancer Institute (SCI) PT. Kalbe Farma Tbk., ReGeniC (Regenerative and Celular Therapy) Laboratory Jakarta, yang telah meluangkan waktu untuk memberikan ilmu, saran dan masukan kepada penulis dalam penyelesaian tesis ini. 11. Prof. drh. Arief Boediono, PhD, selaku Ketua Program Studi FKH IPB, yang memberikan kesempatan dan fasilitas kepada penulis untuk menyelesaikan proses penelitian tesis ini. 12. drh. Pita Tarigan, selaku staf dan dokter hewan FKH IPB yang dengan penuh kesabaran membantu secara teknis proses penelitian tesis ini. 13. drh. Subangkit, selaku staf dan dokter hewan FKH IPB yang dengan penuh kesabaran membantu secara teknis proses penelitian tesis ini. 14. Ferbian Siswanto, SKH, selaku staf di Laboratorium Reproduksi FKH Universitas Udayana, yang telah membantu, memberikan saran dan masukan penelitian ini. 15. Ketut Tunas, selaku staf dosen statistik Universitas Udayana yang dengan penuh kesabaran membantu, meluangkan waktu, memberikan ilmu serta saran dalam penyelesaian tesis ini. 16. Yudhi Nugraha S. Putra, M. Biomed, PhD candidate of X-Ray Protein Crystallography, Nara Institue of Science and Technology (NAIST), Japan, yang dengan penuh kesabaran memberikan ilmu, mencarikan jurnal-jurnal terbaru, memberikan saran, semangat dan doa yang sangat berharga kepada penulis selama penyelesaian tesis ini. 17. dr. Wahyu Budi Santosa, PhD candidate of Cancer and Immunotherapy, University of Oxford, United Kingdom, yang telah meluangkan waktu untuk mengkoreksi penulisan dan memberikan saran dalam penyelesaian tesis ini. 18. Dr. dr. Reza Yuridian Purwoko, SpKK, dari Mesenchymal Stem Cell Biology Research Unit, erpour Clinic Jakarta, yang dengan penuh perhatian dan kesabaran meluangkan waktu, memberikan ilmu, semangat, saran kepada penulis selama penyelesaian tesis ini. 19. Iis Rosliana, S.Si, selaku staf Mesenchymal Stem Cell Biology Research Unit, erpour Clinic Jakarta, yang telah meluangkan waktu memberikan ilmu, saran, semangat kepada penulis selama penyelesaian tesis ini. 20. dr. Frans Dany, selaku staf LITBANGKES Jakarta, yang telah meluangkan waktu memberikan ilmu, saran, bantuan, semangat kepada penulis selama penyelesaian tesis ini. 21. dr. David Tua Perdamean, Sp.B, yang telah meluangkan waktu memberikan ilmu, saran, semangat kepada penulis selama penyelesaian tesis ini. vi

7 22. dr. Alfred Trimulfa Situmorang, Sp.PD, yang telah meluangkan waktu memberikan ilmu, saran, semangat kepada penulis selama penyelesaian tesis ini. 23. dr. I Made Oka Negara, FIAS, yang telah meluangkan waktu memberikan ilmu, saran, bantuan, semangat, doa yang sangat berharga kepada penulis selama penyelesaian tesis ini dan selama penulis mengikuti program magister. 24. Ayahanda tercinta (Syarifudin, MM) dan Ibunda tercinta (Siti Maryati), atas iringan doa, semangat, perhatian dan kasih sayang yang tulus dan tidak terhingga kepada penulis sehingga penulis mampu menyelesaikan tesis ini. 25. Suami tercinta (Alldila Putra Belia, ST) dan anak-anak tersayang (Erlangga Ario Daniswara dan Mahar Bagas Daniswara), atas doa, dukungan, pengertian, cinta kasih dan pengorbanan yang telah diberikan kepada penulis selama penyelesaian tesis ini. 26. Adik tercinta (Sandi Wijaya, ST, MM), atas doa, semangat, cinta kasih yang tidak terhingga kepada penulis sehingga penulis mampu menyelesaikan tesis ini. 27. Seluruh Dosen Ilmu Biomedik Universitas Udayana Bali, yang telah memberikan ilmu yang sangat berharga dan bermanfaat. 28. Para staf Ilmu Biomedik Universitas Udayana Bali, yang telah mendukung, memberikan informasi dan bantuan kepada penulis mulai dari awal sampai akhir menuntut ilmu di bagian Biomedik. 29. Teman-teman angkatan 7, 8, 9 dan 10 Anti Aging Medicine Universitas Udayana, terutama dr. Henrita Ernestia, dr. Soraya Simatupang, dr. Veny Larasati M.Biomed AAM, dr. Lydia M.Biomed AAM, dr. Lisa Silvani M.Biomed AAM, dr. Putu Oka Sidharta, dr. Herna, dr. Fatima Zahra, dr. Orlen Plaudo Sompotan dan dr. Dewi Anggreani Indra M.Biomed AAM yang telah memberikan saran dan dukungan selama penyusunan tesis ini berlangsung. Semoga Tuhan Yang Maha Esa senantiasa memberikan rahmat-nya kepada semua pihak yang telah membantu penyelesaian tesis ini. Penulis menyadari bahwa tesis ini jauh dari sempurna, karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Akhir kata penulis ucapkan, semoga hasil penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Denpasar, 24 Maret 2016 vii

8 viii Penulis, Nadia Permatasari

9 ABSTRAK PEMBERIAN SEL PUNCA MESENKIMAL WHARTON S JELLY INTRAVENA MENINGKATKAN JUMLAH SEL BETA PANKREAS DAN MENURUNKAN KADAR GLUKOSA DARAH PUASA PADA TIKUS (RATTUS NORVEGICUS) JANTAN GALUR WISTAR DIABETES MELITUS Diabetes melitus adalah penyakit metabolik yang ditandai dengan hiperglikemik dan kelainan metabolisme karbohidrat, protein dan lemak karena kelainan sekresi insulin, sensitivitas insulin atau keduanya. Berdasarkan penelitian sebelumnya, sel punca mesenkimal Wharton s Jelly memiliki kemampuan antiinflammatory, imunoregulasi yang dapat memperbaiki kontrol metabolik serta memiliki kemampuan berdiferensiasi menjadi pancreatic lineage cells yang berfungsi sebagai insulin-producing cells pada kultur in vitro. Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikkan bahwa pemberian sel punca mesenkimal Wharton s Jelly dapat meningkatkan jumlah sel beta pankreas dan menurunkan kadar glukosa darah puasa pada tikus (Rattus norvegicus) jantan galur wistar diabetes melitus. Rancangan penelitian yang digunakan adalah eksperimental murni dengan post test only control group design menggunakan 36 ekor tikus putih jantan. Semua sampel diinduksi dengan Streptozotocin dan Nicotinamide. Sampel yang dipilih dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kontrol yang diberikan glibenklamid + NaCl 0,9% dan kelompok perlakuan yang diberikan glibenklamid + sel punca mesenkimal Wharton s Jelly. Perhitungan jumlah sel beta pankreas dan pengukuran kadar glukosa darah dilakuan setelah 14 hari perlakuan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan memiliki jumlah sel beta pankreas yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol (105,17±16,379 sel/ lapang pandang vs 54,00±11,366 sel/ lapang pandang) (p< 0,001). Selain itu, kelompok perlakuan memiliki kadar glukosa darah puasa yang lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol (109,06±16,71 mg/dl vs 122,78±10,14 mg/dl) (p<0,05). Disimpulkan bahwa pemberian sel punca mesenkimal Wharton s Jelly intravena meningkatkan jumlah sel beta pankreas dan menurunkan kadar glukosa darah puasa pada tikus (Rattus norvegicus) jantan galur wistar diabetes melitus. Kata kunci: sel punca mesenkimal Wharton s Jelly, sel beta pankreas, kadar glukosa darah puasa, diabetes melitus. ix

10 ABSTRACT ADMINISTRATION OF WHARTON S JELLY MESENCHYMAL STEM CELL INTRAVENOUSLY INCREASE NUMBER OF PANCREATIC BETA CELL AND REDUCE FASTING BLOOD GLUCOSE LEVEL IN RAT (RATTUS NORVEGICUS) MALE WISTAR STRAIN DIABETES MELLITUS Diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by hyperglycemic and abnormal metabolism of carbohydrates, protein and lipid due to abnormal insulin secretion, insulin sensitivity or both. Based on previous research, Wharton s Jelly mesenchymal stem cells have anti-inflammatory, imunoregulation that can improve metabolic control and have the ability to differentiate into pancreatic lineage cells that function as insulin-producing cells in in vitro culture. The purpose of this study is to prove that the administration of Wharton s Jelly mesenchymal stem cells can increase number of pancreatic beta cell and reduce fasting blood glucose level in rat (Rattus norvegicus) male wistar strain diabetes mellitus. The design of the study was a true experimental with post test only control group design using 36 male rats. All samples induced by Streptozotocin and Nicotinamide. Selected samples were divided into two groups: the control group was given glibenclamide + NaCl 0.9% and the treatment group was given glibenclamide + Wharton s Jelly mesenchymal stem cells. The calculation of the number of pancreatic β cells and measurement of fasting blood glucose level was done after 14 days of treatment. The results showed that in the treatment group had a number of pancreatic beta cells higher than the control group ( ± cells / visual field vs ± cells / visual field) (p <0.001). In addition, the treatment group had a fasting blood glucose level lower compared with the control group ( ± mg / dl vs ± 10,14 mg / dl) (p <0.001). It was concluded that the administration of Wharton s Jelly mesenchymal stem cells intravenously increase number of pancreatic beta cell and reduce fasting blood glucose level in rat (Rattus norvegicus) male wistar strain diabetes mellitus. Keywords: Wharton s Jelly mesenchymal stem cells, pancreatic beta cell, fasting blood glucose level, diabetes mellitus. x

11 DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... i LEMBAR PENGESAHAN... iii PENETAPAN PENGUJI... iv SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... v UCAPAN TERIMA KASIH... vi ABSTRAK... ix ABSTRACT... x DAFTAR ISI..... xi DAFTAR GAMBAR..... xiv DAFTAR TABEL... xv DAFTAR LAMPIRAN.. xvi DAFTAR SINGKATAN... xvii BAB I 1 6 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian. BAB II KAJIAN PUSTAKA Penuaan Penyakit Degeneratif Diabetes Mellitus xi

12 Mekanisme Kematian Sel β Pankreas pada Diabetes Melitus Tipe 1 dan Kriteria Diagnosis Diabetes Melitus Intervensi Farmakologis Diabetes Melitus Sel Punca Karakteristik Sel Punca Jenis Sel Punca Sel Punca Embrionik (Embrionic Stem Cell) Sel Punca Dewasa (Adult Stem Cell) Homing Mekanisme Regenerasi Jaringan oleh Sel Punca Sel Punca Mesenkimal Karakteristik Sel Punca Mesenkimal Insulin Producing Cells (IPCs) Tingkat Keamanan Sel Punca Mesenkimal pada Aplikasi Klinis Diabetes melitus mengganggu potensi angiogenik pada adipose-derived stemcell Penurunan Karakteristik Sel Punca Mesenkimal Sel Punca Mesenkimal Wharton s Jelly (Wharton s Jelly Messenchymal Stem Cell/ WJ-MSC) Isolasi Sel Punca Mesenkimal Wharton s Jelly Sel Punca Mesenkimal Wharton s Jelly berdiferensiasi menjadi Insulin Producing Cells In Vitro... xii

13 Efek dan Keamaan Transplantasi Sel Punca Mesenkimal Wharton s Jelly Jalur pemberian sel punca mesenkimal wharton s jelly Hewan Percobaan Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Jantan sebagai Hewan Coba Kriteria Tikus Diabetes BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN Kerangka Berpikir Konsep Penelitian Hipotesis Penelitian 35 BAB IV METODE PENELITIAN Rancangan Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Populasi dan Sampel Populasi Kriteria sampel Sampel inklusi Sampel drop out Besar sampel Teknik penentuan sampel xiii

14 Variabel Penelitian Klasifikasi variabel penelitian Definisi Operasional Variabel Bahan dan Alat Penelitian Bahan penelitian Alat penelitian Prosedur Penelitian Pengambilan subyek dan jumlah subyek penelitian Perhitungan dosis sel punca mesenkimal untuk subyek Penelitian Cara pemeriksaan kadar glukosa darah puasa tikus Cara Pembuatan Histopatologi Jaringan Pankreas Prosedur pewarnaan Gomori Chrome Hematoxylin Phloxine B- Staining Penghitungan sel beta Pankreas Pemantauan keselamatan tikus di laboratorium Pelaksanaan penelitian Alur Penelitian Pengolahan dan Analisis Data BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Penelitian Pembahasan xiv

15 BAB VI SIMPULAN DAN SARAN 6.1 Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xv

16 Lampiran 1 70 Lampiran 2 73 Lampiran 3 74 Lampiran 4 76 Lampiran 5 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Analisis Statistik dengan SPSS Sertifikat POM. Animal Model Hasil Pemeriksaan Imunohistokimia Sel Beta Pankreas.. Ethical Clearance dengan Judul Penelitian Pemberian Sel Punca Mesenkimal Wharton s Jelly Intravena Menurunkan Kadar Glukosa Darah Puasa dan Memacu Regenerasi Sel Beta Pankreas pada Tikus (Rattus norvegicus) Jantan Galur Wistar Diabetes Melitus.. 80 xvi

17 DAFTAR SINGKATAN AdMSCs : Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stem Cells ASC : Angiogenik Adipose-Serived Stem Cell BM : Bone Marrow BM-MSCs : Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells BMSC : Bone Marrow Stem Cell CD : Cell Differentiation DM : Diabetes Melitus EPC : Endothelial Progenitor Cell ESRD : End-Stage Renal Disease GDP : Glukosa Darah Puasa h AdMSCs : human Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stem Cells hescs : human Embryonic Stem Cells HIF-1α : Hypoxia-Inducible Factor 1-Alpha hmsc : human Mesenchymal Stem Cell HUCPVCs : Human Umbilical Cord Perivascular Cells humsc : human Mesenchymal Stem Cell IDDM : Insulin Dependent Diabetes Mellitus IFN- γ : Interferon-γ IL-1β : Interleukin-1β IPC : Insulin Producing Cell M-CSF : Macrophag-Colony Stimulating Factor MSC : Mesenchymal Stem Cell NIDDM : Non-dependent Diabetes Mellitus NeuroD1 : Neurogenic Differentiation 1 NF-κB : Nuclear Factor-κ B NK : Natural Killer NO : Nitric Oxide PDX-1 : Pancreatic and Duodenal Homebox 1 RT-PCR : Real Time-Polymerase Chain Reaction SH2 : Src Homology 2 SH3 : Src Homology 3 STAT1 : Signal Transducer and Activator of Transcription 1 TNF-α : Tumor Necrosis Factor-α UC : Umbilical Cord VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor WJ-MSC : Wharton s Jelly Mesenchymal Stem Cell xvii

18 DAFTAR TABEL Halaman 1.1 Diferensiasi dari beberapa Populasi Sel Punca Mesenkimal Menjadi Isletlike Cells Hasil Analisis Deskriptif Data Jumlah Sel Beta Pankreas Hasil Analisis Deskriptif Data Kadar Glukosa Darah Puasa Hasil Uji Normalitas Data sel beta pankreas Hasil Uji Normalitas Data Glukosa Darah Puasa Hasil Uji Homogenitas Data Jumlah Sel Beta Pankreas antar Kelompok Hasil Uji Homogenitas Data Kadar Glukosa Darah Puasa antar Kelompok Rerata Jumlah Sel Beta Pankreas antar Kelompok Sesudah Perlakuan Rerata Kadar Glukosa Darah Puasa masing-masing Kelompok xviii

19 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Perbedaan persentase jumlah sel yang berdiferensiasi menjadi adipogenik dan osteogenik ADSC pada pasien DM dan non DM.. 22 Gambar 2.2 Sel punca mesenkimal wharton s jelly.. 25 Gambar 2.3 Isolasi dari sel punca mesenkimal wharton s jelly..25 Gambar 2.4 Kultur sel punca mesenkimal wharton s jelly hari 1,3 dan 5 setelah passase hari ke Gambar 2.5 Isolasi dan karakteristik dari WJ-MSC.. 26 Gambar 2.6 Hasil Diferensiasi Gambar 2.7 Kadar glycated hemoglobin, glukosa puasa dan glukosa 2 jam post prandial selama 12 bulan periode penelitian.. 28 Gambar 2.8 Adhesi MSC pada pulau pankreas 30 Gambar 2.9 Evaluasi persentase survival MSC pada pulau pankreas Gambar 3.1 Konsep Penelitian.. 34 Gambar 4.1 Bagan Alur Penelitian..51 Gambar 5.1 Imunohistokimia Pankreas Tikus Kelompok P0 54 Gambar Gambar Gambar 5.4 Perlakuan 61 Imunohistokimia Pankreas Tikus Kelompok P1 Grafik Perbandingan Jumlah Sel Beta Pankreas Sesudah Perlakuan antar Kelompok.. Grafik Perbandingan Kadar Glukosa Darah Puasa Sesudah antar Kelompok.. xix

20 xx