DAFTAR PUSTAKA. Bellanti JA Immunology III. Wahab AS, penerjemah. Yogyakarta. Gajah Mada University Press.

Transkripsi

1 DAFTAR PUSTAKA Anonimous Bruselosis. Mayo clinic com tools for health lives. [27 September 2007] Bellanti JA Immunology III. Wahab AS, penerjemah. Yogyakarta. Gajah Mada University Press. Budiarta S dan Suardana IW Epidemiologi dan Ekonomi Veteriner. Ed I. Bali. Udayana Press. Canning PC, Roth JA, Deyoe BL Release of 5-guanosine monophosphate and adenine by B. abortus and their role in the intracellular survival of the bacteria. J. Infect. Dis 154: [CDC] Center for Disease Control and Prevention Bruselosis (Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis and Brucella canine) [27 Sept 2007]. Davis and Danelle BW Bruselosis. The centre for food security & public health (CFSPH). Lowa State University. [27 September 2007]. Enright FM The pathogenesis and pathobiology of Brucella infection in domestic animal. Nielsen K, Ducan R. penerjemah. Boca Raton Boston CRC Perss. Fedik AR Metode Imunologi. Surabaya. Airlangga University Press. Frenchick PJ, Markham RJF, Cochrane AH Inhibition of phagosome lysosome fusion in macrophages by soluble extract of virulent Brucella abortus. Am. J. Vet. Res. 46: Ghaffar A Zoonoses, Listeria, Francella, Brucella, Bacillus and Yersinia. Microbiology and Immunology on line. University of South Care School Medicine. [26 September 2007]. Gomez M, Moriyon MJ Demontration of a peptidoglycon-linked lipoprotein and characterization of its trypsin fragment in the outer membrane of Brucella sp. Infect. Immun. 53:678. He Yongqun Induction of protection, antibodi and cell mediated immune responses by Brucella abortus strain RB 51, Ochrobacterium anthtropi

2 and recombinan there of [Disertation]. Virginia. Institute and University Virginia. Hirsh DC, Maclachlan NJ, Walker RL Veterinary Microbiology. 2 sd Ed. Australia. Blackwell publishing. Ko Jinkyung, Splitter AG Molekuler host pathogen interaction in Brucellosis current understanding and future approches to vaccine development for mice and human [Reviews]. J Clinical Microbiology 16: Misra DS, Kumar A, Sethi MS Effect of erytrithol and sex hormones on the growth of brucella spesies. J. Experimental Biology 14,1: Moreno E, Jones LM, Berman DT Immunochemical characterization of rough Brucella lipopolysaccharides. Infect. Immunol 43:777. Moreno E, Rojas N, Nielsen, Gall D Comparison of different serological assay for the differential diagnosis of Bruselosis. J. Immunol 123: Nassir W, Lisgaris M, Salata RA Brucellosis. [15 Desember 2008] Nassir W Brucellosis. [25 September 2007]. Ocholi RA, Keaga JKP, Ajogi I, Bale JOO antibodiortion due to Brucella abortus in sheep in Negeria.[ Rev] J. Sci Tech Epiz 3: Osman E, Hadii H, Hasan S, Corlu M Comparasion of Rose Bengal Plate Test antigens prepared from B. abortus, B. millitensis and B. suis. J. Bull Vet Inst Pulawy 49: Plommet M, Fensterbank R Vaccination against bovine brucellois with low dose of strain 19 administrated by the conjunctival route. III. serological response and immunity in pregnant cow. Annu. Res Vet 7:9-23. Quinn P.J., B.K. Markey, M.E. Carter, W.J.Donnelly, F.C. Leonard Veterinary Microbiology and Microbial Disease. Blackwell publishing Rojas X, Alonso O LISA for diagnosis and epidemiology of B. abortus infection In cattle in Chile [Editorial]. Clinical Diag Lab Immunol 1:1-5.

3 Sudibyo A Studi Brucellosis dan Karakterisasi Protein Antigenik B. abortus Isolat Lapang pada Sapi Perah [Tesis]. Istitut Pertanian Bogor. Indonesia. Thrusfield M Veterinary Epidemiology. 3 rd Ed. Veterinary Clinical Studies Royal (DICK) Shool of Veterinary Studies. University of Edinburgh Tittarelli et al Use of chemiluminascence for the serological diagnosis of bovine and ovine Bruselosis with indirect and competitive Enzym Linked Immunosorbent (ELISA). Veterinaria Italiana 44: Tizard I Immunologi Veteriner. Partadireja M., penerjemah. Surabaya. Airlangga University Press. Terjemahan dari: An Introduction to Veterinary Immunology. Verstreate DR, Creay MT, Caveney NT, Baldwin CL, Bald MW, Winter AJ Outer membrane protein of B. abortus: Isolation and characterization. Infect. Immun.35:

4 Lampiran 1. Tabel data lalulintas sapi dan kambing di pelabuhan penyeberangan Merak tahun No Tahun Sapi (ekor) Kambing (ekor) ,777 65, ,804 69, ,313 59, ,093 23, ,002 12, ,493 33, ,280 15, ,729 69,632 Lampiran 2. Prosedur pemeriksaan 1. Metode Rose Bengal Test (RBT) Pengambilan contoh serum dari sapi dan kambing potong menggunakan spuit 3 (Trumo) yang sucihama. Serum dipengumpulan dalam tabung kecil (Eppendorf) dan dilabel. Contoh serum dan antigen harus disesuaikan dengan suhu kamar sebelum pemeriksaan dimulai. Metode ini harus dilakukan di kaca jernih berupa plastik, porselin atau kotak persegi yang bersih dan steril. Sebaiknya menggunakan cawan atau plate (WHO hemagglutination tray).serum sapi dan kambing potong sebesar 25 μl atau 30 μl dengan menggunakan singlechannel pipet μl (Wiegthex) dan reagen RBT (BBALITVET) sebesar 25 μl (1 tetes) diletakan di sumur plat atau cawan (WHO hemagglutination tray) kemudian dicampur hingga rata dengan menggunakan pengaduk yang sucihama atau goyang plate menurut arah jarum jam dan kemudian dengan arah berlawanan atau menggunakan rotary agglutinator (Shaker) (Biotek). Setelah 4-5 menit reaksi agglutinasi dapat diamati. Hasil RBT positif terdiri dari hasil metode RBT positif () yaitu; agglutinasi sempurna, cairan jernih dan tampak jelas. RBT positif () yaitu; agglutinasi berupa pasir halus, cairan agak jernih batas cukup jelas. RBT positif () yaitu; aglutinasi berupa pasir halus, cairan tidak jernih batas garis. 2. Complement Fixation Test (CFT) Prosedur Pembuatan Reagen Komplemen adalah serum normal marmot. Komplemen (konsentrasi 10%) terdiri dari serum normal marmot sebanyak 200 ul dan ditambah phosfate buffer

5 salin (PBS) (Promega) sebanyak 1,8. Hemolisin adalah serum dari kelinci yang telah disuntik RBC domba (konsentrasi 4%) (1 domba/kg BB, IV). Hemolisin (perbandingan 1:100) terdiri dari hemolisin stok sebanyak 100 µl dan ditambah PBS sebanyak 9,9. Hemolisin (perbandingan 1:150) terdiri dari hemolisin (perbandingan 1:100) sebanyak 2 dan ditambah PBS sebanyak 1. RBC domba sebanyak 4 dicuci dengan NaCl fisiologis (Oshaka), kemudian sentrifuse (Hae) kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Dilakukan pengulangan sebanyak dua kali untuk menghilangkan antikoagulan Na sitrat (Sigma) (konsentrasi 3,85%). Supernatan dibuang hingga tinggal RBC murni. Untuk RBC ( konsentrasi 4%) terdiri dari RBC domba sebanyak 200ul dan NaCl fisiologis (Oshaka) sebanyak 4,8. Sistem hemolitik adalah campuran antara RBC domba (konsentrasi 4%) dengan hemolisin bertiter 4 unit, disebut juga sistem indikator. Satu unit hemolisin adalah pengenceran tertinggi yang menunjukkan hemolisis lengkap. A. Titrasi Hemolisin Tabung reaksi (Pyrex) sebanyak dua belas disusun menjadi dua baris ( A dan B). Baris A nomor ganjil yaitu 1, 3, 5, 7, 9 dan 11 dan Baris B nomor genap yaitu 2, 4, 6, 8, 10 dan 12. Baris A dan baris B merupakan gambaran titrasi hemolisin. Larutan dari ke enam tabung dihomogenkan dengan cara menggoyang rak tabung reaksi, kemudian di inkubasikan (Memmert) dalam penangas air selama 30 menit, 37 o C. Pada masing-masing tabung kemudian ditambahkan komplemen (konsentrasi 10%), diikuti dengan menambahkan RBC domba (konsentrasi 4%). Tabung reaksi (Pyrex) disusun kembali menjadi satu baris dengan nomor yang berurutan (1-12), larutan dihomogenkan dan diinkubasikan kembali selama 30 menit, 37 o C. Membaca titer hemolisin, yaitu pengenceran tertinggi yang masih menyebabkan terjadinya lisis sempurna RBC domba. Hasil lisisnya RBC terjadi pada tabung ke-4, sehingga titer hemolisis adalah perbandingan 1:600. Membuat sistem indikator (sistem hemolitik) RBC domba (konsentrasi 4%) dicampur dengan 4 unit titer hemolisin (4 kali konsentrasi 1:600). Pembuatan larutan hemolisin 4 unit adalah hemolisin (perbandingan 1:100) sebanyak 2 dan ditambah PBS1. Skema terinci sebagai berikut.

6 µl NaCl Buan Pengenceran akhir hemolisin 1:200 1:40 1:80 1:1600 1:3200 1: Hemolisi n Buan Pengenceran akhir hemolisin 1:300 1:60 1:1200 1:2400 1:4800 1:9600 B. Titrasi Komplemen Tabung reaksi (Pyrex) sebanyak enam buah disusun dalam satu baris dan diberi nomor berurut dari 1 sampai 6. Larutan dihomogenkan dengan cara menggoyang rak tabung reaksi, kemudian diinkubasikan dalam penangas air (Memmert) selama 10 menit 37 o C. Hasil lisis RBC pada tabung ke-6 sehingga titrasi komplemen adalah (konsentrasi 6%).

7 Prosedur titrasi komplemen sebagai berikut 10% Komplemen Lar. buffer agar menjadi 0,025 0,225 0,050 0,200 0,075 0,175 0,100 0,150 0,125 0,125 0,150 0,100 pengganti antigenantibodi 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 C. Metode Spesifitas Serum Serum metode yang telah diinaktivasi dengan pemanasan selama 30 menit 56 o C di penangas air (Memmert) antigen ND, NaCl fisiologis (Oshaka) (konsentrasi 0,95 %), komplemen (konsentrasi 6%) dan sistem hemolitik. Dua seri masing-masing terdiri dari enam buah tabung reaksi disusun dalam satu baris dan diberi nomor berurut satu sampai enam. Pada seri pertama komplemen yang digunakan adalah komplemen yang masih baru, sedangkan pada seri kedua digunakan komplemen yang sudah disimpan satu malam. Hasil yang di harapkan adalah terjadi hemolisis pada tabung ke-4 yaitu kontrol antigen sehingga yang dimetode adalah benar serum yang mengandung antibodi terhadap antigen. Pada tabung keenam tidak terjadi lisis berarti serum yang dimetode mengandung antibodi terhadap ND.

8 Tabel metode uji spesifisitas serum (CFT) Tabung T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T6 Pengenceran akhir hemolisin Serum yang di metode Serum metode Antigen (BSA) Kontrol Serum Kontrol Serum Kontrol Antigen (BSA) NaCl fis Komplemen 6% Kontrol Antigen Kontrol Antigen (ND) (BSA) (ND) Larutan dihomogenkan dengan cara menggoyang rak tabung reaksi dan diinkubasi selama 30 menit 37 ºC pada penangas air. Sistem hemolitik Larutan dihomogenkan dengan cara menggoyang rak tabung reaksi dan diinkubasi selama 30 menit 37 ºC 3. Enzym Linked Immuno Assay (I-ELISA) Prosedur I-ELISA Plat yang telah dicoating disimpan pada suhu 4 o C. Cuci plat dengan buffer pencuci I-ELISA (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect) beberapa kali sebelum dipakai. Selanjutnya ditambahkan 50 ui serum (pengencera 1 : 200) dalam PBS Tween (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect) pada setiap sumur. Gunakan serum kontrol positif dan negatif (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect) pada setiap plat. Kemudian diinkubasikan (Memmert, Jerman) selama 1 jam dalam suhu kamar. Cuci plat dengan buffer pencuci I-ELISA atau PBS Tween (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect). Tambahkan 50 ui (pengenceram 1 : 4000) konjugat (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect) pada setiap sumur untuk menguatkan kerja dalam PBS Tween (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect). Kemudian diinkubasikan selama 1 jam dalam suhu kamar. Plat dicuci dengan buffer pencuci I-ELISA atau PBS Tween (SERELISA Brucella OCB antibodi

9 Mono Indirect). antibodisorbents (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect) ditambahkan sebanyak 100 ui larutan penguat subtrat (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect). Kemudian dinkubasikan selama menit dalam suhu kamar. Pembacaan hasil dalam gelombang menggunakan I- ELISA reader (Biotek ELX 808) dengan bicromatic pada 450 nm dan 630 nm atau monocromatic pada 450 nm. I-ELISA positif, jika OD lebih dari nilai alfa (α). Nilai α adalah hasil perkalian 0,6 dengan OD positif. Tatacaranya Penyiapan larutan untuk metode dijelaskan secara rinci pada bagian reagen I-ELISA (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect). Hanya gelas air suling dipergunakan untuk test, sebab tipe lain dari air suling mungkin mengakibatkan tidak aktifnya enzim konjugat (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect). Satu plat microtitre cukup untuk 40 contoh termasuk contoh kontrol. Contoh test ditambahkan dari kolom 1 ke kolom 10, sedangkan untuk kolom 11 dan 12 dipergunakan untuk contoh kontrol. Contoh ditambahkan secara duplikat pada baris A1 A2, A3 A4, A5 A6 dan seterusnya. Contoh Serum Larutkan serum test (perbandingan 1 : 200) pada PBS Tween (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect) ( 5 ui/1 atau 10 ui/2 ). Larutkan kontrol negative (perbandingan 1 : 200) dengan PBS Tween. Larutkan kontrol positif pada larutan awal yang disarankan dan kemudian larutkan 2 fold pada 5 pengenceran berikutnya. Sebagai contoh : 1: 2000, 4000, 8000, 16000, 32000, Tambahkan 50 ui dari setiap serum secara duplikat pada plat. Tambahkan 50 ui PBS-Tween pada sumur A11 A12 untuk kontrol konjugat (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect). Serum negatif ditambahkan pada sumur B11 B12 (kontrol negatif). Serum control positif ditambahkan pada kolom 11 dan 12 dengan pengenceran terendah dalam baris H dan tertinggi pada baris C. Pastikan tidak ada gelembung udara dalam sumur tersebut. Inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar. Cuci plat dengan buffer pencuci I-ELISA (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect).

10 Konjugat Pengenceran konjugat (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect) untuk penguat kerja dalam PBS-T/casein. Tambahkan 50 ui pada larutan kerja pada setiap sumur. Pastikan tidak ada gelembung udara dalam setiap sumur, diinkubasi selama 60 menit pada suhu kamar. Cuci plat dengan buffer pencuci I- ELISA. (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect). Larutan substrat (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect) disiapkan dan biarkan sampai mencapai suhu kamar. Substrat Substrat (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect) sebanyak 100 ui ditambahkan pada setiap sumur. Pastikan tidak ada gelembung udara dalam setiap sumur, Inkubasi selama 60 menit pada suhu kamar. I-ELISA reader (Biotek ELX 808) dihidupkan untuk dipanaskan sebelum pembacaan. Pembacaan Plat dengan hati-hati dimasukan dan dipastikan tidak terdapat gelembung udara. Serum kontrol di cek sebelum metode dilakukan. Serum kontrol mampu memberikan angka yang berada dalam selang batasan, bila tidak batalkan test tersebut dan diulang kembali. Catat nilai absorpsi dari setiap contoh serum. Pembacaan hasil dalam gelombang menggunakan I-ELISA reader (Biotek ELX 808) denga bicromatic pada 450 nm dan 630 nm atau monocromatic pada 450 nm. I-ELISA positif, jika OD lebih dari nilai alfa (α). Nilai α adalah hasil perkalian 0,6 dengan OD positif. Hasil yang diperoleh perlu dianalisa dengan mengalihkan unit absorpsi menjadi unit I-ELISA dengan mempergunakan program komputer (SERELISA Brucella OCB antibodi Mono Indirect). Interprestasi Setiap contoh dibandingkan dengan contoh kontrol pada plat. Setiap contoh harus dibandingkan dengan contoh kontrol pada plat yang bersangkutan. Cut-off adalah merupakan serapan pada (pengenceran 1:32000) dari serum kontrol. pabila contohkontrol positif yang lain dipergunakan, hasilnya harus dibandingkan dengan referensi kontrol positif. Pembacaan contoh test yang lebih besar dari rata-rata nilai potong adalah positif, tetapi apabila lebih rendah artinya negatif.

11 Antibodisorpsi dari contoh duplikat seharusnya tidak berbeda lebih 20% dari satu dengan lainnya. Apabila absorpsi dekat dengan nilai potong (dalam 1 titre dari nilai potong), sebaiknya dilakukan metode ulang. antibodisorpsi dari kontrol positif harus dimetode disetiap laboratorium dalam kondisi setempat, paling tidak 10 kali pelaksanaan untuk memastikan reaksinya. Sebagai pegangan bahwa absorpsi dari sampai dari larutan potong (Reference ve 1:32.000) dapat terjadi. Nilai potong ini diberi tanda sebagai unit I-ELISA. Contoh positif atau negative dapat terjadi, periksa ulang hasil yang berbeda pada variasi dari hasil metode yang lain (seperti RBT dan CFT ) untuk memastikan hasilnya. Pada waktu melakukan metode sediakan dan simpan sisa larutan konjugat dan substrat sampai metode diselesaikan. Apabila warnanya tidak timbul dengan baik, maka dilakukan pengecekan apakah konjugat dan substrat bekerja yaitu dengan cara menambahkan larutan konjugat ke dalam substrat. Untuk itu perlu ditambahkan 10 ui konjugat kedalam 1 substrat, dan ini akan memberikan warna yang kuat dalam waktu 5 menit. Apabila warna tetap tidak timbul maka dicek pengenceran substrat dan konjugat. Pastikan bahwa hydrogen peroxide masih segar dan aktif. Bila meragukan buatlah larutan baru. Pastikan bahwa gelas air suling dipergunakan pada setiap tahapan dalam test ini. Air suling mengandung metal akan membuat enzim ini aktif dan akan mengakibatkan reaksi warna yang lemah dalam metode. Apabila latar belakang nampak tinggi, harap dicek larutan pencuci untuk meyakinkan bahwa PBS Tween telah ditambahkan, cek prosedur pencucian. Pastikan bahwa larutan PBS Tween diganti secara teratur. Larutan dan cuci botolnya dibuang apabila dianggap bahwa larutan mengalami kontaminasi. Cairan yang terkontaminasi akan mengakibatkan reaksi warna yang lemah. Apabila serum kontrol positif secara tetap memberikan bacaan yang rendah, di cek ulang kerja larutan konjugat dengan cara melakukan titrasi antigen dan konjugat. Plat mungkin perlu diganti, plat lain yang telah coating dengan antigen.

12 4. Elektroforesis Metode SDS Page Persiapan reagen SDS PAGE Acrylamide/Bis (Sigma Chemical) (30% T, 2,67% C) terdiri dari acrylamide(sigma Chemical) sejuah 140 gr, NN Methylene-bis- Acrylamide(Sigma Chemical) sejuah 4 gr, larutkan dalam akuabides sampai volume 500 simpan pada suhu 4 o C dalam wadah gelap. Masa pakai 30 hari. Tris HCl (Sigma Chemical) (1,5 M ph 8,8) terdiri dari Tris base (Sigma Chemical) (ph 8,8) sejuah 54,25 gr, larutkan dalam akuabides sampai 150 dengan HCl, kemudian tambahkan aquabides sampai volume 300. Tris-HCl (Sigma Chemical) (0,5 M ph 6,8) terdiri dari Tris base (Sigma Chemical) (ph 6,8) sejuah 6 gr, dilarutkan dalam akuabides sampai 60 dengan HCl kemudian tambahkan akuabides sampai volume 100. SDS (Sigma Chemical) (konsentrasi 10%) terdiri dari larutkan SDS (Sigma Chemical) 10 gr dalam 60 akuabides dengan stirer, kemudian tambahkan akuabides sampai volume 100. Ammonium Persulfat (Sigma Chemical) (konsentrasi 10%) terdiri dari larutkan 10 gr ammonium persulfate (Sigma Chemical) dalam 100 akuabides. Contoh buffer terdiri dari akuabides 3, Tris HCl (Sigma Chemical) (0,5 M ph 6,8) sebanyak 1,0, Glycerol (Sigma Chemical) 1,6, SDS (Sigma Chemical) (konsentrasi 10%) sejuah 1,6, β-merkaptoetanol (Sigma Chemical, USA) sejuah 0,4, bromophenol blue (Sigma Chemical) (konsentrasi 0,5%) dalam akuabides sejuah 0,4, dilute sampai dengan (perbandingan 1 : 4). Selanjutnya dipanaskan pada 95 o C selama 4 menit (contoh buffer) dapat diganti dengan contoh buffer komersil. Contoh buffer komersil (Promega) dan contoh buffer adalah (perbandingan 1 : 1).

13 Persiapan Gel Tabel persiapan pembuatan gel Uraian Gel Pemisah Gel Pengumpul (375 M Tris, ph 8,8) (125 M Tris, ph 6,8) Monomer concentration 12% 4% (%T, 2,67% C) Acrylamide/Bis (30% T, 2,67% C) 2,4 260 µl Akuabides 2 1, 22 1,5 M Tris HCl ph 8,8 1,5-0,5 M Tris HCl ph 6,8-0,5 10% (w/v) SDS 60 µl 20 µl 10% (w/v) Ammonium Persulfate 30 µl 10 µl TEMED 3 µl 2 µl Konsentrasi gel pengumpul (stacking gel) (konsentrasi 4%) dan gel pemisah (separating gel) (konsentrasi 12%). Volume gel pemisah dan pengumpul dapat diperbesar atau diperkecil sesuai ukuran cetakan gel yang tersedia (umumnya setiap merk elektroforesis berbeda volume). Dapat dibuat kelipatannya. Elektroforesis yang digunakan (Sigma). Persiapan pewarnaan gel SDS Page dapat diwarnai dengan metode pewarnaan coomasie blue(sigma Chemical) atau silver staining (Sigma Chemical). Larutan coomasie blue(sigma Chemical) terdiri dari larutkan gr coomasie blue (Sigma Chemical) dalam 125 metanol(sigma Chemical), 25 asam asetat glasial (Sigma Chemical) dan 100 akuabides. Larutan pemucat dihomogenkan 100 metanol (Sigma Chemical)100, asam asetat glasial (Sigma Chemical) dan 800 akuabides. Pembuatan agar akrilamid (Sigma Chemical) dilakukan dengan bantuan dua buah lempeng kaca yang berukuran 18 x 15,5 cm (Pharmacia Biotech) yang telah dibersihkan dengan alkohol (konsentrasi 70%), pada kedua sisi tepi bagian dalam diberi spacer, kedua lempeng kaca dihimpitkan dan selanjutnya dijepit. Di bagian atas lempeng kaca disisipkan sisir pembuat jalur dan kemudian diisi gel pemisah (konsentrasi 12% poliakrilamid) sampai 1 cm di bawah ujung sisir

14 dengan bantuan mikropipet dan dibiarkan sekitar 30 menit kemudian diisi gel pengumpul (konsentrasi 4% poliakrilamid) hingga mencapai permukaan lempeng kaca. Elektroforesis Contoh Contoh dilarutkan dengan larutan buffer (Sigma Chemical) contoh dengan (perbandingan 1 : 1) dan campuran ini kemudian diinaktifkan dalam water bath (Memmert) pada suhu 60 o C selama 5 menit sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis. Sebanyak 10µl contoh dimasukkan kedalam masing-masing sumur, kemudian perangkat elektroforesis (Sigma) dijalankan dengan arus 50 ma dengan tegangan 100 Volt, kurang lebih selama 3 jam. Elektroforesis berakhir apabila pewarna sampai mencapai batas 0,5 cm dari bagian bawah gel. Setelah elektroforesis berakir, gel diangkat dari lempeng kaca (Parmacia-Biotech) dan direndam dalam pewarnaan coomasie blue (Sigma Chemical Co.) selama 3 jam pada suhu ruang sambil diagitasi perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan merendam gel pada larutan pemucat metanol dan asam asetat sehingga gel berwarna bening atau pita-pita protein yang telah terbentuk terlihat jelas. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein dihitung dari garis awal separating gel sampai ujung protein yang dibandingkan dengan jarak migrasi tracking gel.

15 Lampiran 3. Tabel hasil positif RBT, CFT dan I-ELISA serum sapi potong dari Kabupaten di Jawa Timur No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Pasuruan Lumajang () 0 3 Ngawi () 0 4 Banyuwangi () 0 5 Tulung antigenung Blitar Madiun Bondowoso Sukohardjo Probolinggo Magetan Juah () 0 Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay Lampiran 4. Tabel Hasil positif RBT, CFT dan I-ELISA serum sapi potong dari Kabupaten di Jawa Tengah dan Daerah Istimewa Yogya No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Blora () 0 2 Banjar Negara Kebumen () 0 4 Bumi Ayu () 0 5 Wonosobo () 0 6 Brebes () 0 7 Purwokerto () 0 8 Wonogiri () 0 9 Salatiga Sleman Boyolali () 0 12 Klaten Sleman Grobokan Purbalingga Gunung Kidul Juah () 0 Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay

16 Lampiran 5. Tabel hasil positif RBT, CFT dan I-ELISA serum sapi potong dari Kabupaten di Jawa Barat No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Bogor () 0 2 Bekasi () 1 () 3 Subang () 0 4 Lembang () 0 5 Purwakarta () 0 6 Sumedang Tasikmalaya Depok Jonggol Juah () 1 () Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay Lampiran 6. Tabel hasil positif pemeriksaan RBT, CFT dan I-ELISA serum sapi potong dari Jakarta No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Jakarta Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay Lampiran 7. Tabel hasil positif RBT, CFT dan I-ELISA serum sapi potong dari Kabupaten di Banten No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Serang () 0 2 Merak () 0 Juah () 0 Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay Lampiran 8. Tabel hasil positif RBT, CFT dan I-ELISA serum kambing potong dari Kabupaten di Jawa Timur No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Banyuwangi () 0 2 Tulung antigenung () 0 3 Kediri Ngawi 1 0 1() 0 5 Nganjuk Juah () 0 Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay

17 Lampiran 9. Tabel hasil positif RBT, CFT dan I-ELISA serum kambing potong dari Kabupaten di Jawa Tengah dan Daerah Istimewa Yogyakarta No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Purwokerto Purbalingga Semarang () 0 4 Purworejo () 0 5 Boyolali Salatiga () 0 7 Wonosobo () 0 8 Sleman Kulon Progo Juah () 0 Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay Lampiran 10. Tabel hasil positif RBT, CFT dan I-ELISA serum kambing potong dari Kabupaten di Jawa Barat No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Majalengka () 0 2 Bogor Juah 4 0 1() 0 Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay Lampiran 11. Tabel hasil positif RBT, CFT dan I-ELISA serum kambing potong dari Jakarta No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Jakarta Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay Lampiran 12. Tabel hasil positif RBT, CFT dan I-ELISA serum kambing potong dari Kabupaten di Banten No Asal Contoh RBT CFT I-ELISA 1 Cilegon () 0 Juah () 0 Keterangan RBT:Rose Bengal Test, CFT: Complement Fixation Test I-ELISA: Enzym Linked Immuno Assay

18 Lampiran 13. Laporan hasil pengujian laboratorium terhadap brusellosis di FKH IPB

19 Lampiran 14. Laporan hasil pengujian laboratorium terhadap brusellosis di BBUSKP

20 Lampiran 15. Laporan hasil pengujian laboratorium terhadap brusellosis di BBALITVET