Lampiran 1 Sertifikat Kelaikan Etik

Transkripsi

1 Lampiran 1 Sertifikat Kelaikan Etik

2 Lampiran 2.1 Surat Izin Melakukan Penelitian Pendahuluan

3 Lampiran 2.2 Surat Izin Melakukan Penelitian Pendahuluan

4 Lampiran 3.1 Surat Izin Melakukan Penelitian

5 Lampiran 3.2 Surat Izin Melakukan Penelitian

6 Lampiran 3.3 Surat Izin Melakukan Penelitian

7 Lampiran 4.1 Sertifikat Pengujian

8 Lampiran 4.2 Perhitungan Kadar Curcumin dalam Sampel vs Curcumin dalam Standar dan Perhitungan Kadar Curcuminoid dalam Sampel vs Curcuminoid dalam Standar

9 Lampiran 4.3 Hasil Pemeriksaan KLT

10

11

12 Lampiran 5.1 Laporan Hasil Pengujian/Standarisasi Alat Stresor Bising

13

14

15 Lampiran 5.2 Spesifikasi Alat Stresor Bising

16

17 Lampiran 6 Konversi Perhitungan Dosis pada Hewan Coba (Laurence & Bacharach, 1964) Mencit 20 g Tikus 200 g Marmut 400 g Kelinci 1.5 kg Kucing 2 kg Kera 4 kg Anjing 12 kg Manusia 70 kg Mencit 20 g Tikus 200 g Marmot 400 g Kelinci 1.5 kg Kucing 2 kg Kera 4 kg Anjing 12 kg Manusia 70 kg

18 Lampiran 7 Volume Maksimum Larutan Sediaan Uji yang Dapat Diberikan pada Hewan Coba (Ritchel, 1974) Jenis Hewan Coba Volume Maksimum (ml) Sesuai Jalur Pemberian i.v i.m i.p s.c p.o Mencit (20-30 g) 0,5 0,05 1,0 0,5-1,0 1,0 Tikus (200 g) 1,0 0, ,0 Hamster (50 g) - 0, ,5 2,5 Marmut (300 g) - 0, ,0 Kelinci (2.5 kg) ,0 Kucing (3 kg) , ,0 Anjing (5 kg) , ,0 100,0

19 Lampiran 8 Kelompok Perlakuan pada Hewan Coba Mulai Kelompok 1 Kelompok 2 Kelompok 3 Kelompok 4 Kelompok 5 29/10/2012 CMC (+) Bising (+) Bising (+) Bising (+) Curcuminoid (+) CMC (+) Curcuminoid (+) Curcuminoid (+) CMC (+) CMC (+) CMC (+) Terminasi 1 12/11/2012 Mulai 12/11/2012 Tikus tidak diberi perlakuan apapun Mulai 12/11/2012 Bising (+) Curcuminoid (+) CMC (+) Terminasi 2 26/11/2012 CATATAN - Bising yang diberikan: 100 db selama 2 jam perhari - Curcuminoid diberikan: 50 mg/ekor perhari 100 mg/ekor perhari - CMC yang diberikan (0.5%) = 0.5 gr/100cc larutan - Setiap kelompok perlakuan diberikan bising terlebih dahulu lalu diikuti pemberian curcuminoid

20 Lampiran 9.1 Skema Pembuatan Preparat dengan Metode Parafin Deparafinisasi: 2-3 kali direndam dengan xylol 3 menit: 2-3 kali direndam dalam alkohol absolut dua kali selama 3 menit 2-3 kali direndam dalam alkohol 95% dua kali selama 3 menit 2-3 kali direndam dalam alkohol 80% dua kali selama 3 menit 2-3 kali direndam dalam alkohol 70% dua kali selama 3 menit Direndam dalam air Dikeringkan dengan tissue, diberi tanda dengan pena parafin Direndam dalam PBS selama 5 menit Diteteskan tripsin 0.025% selama 6 menit dalam 37 o C Dicuci dengan PBS 2-3 menit Diteteskan H 2 O 2 selama 2 menit, dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit Pemotongan dengan mikrotom, kemudian obyek diberi poliolesin

21 Lampiran 9.2 Pewarnaan Imunohistokimia Deparafinisasi: direndam dengan xylol 3 kali; direndam dalam alkohol Direndam dalam alkohol 95% tiga kali Direndam dalam alkohol 80% tiga kali Direndam dalam alkohol 70% tiga kali Preparat dicuci 2 kali dengan PBS Dilakukan bloking dengan BSA 3% selama 10 menit Preparat direaksikan dengan anti mouse sesuai variabel Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 4 o C dalam humidity chamber Preparat direaksikan dengan biotylized secondary Ab (anti rabbit) selama 1 jam Preparat dicuci dengan PBS 3 kali masing-masing 5 menit Ditambahkan streptavidin berlabel peroksidase dan diinkubasi selama 1 jam, kemudian dicuci dengan PBS 3 kali Direaksikan dengan substrat DAB yang dibuat baru dan diinkubasi 30 menit pada suhu kamar sambil digoyang-goyang Preparat dicuci akuades, kemudian ditambahkan pewarna meyer-he selama 10 menit Dicuci dengan air kran, kemudian dengan akuades Preparat diangin-anginkan, kemudian dengan akuades Preparat diangin-anginkan, kemudian diteteskan entelan dan ditutup cover glass Lampiran 9.3 Skema Cara Penghitungan Sel

22 Hewan coba diambil sampel jaringan, difiksasi dengan 10% formalin Sampel jaringan dibuat sediaan irisan setebal 2-4 µm, kemudian dilakukan pewarnaan Semua slide yang sudah berkode, ditutup nomer kodenya dan diberi nomor baru secara acak Pemeriksa terdiri dari 3 orang dan dilakukan terpisah Pemeriksaan dan penghitungan sel-sel dilakukan terhadap masing-masing slide pada bidang pandang di dinding lateral sediaan, yaitu daerah yang ditandai dengan adanya makrofag, dengan pembesaran 400, 1 lapangan pandang menggunakan gratikuli Hasil penghitungan sel-sel untuk setiap lapangan pandang sesuai dengan slide yang diperiksa ditulis di lembar kerja pada kotak yang sesuai dan hasil akhirnya dijumlah pada kotak kanan bawah

23 Lampiran 10.1 Gambar Alat Stresor Bising A B C D Keterangan: A. Kotak perlakuan terbuat dari gabus dilapis oleh busa, speaker diletakkan menempel pada atap penutup kotak dan pada dasar kotak dibuat lubang untuk mengukur intensitas B. CD Player dan Amplifier untuk mengatur intensitas (db) sesuai tombol volume dan dipastikan suara yang dihasilkan yang diukur dengan sound level meter C. Kotak perlakuan, CD Player dan Amplifier D. Sound level meter digital

24 Lampiran 10.2 Gambar Prosedur Penelitian A B C D Keterangan: A. Penimbangan berat badan tikus sebelum dan sesudah perlakuan B. Kandang tempat pemeliharaan tikus C. Curcuminoid yang sudah disuspensikan dengan CMC 0.5% D. Pemberian larutan curcuminoid pada tikus personde

25 A B C D Keterangan: A. Tikus yang sedang berada dalam kandang perlakuan B. Proses pengambilan tulang Temporal tikus C. Tulang Temporal tikus D. Tulang Temporal tikus dalam buffer Formalin 10%

26 Lampiran 11 Data Sampel Penelitian No Imunohistokimia Kel. HSP-70 MMP-9 TLR-2 TLR-4 NFκB Kolagen Tipe IV a a a a a b b b b b a a a a a b b b b b a a a a a b b b b b

27 Lampiran 10.3 Gambar prosedur pemeriksaan Imunohistokimia 1. Prestaining A Keterangan: A. Preparasi sampel dan memanaskan pada inkubator 37 0 C selama 24 jam

28 2. Deparafinisasi C B Keterangan: B. Menggunakan xylol dan alkohol berseri. Simpan pada suhu 4 0 C sampai dilakukan immunostaining C. Bilas dengan dh 2 O selama 5 menit dan lakukan pencucian dengan PBS ph 7.4 satu kali selama 5 menit dan tiriskan

29 D Keterangan: D. Blocking endogenous peroksida menggunakan 3% H 2 O 2 selama 20 menit. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit. Blocking unspecific protein menggunakan 5% FBS yang mengandung 0.25% Triton X-100 dan cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit E Keterangan: E. Inkubasi menggunakan monoklonal anti (antibodi primer) selama 24 jam pada 4 0 C

30 F Keterangan: F. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit. Kemudian inkubasi menggunakan anti mouse biotin conjugated selama 2 jam. G Keterangan: G. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit dan inkubasi menggunakan SA-HRP selama 40 menit pada temperatur ruangan

31 H Keterangan: H. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit dan tetesi dengan DAB (Diamino Benzidine) dan inkubasi selama 10 menit

32 J I Keterangan: I. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit dan dh 2 O 2 selama 5 menit, kemudian counterstaining menggunakan Mayer Hematoxilen yang diinkubasi selama 10 menit dan cuci dengan tap water J. Bilas menggunakan dh 2 O dan kering anginkan. Mounting menggunakan entelan dan tutup dengan cover glass. Amati pada mikroskop cahaya

33 Lampiran 12 Hasil Analisis Statistik 1 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values Perlakuan 8 K1 K2 K3A K3B K4A K4B K5A K5B Number of observations 40 2 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: HSP70 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model <.0001 Error Corrected Total R-Square Coeff Var Root MSE HSP70 Mean Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B K2 VS K K2 VS K K2 VS K K3A VS K3B K4A VS K4B K5A VS K5B Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B K4A VS K4B K5A VS K5B

34 3 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: MMP9 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model <.0001 Error Corrected Total R-Square Coeff Var Root MSE MMP9 Mean Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B K2 VS K K2 VS K K2 VS K K3A VS K3B K4A VS K4B K5A VS K5B Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B K5A VS K5B <.0001

35 4 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: TLR2 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model <.0001 Error Corrected Total R-Square Coeff Var Root MSE TLR2 Mean Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B K2 VS K K2 VS K K2 VS K K3A VS K3B K4A VS K4B K5A VS K5B Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B K4A VS K4B <.0001 K5A VS K5B <.0001

36 5 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: TLR4 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model <.0001 Error Corrected Total R-Square Coeff Var Root MSE TLR4 Mean Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B K2 VS K K2 VS K K2 VS K K3A VS K3B K4A VS K4B K5A VS K5B Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B K5A VS K5B <.0001

37 6 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: NFkBp65 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model <.0001 Error Corrected Total R-Square Coeff Var Root MSE NFkBp65 Mean Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B K2 VS K K2 VS K K2 VS K K3A VS K3B K4A VS K4B K5A VS K5B Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B K4A VS K4B <.0001 K5A VS K5B <.0001

38 7 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: Kolagen4 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model <.0001 Error Corrected Total R-Square Coeff Var Root MSE Kolagen4 Mean Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B K2 VS K K2 VS K K2 VS K K3A VS K3B K4A VS K4B K5A VS K5B Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B K5A VS K5B <.0001