SITI ELIANA ROCHMI

Transkripsi

1 TESIS PENGARUH SUPLEMENTASI INSULIN TRANSFERIN SELENIUM (ITS) PADA MEDIA MATURASI TCM-199 TERHADAP EKSPRESI KALSIUM (Ca 2+ ) INTRASELULER DAN PERSENTASE MATURASI OOSIT SAPI PENELITIAN EKSPERIMENTAL LABORATORIS Oleh: SITI ELIANA ROCHMI PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOLOGI REPRODUKSI FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2015 ii

2 PENGARUH SUPLEMENTASI INSULIN TRANSFERIN SELENIUM (ITS) PADA MEDIA MATURASI TCM-199 TERHADAP EKSPRESI KALSIUM (Ca 2+ ) INTRASELULER DAN PERSENTASE MATURASI OOSIT SAPI PENELITIAN EKSPERIMENTAL LABORATORIS TESIS untuk memperoleh gelar Magister dalam Program Studi Ilmu Biologi Reproduksi pada Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya SITI ELIANA ROCHMI NIM PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOLOGI REPRODUKSI FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2015 iii

3 PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam Tesis berjudul: PENGARUH SUPLEMENTASI INSULIN TRANSFERIN SELENIUM (ITS) PADA MEDIA MATURASI TCM-199 TERHADAP EKSPRESI KALSIUM (Ca 2+ ) INTRASELULER DAN PERSENTASE MATURASI OOSIT SAPI tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar Magister di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Surabaya, 17 Desember 2015 Siti Eliana Rochmi NIM iv

4 TESIS INI TELAH DISETUJUI 17 Desember 2015 Oleh: Pembimbing Ketua Dr. Hardijanto, drh., M.S. NIP Pembimbing Prof.Dr. Wurlina, drh.,ms. NIP Mengetahui, Ketua Program Studi Ilmu Biologi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Prof.Dr. Wurlina, drh.,ms. NIP v

5 Usulan Penelitian Tesis ini Telah diuji dan dinilai pada Tanggal : 13 Juli 2015 PANITIA PENGUJI USULAN PENELITIAN TESIS Ketua Anggota : Dr. Hardijanto, drh., M.S. : 1. Prof. Dr. Wurlina, drh.,ms. 2. Prof. Dr. Imam Mutofa, drh., M.Kes 3. Dr. Widjiati, drh., M.Si 4. Dr. Suherni Susilowati, drh., M.Kes vi

6 48 oosit matur paling tinggi dibandingkan dengan dosis yang lain dalam penelitian ini. Penggunaan ITS pada maturasi oosit in vitro pada kambing (Firmiaty, 2014) diperoleh hasil yang belum signifikan dengan dosis 5 µg/ml dan 10 µg/ml. pada penelitian ini maturasi oosit menunjukkan hasil yang signifikan dan dosis terbaik suplementasi ITS adalah 20 µg/ml. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa hipotesis terbukti (H0 = H1). Pemberian Insulin Transferrin Selenium (ITS) pada media maturasi TCM-199 dapat meningkatkan maturasi oosit.

7 Hasil Penelitian Tesis ini Telah diuji dan dinilai pada: Tanggal : 8 Desember 2015 PANITIA PENGUJI HASIL PENELITIAN TESIS Ketua Anggota : Prof. Dr. Imam Mutofa, drh., M.Kes : 1. Dr. Widjiati, drh., M.Si 2. Dr. Suherni Susilowati, drh., M.Kes 3. Dr. Hardijanto, drh., M.S. 4. Prof. Dr. Wurlina, drh.,ms. vii

8 Tesis ini Telah diuji dan dinilai pada: Tanggal : 17 Desember 2015 PANITIA PENGUJI TESIS Ketua Anggota : Prof. Dr. Imam Mutofa, drh., M.Kes : 1. Dr. Widjiati, drh., M.Si 2. Dr. Suherni Susilowati, drh., M.Kes 3. Dr. Hardijanto, drh., M.S. 4. Prof. Dr. Wurlina, drh.,ms. Surabaya, Januari 2016 Program Studi Magister Ilmu Biologi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Dekan, Prof. Dr. Pudji Srianto, drh., M.Kes NIP viii

9 UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur kehadirat Allah SWT atas karunia yang telah diberikan kepada penulis sehingga dapat melaksanakan penelitian dan menyelesaikan tesis dengan judul Pengaruh Suplementasi Insulin Trasferrin Selenium (ITS) pada Media Maturasi Terhadap Ekspresi Kalsium (Ca 2+ ) Intraseluler dan Persentase Maturasi Oosit. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada : Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Prof. Dr. Pudji Srianto, drh., M.Kes. atas kesempatan yang diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini. Dr. Hardijanto, drh., M.S. selaku pembimbing pertama dan Prof. Wurlina, drh., M.S. selaku pembimbing kedua serta Ketua Program S2-Studi Ilmu Biologi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga yang telah banyak menyempatkan waktu untuk membimbing, bertukar pikiran, dan saran yang bermanfaat dalam proses penyelesaian tesis ini. Prof. Dr. Imam Mutofa, drh., M.Kes selaku ketua penguji, Dr. Widjiati, drh., M.Si. selaku sekretaris penguji sekaligus pembimbing penelitian, dan Dr. Suherni Susilowati, drh., M.Kes selaku anggota penguji yang telah banyak membantu dalam rangkaian proses penyelesaian tesis ini. Seluruh Staf Pengajar S2-Ilmu Biologi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Universittas Airlangga atas wawasan keilmuan yang diberikan selama menimbah ilmu pada pendidikan Magister. Ayahanda Sugiman, SE., Ibunda Umi Yuriati, Adek Agus Tsani Maulana yang telah memberikan doa dan dukungan selama ini. Rekan Penelitian dan sekaligus sahabat Galuh Chandra Agustina, drh., M.Si., Reza Mahendra Yudha Permana, drh. M.Si., dan Rina Puji Astuti, drh. yang selalu memberikan semangat dan tempat bertukar pikiran serta keluh kesah selama penyelesaian tesis. Didi Yudha Prawira yang telah banyak membantu ix

10 selama pelaksanaan penelitian, serta Agung Budianto Achmad, drh., M.Si. yang telah membantu selama penyelesaian tesis ini. Keluarga angkatan 2013 S2-Ilmu Biologi Reproduksi, Yhogga Pratama Dinata, drh., Dikky Eka Mandala Putranto, drh., M.Si., Yanita Mutiaraning Viastika, drh., Novarina Sulsia I., drh, Ayu Ira Marita, drh., dan Anna Ismawati, drh. atas kebersamaannya selama ini. Andri Purbianto, dr. yang telah memberikan banyak masukan, doa, motivasi dan mendengarkan keluh kesah selama penyelesaian tesis ini, sahabat Mia Zakia R., drh., M.Si., Ria Wahyu, drh., Rieska Nursita, drh., Anita Rahmawati, drh., Tri Wahyu H., drh., Putri Dwi K., drh., Alfiana Laili drh., Indrawan Arif Rahman, serta Ustadz M. Husni Mubarok Al Hafidz yang telah banyak memberikan dorongan, motivasi, serta doa selama penyelesaian tesis ini. Serta pihak-pihak lain yang sangat membantu dalam penyelesaian tesis ini yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu. Surabaya, 14 Desember 2015 Penulis x

11 RINGKASAN Pengaruh Suplementasi Insulin Transferrin Selenium (ITS) Pada Media Maturasi TCM-199 Terhadap Ekspresi kalsium (Ca2+) Intraseluler dan Persentase Maturasi Oosit Perkembangan bioteknologi reproduksi ternak banyak memberikan manfaat bagi kehidupan manusia khususnya dalam dunia peternakan diantaranya inseminasi buatan (IB) dan transfer embrio (TE). Untuk keperluan transfer embrio dibutuhkan embrio dalam jumlah banyak dengan aplikasi in vitro fertilization (IVF) meliputi in vitro maturation (IVM) dan in vitro culture (IVC). Kualitas embrio yang diperoleh dari maturasi oosit yang belum matur dilakukan secara IVM, IVF, dan IVC tidak lebih tinggi dari % dengan menggunakan teknik dasar. Maturasi oosit dilakukan dalam inkubator steril pada suhu 38,5 0 C dengan CO2 5% dan kelembaban 95% sehingga dapat meningkatkan produksi reactive oxygen species (ROS). Pematangan oosit dengan aplikasi IVM dipengaruhi oleh suplementasi yang digunakan, kualitas oosit, resiko kontaminasi, dan media kultur. Suplementasi Insulin Transferin Selenium (ITS) dalam medium pematangan oosit dapat meningkatkan jumlah oosit matang. Maturasi oosit turut dipengaruhi oleh peran kalsium intraseluler. Aktivitas kalsium intraseluler yang tinggi merupakan salah satu penanda oosit berada pada Metafase II (MII) atau oosit telah matang dan siap untuk fertilisasi. Penelitian ini bertujuan mengetahui peran Insulin Transferrin Selenium (ITS) terhadap proses peningkatan maturasi oosit in vitro dengan adanya peningkatan ekspresi kalsium intraseluler dan persentase maturasi oosit dengan pewarnaan imunositokimia dengan metode streptavidin biotin complex dan pewarnaan acto arcein. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium In Vitro dan Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga pada bulan Juli hingga Oktober Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Pengambilan sampel dilakukan dengan cara aspirasi ovarium sapi yang diperoleh dari Rumah Potong Hewan. Folikel yang diaspirasi berukuran 2-6 mm menggunukan spuit sekali pakai denga jarum 18G. Oosit hasil aspirasi kemudian dicuci dengan PBS tiga kali dan medium maturasi dua kali. Proses maturasi oosit menggunakan medium TCM-199 yang ditambahkan FSH 100 IU/ml, LH 100 IU/ml, BSA 3% dan ITS (Insulin Transferrin Selenium). ITS yang digunakan untuk suplementasi dalam media kultur berbeda tiap perlakuan yaitu 0 µg/ml (P0), 10 µg/ml (P1), 15 µg/ml (P2), dan 20 µg/ml (P3). Setiap petridish berisi empat drop media maturasi 50 µg/ml yang telah dilapisi mineral oil kemudian diinkubasi pada inkubator CO2 5%, kelembapan 95%, suhu 38,5 o C selama 22 jam. Kemudian dilakukan evaluasi untuk identifikasi ekspresi kalsium intraseluler dengan pewarnaan Imunositokimia metode streptavidin biotin complex serta perhitungan persentase maturasi oosit dengan pewarnaan aceto orcein. xi

12 Hasil penelitian suplementasi ITS untuk ekspresi kalsium intraseluler P0 (0 µg/ml) menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml), dan P3 (20 µg/ml). Ekspresi kalsium intraseluler menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata yaitu pada P1 (10 µg/ml) dan P2 (15 µg/ml) (p>0,05) sedangkan persentase maturasi oosit pada P0 (0 µg/ml) menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) pada masing-masing perlakuan P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml), dan P3 (20 µg/ml). Kesimpulan dari suplementasi ITS pada medium maturasi TCM-199 dapat meningkatkan ekspresi kalsium intraseluler dan persentase maturasi oosit sapi secara in vitro. xii

13 SUMMARY Effect of Insulin Transferrin Selenium (ITS) Supplementation in Maturation Medium TCM -199 to Intracelular calcium Expression and Percentage of Maturity Bovine Oocyte Developmental of animal reproduction biotechnology provides benefits for human life, especially livestock world such as artificial insemination and embrio transfer. Embrio transfer requires a lot of embryos using in vitro culture (IVC) consist in vitro maturation (IVM) and in vitro culture (IVC). An embryos quality from maturing oocyte which immature carried on IVM, IVF and IVC not higher than 30-40% used basic technique. Oocyte maturation was done in sterile incubator at 38,5 o C with CO2 5% and humidity 95% so it could increase the Reactive Oxygen Species (ROS) production. IVM methods for oocyte maturation are affected by supplementation usage, oocyte quality, contaminated risk, and culture medium. Insulin Transferrin Selenium (ITS) supplementation in maturation medium can increase the number of mature oocytes. Oocyte maturation also influenced of intracelular calcium. High intracelular calcium Activity is one of the sign that oocyte in Metaphase II (MII) or oocyte have matured and ready for fertilization. This study was to determine role of Insulin Transferrin Selenium to bovine oocyte were matured in vitro against improved intracelular calcium expresion and percentage of oocyte diameter and maturity bovine oocyte by immunocytochemistry using strepravidin biotin complex method and aceto orcein staining. This study was conducted in Laboratorium In Vitro and Laboratorium Patologi Veteriner Faculty of Veterinary Medicine Airlangga University on July to October The study design used Completely Randomized Design (CRD). Sampling was done by bovine ovarian follicle aspiration obtained from slaughterhouse. Aspirated follicles are 2-6 mm using disposable syringe with Needle 18G. Oocytes from aspirated follicles are washed by PBS three times and twice in maturation medium. Maturation process used TCM-199 medium which added by FSH 100 IU/ml, LH 100 IU/ml, BSA 3% and ITS (Insulin Transferrin Selenium). ITS dose which used in culture medium are different for each treated group. The treated groups are P0 (0 µg/ml), P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml), and P3 (20 µg/ml). Each petridish has four drops maturation medium 50 µg/ml coated by mineral oil then incubated in CO2 incubator with CO2 5%, Humidity 95% and 38.5 o C due 22 hours then evaluated using streptavidin biotin method immunocytochemistry staining for intracelular calsium expression identification and aceto orcein staining for calculating maturity bovine oocyte. Result of this study showed that ITS supplementation in maturation medium P0 (0 µg/ml) has significantly difference (p<0,05) compared P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml ) and P3 (20 µg/ml) of intracelular calcium expression but intracelular calcium expression of P1 (10 µg/ml) and P2 (15 µg/ml) has no xiii

14 significanly difference (p>0,05). In other way, ITS supplementation has significantly difference (p<0,05) for all and each treated groups P0 (0 µg/ml), P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml ), and P3 (20 µg/ml) of percentage of bovine oocyte. Conclusion of ITS supplementation in maturation medium TCM-199 can increase intracelular calcium expression and maturity bovine oocyte were matured in vitro. xiv

15 EFFECT OF INSULIN TRANSFERRIN SELENIUM (ITS) SUPPLEMENTATION IN MATURATION MEDIUM TCM -199 TO INTRACELULAR CALCIUM EXPRESSION AND PERCENTAGE OF MATURITY BOVINE OOCYTE Siti Eliana Rochmi ABSTRACT Insulin Transferrin Selenium (ITS) has been used in vitro maturation system to support in vitro maturation of oocyte. The study aims was to determine role of Insulin Transferrin Selenium to bovine oocyte were matured in vitro against intracelular calcium as maturation mediator by immunocytochemistry using strepravidin biotin complex method and percentage of maturity bovine oocyte by aceto orcein staining. Maturation process used TCM-199 medium which added by FSH 100 IU/ml, LH 100 IU/ml, BSA 3% and ITS (Insulin Transferrin Selenium). ITS dose which used in culture medium are different for each treated group. The treated groups are P0 (0 µg/ml), P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml), and P3 (20 µg/ml). Oocytes were incubated in CO2 incubator with CO2 5%, Humidity 95% and 38.5 o C due 22 hours. The result showed ITS supplementation in maturation medium P0 (0 µg/ml) has significantly difference (p<0,05) compared P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml ) and P3 (20 µg/ml) of intracelular calcium expression but intracelular calcium expression of P1 (10 µg/ml) and P2 (15 µg/ml) has no significanly difference (p>0,05). In other way, ITS supplementation has significantly difference (p<0,05) for all and each treated groups P0 (0 µg/ml), P1 (10 µg/ml), P2 (15 µg/ml ), and P3 (20 µg/ml) of percentage of bovine oocyte. Conclusion of ITS supplementation in maturation medium TCM-199 can increase intracelular calcium expression and maturity bovine oocyte were matured in vitro. Key Words: in vitro maturation, Insulin Transferrin Selenium, TCM-199, intracelular calcium, xv

16 DAFTAR ISI Halaman HALAMAN SAMPUL DALAM... PRASYARAT GELAR... PERNYATAAN... PERSETUJUAN... PENETAPAN PANITIA PENGUJI... UCAPAN TERIMA KASIH... RINGKASAN... SUMMARY... ABSTRACT... DAFTAR ISI... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG... ii iii iv v vi ix xi xiii xv xvi xviii xix xx BAB 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Tujuan Umum Penelitian Tujuan Khusus Penelitian Manfaat Penelitian Manfaat Teoritis Manfaat Praktis... 7 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA Ovarium Oogenesis Folikulogenesis Maturasi Oosit Maturasi Inti Oosit Maturasi Sitoplasma Oosit Mobilisasi Ca 2+ pada Maturasi Oosit Insulin Transferrin Selenium Antioksidan BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN xvi

17 3.1. Kerangka Konseptual Hipotesis Penelitian BAB 4 METODE PENELITIAN Rancangan Penelitian Populasi, Besar Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel Populasi Besar Sampel Teknik Pengambilan Sampel Variabel Penelitian Variabel Bebas (Independent variable) Variabel Tergantung (Dependent variable) Variabel Terkendali Bahan Penelitian Instrumen Penelitian Lokasi dan Waktu Penelitian Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data Maturasi Oosit Identifikasi Ekspresi Ca 2+ Intraseluler Dengan Metode Imunositokimia Perhitungan Persentase Oosit Mature (MII) Dengan Pewarnaan Aceto-Orcein Analisis Data Kerangka Operasional BAB 5 HASIL PENELITIAN Data Pengukuran Ekspresi Kalsium Intraseluler Data Perhitungan Persentase Maturasi Oosit BAB 6 PEMBAHASAN Ekspresi Kalsium Intraseluler Persentase Maturasi Oosit BAB 7 KESIMPULAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xvii

18 DAFTAR TABEL Tabel Halaman 3.1 Metode Perhitungan Immunositokimia Rerata ekspresi kalsium intraseluler yang Dimaturasi In Vitro dengan suplementasi ITS Mean dan standar deviasi Persentase Maturasi oosit Sapi secara in vitro dengan suplementasi ITS.. 40 xviii

19 DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman 2.1 Skema Ovarium Proses Oogenesis Morfologi oosit sapi immatur Klasifikasi oosit dengan pewarnaan aceto orcein Mobilisasi Ca 2+ kumulus dalam maturasi oosit Sistem Pertahanan Antioksidan Hasil Pewarnaan Imunositokimia Ekspresi Kalsium Intraseluler Gambaran Inti Oosit pada Oosit Matur dan Oosit Belum Matur dengan Pewarnaan Aceto Orcein pada Perbesaran 400x xix

20 SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG % = Persen ± = lebih kurang 0 C = Celcius 2n = diploid AI = anaphase I AC1 = adenil siklase isoform 1 AC3 = adenil siklase isoform III ANOVA = Analysis of Varian APC = Anafase-promoting complex AREG = Amphiregulin ART = Assisted Rreproductive Technologi ATP = Adenosin triphosphate BNJ = Beda Nyata Jujur BSA = Bovine Serum Albumin BTC = Betacellulin Ca 2+ = Calcium CaMKII = calmodulindependent protein kinase II camp = cyclic adenosine monophosphate cm = centimeter CO2 = Karbon dioksida COC = Cumulus Oocyte Complex Cu = Cupro CSF = Cytostatic factor DAB = 3,3-diaminbenzidine tetrahydrochloride DNA = Deoxyribonucleic Acid dkk = dan kawan-kawan EGF = Epidermal Growth Factor EREG = Epiregulin ERK = Extracelluler-regulated Kinase et al = et alia Fe = Ferum FSH = Folicle Stimulating Hormon G2 = Gap kedua GLUT-4 = Glucose Transporter Type 4 GSH = Glutathione GSSH = Glutathione reduktase GV = Germinal Vesicle GVBD = Germinal Vesicle Break Down H2O2 = Hydrogen peroxide HA = Hyaluronic Acid IB = Inseminasi Buatan IGF-I = Insuline like growth Factor-I IGF-II = Insuline like growth Factor-II IP3 = Inositol 1,4,5-triphosphate xx

21 ITS = Insulin Transferin Selenium IU = International Unit IVC = In Vitro Culture IVF = In Vitro fertilization IVM = In Vitro Maturation Kg = Kilogram L = Liter LH = Luteinizing Hormon M = Mitosis MAPK = Mitogen Activated Protein Kinase MAPKK = MAPK Kinases MAS = Meiosis Activated sterol MEK = Mitogen-activated ERK-activating Kinase mg = mili gram MII = Metaphase II ml = mili liter mm = mili meter Mn = Mangan MPF = Maturation Promoting Factor mrna = messenger-rna NaCl = Natrium Clorida O2 - = Superoxide anion radical OH - = Hydroxyl radical PI3K = Phosphatidylinositole 3-Kinase PB I = Polar Body I PBS = Phosphate Buffer Saline PEIV = Produksi Embrio In vitro ph = Derajat Keasaman PKA = Protein Kinase A RAL = Rangcangan Acak Lengkap ROS = Reactive Oxydative Species RPH =Rumah Potong Hewan Se = Selenium SERCA = Sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase SPSS = Statistical Package for Social Scientific TI = telophase I TCM-199 = Tissue Culture Medium 199 Zn = Zink ZP = Zona Pelusida β = Beta μg = mikro gram μl = mikro liter xxi