RENI KASMITA A

Transkripsi

1 ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PELARUT FOSFAT (BPF) DARI BEBERAPA SAMPEL TANAH DI BOGOR, NUSA TENGGARA BARAT (NTB), DAN NUSA TENGGARA TIMUR (NTT) RENI KASMITA A DEPARTEMEN ILMU TANAH DAN SUMBERDAYA LAHAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010

2 2 RINGKASAN RENI KASMITA. Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) dari Beberapa Sampel Tanah di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT). Di bawah bimbingan FAHRIZAL HAZRA dan ETTY PRATIWI. Fosfor (P) merupakan salah satu unsur hara makro yang sangat penting bagi pertumbuhan tanaman, namun kandungannya di dalam tanaman lebih rendah dibanding nitrogen (N), kalium (K), dan kalsium (Ca). Pemupukan fosfat sering tidak efisien karena fosfat terikat dalam bentuk yang tidak tersedia bagi tanaman. Untuk meningkatkan efisiensi pemupukan fosfat, saat ini mulai dikembangkan pemanfaatan mikroba pelarut fosfat, salah satunya adalah bakteri pelarut fosfat (BPF). Pemanfaatan BPF dinilai dapat dijadikan sebagai suatu alternatif yang sangat potensial untuk dikembangkan dalam mencari pemecahan masalah efektivitas ketersediaan unsur P di dalam tanah. Oleh karena itu, dilakukan penelitian ini yang bertujuan untuk melakukan isolasi, karakterisasi, dan identifikasi BPF dari beberapa lokasi di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT) yang memiliki kemampuan melarutkan P tertinggi serta mengetahui jenis bakteri tersebut melalui identifikasi molekuler berdasarkan amplifikasi gen 16S rrna. Sampel tanah yang digunakan sebagai sumber isolat BPF diperoleh dari areal Kebun Percobaan IPB Cikabayan (Bogor, Jawa Barat), Citeureup (Bogor, Jawa Barat), Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT). Kegiatan penelitian dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu isolasi BPF dalam medium Pikovskaya, karakterisasi dan pengujian BPF dalam melarutkan P, pengujian BPF dalam menghasilkan enzim fosfatase dan zat pemacu tumbuh indole acetic acid (IAA), serta pewarnaan Gram. Tiga isolat unggul terpilih, yaitu P 3.5 (NTT), P 6.2 (NTB), dan P 10.1 (Citeureup, Bogor). Selanjutnya terhadap ketiga isolat terpilih tersebut dilakukan beberapa pengukuran, yaitu pengukuran pertumbuhan populasi, perubahan ph pada medium Pikovskaya cair, pengujian BPF dalam menghasilkan enzim fosfatase, dan identifikasi molekuler. Berdasarkan hasil isolasi sampel tanah Kebun Percobaan IPB Cikabayan, Citeureup, NTB, dan NTT diperoleh 29 isolat BPF. Isolat P 10.1 memiliki kemampuan melarutkan P tertinggi dengan indeks pelarutan (IP) terbesar, yaitu 1.80, enzim fosfatase tertinggi ( ppm), dan penurunan ph tertinggi pada setiap pengamatan. Isolat P 3.5 dan isolat P 10.1 merupakan bakteri Gram negatif berbentuk kokus atau bulat, sedangkan isolat P 6.2 merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basilus atau batang. Hasil amplifikasi DNA BPF menggunakan primer F-63 (5 -CAGGCCTAACACATGCAAGTC) dan primer R-1387 (5 - GGGCGGCGTGTACAAGGC) menghasilkan satu amplikon atau produk PCR berukuran sekitar 1300 bp. Hasil analisis sekuen gen 16S rrna menunjukkan bahwa isolat P 3.5 dan isolat P 10.1 memiliki kemiripan sebesar 98% dengan Gluconacetobacter sp. strain Rh1-MS-CO sedangkan isolat P 6.2 memiliki kemiripan sebesar 97% dengan Enterobacter sp. strain pp9c. Kata kunci : isolasi, bakteri pelarut fosfat (BPF), enzim fosfatase, indole acetic acid (IAA), identifikasi 16S rrna

3 3 SUMMARY RENI KASMITA. Isolation, Characterization, and Molecular Identification of Phosphate Solubilizing Bacteria (PSB) from Some Soil Samples in Bogor, West Nusa Tenggara, and East Nusa Tenggara. Supervised by FAHRIZAL HAZRA and ETTY PRATIWI. Phosphorus (P) is one of the macro nutrients essential for plant growth, but its contents in the plants was lower than nitrogen (N), potassium (K), and calcium (Ca). Phosphate fertilization is often inefficient because the phosphate are fixed by soil so that is not available for plants. To transform the insoluble forms of phosphorus into soluble forms, phosphate solubilizing bacteria (PSB) would be essential. These soil bacteria are capable of solubilizing insoluble compounds and release phosphorus to soil solution. The objectives of this research are: (i) to isolate and characterize of PSB and (ii) to identify of these bacteria based on molecular amplification of 16S rrna gene. Soil samples were collected from rhizosphere in Bogor, West Nusa Tenggara, and East Nusa Tenggara. Several stages in this research are: (i) isolation PSB in Pikovskaya agar, (ii) morphological and biochemical characterization of PSB, (iii) measurement of phosphatase enzymes, and (iv) measurement of secreting indole acetic acid phytohormone. We have collected 29 isolates of PSB and three isolates of them, namely: P 3.5 (East Nusa Tenggara), P 6.2 (West Nusa Tenggara), and P 10.1 (Citeureup, West Java) were chosen for further study. There are many characteristics of isolate P 10.1: (i) it has capable to solubilize P with the value of highest solubilization index (1.80), (ii) it has the highest phosphatase enzyme ( ppm), and (iii) it has the highest ph decrease at each observation for six days. Isolates P 3.5 and P 10.1 are the Gram-negative bacteria with coccus shapes and isolate P 6.2 is a Gram-negative bacteria with bacillus shape. DNA amplification of these bacteria employing 16S rrna primers generated the 1300bp-PCR product. The results of the analysis of 16S rrna gene sequences showed that isolates P 3.5 and P 10.1 has 98% similarity with Gluconacetobacter sp. strains Rg1-MS-CO and isolate P 6.2 has 97% similarity with Enterobacter sp. pp9c strains. Keywords : isolation, phosphate solubilizing bacteria (PSB), phosphatase enzymes, indole acetic acid, identification 16S rrna

4 4 ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PELARUT FOSFAT (BPF) DARI BEBERAPA SAMPEL TANAH DI BOGOR, NUSA TENGGARA BARAT (NTB), DAN NUSA TENGGARA TIMUR (NTT) RENI KASMITA A Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor DEPARTEMEN ILMU TANAH DAN SUMBERDAYA LAHAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010

5 5 Judul Skripsi Nama NIM : Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) dari Beberapa Sampel Tanah di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT) : Reni Kasmita : A Menyetujui Pembimbing I, Pembimbing II, (Ir. Fahrizal Hazra, M.Sc) (Dr. Ir. Etty Pratiwi, M.Si) NIP NIP Mengetahui : Ketua Departemen (Dr. Ir. Syaiful Anwar, M.Sc) NIP Tanggal Lulus :

6 6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 21 September Penulis merupakan anak keempat dari lima bersaudara pasangan Bapak Zubir Siak dan Ibu Yusmarni. Penulis mengawali pendidikan di SD Negeri Cakung Barat 013 Pagi, Jakarta Timur pada tahun Pada tahun 2000, penulis melanjutkan pendidikan di SMP Negeri 144 Jakarta Timur. Pendidikan sekolah menengah atas ditempuh penulis di SMA Negeri 89 Jakarta Timur pada tahun Pada tahun 2005, penulis diterima sebagai mahasiswa Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Pada tahun 2006, melalui program Mayor-Minor penulis diterima di Mayor Manajemen Sumberdaya Lahan, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa di Institut Pertanian Bogor, penulis aktif dalam organisasi, yaitu Himpunan Mahasiswa Ilmu Tanah (HMIT) pada tahun 2007 sampai Penulis juga aktif mengikuti seminar dan menjadi panitia berbagai kegiatan diantaranya, yaitu Seminar Nasional Evaluasi Sewindu Reformasi, Pelatihan Program Kreativitas Mahasiswa (PPKM), Workshop Penulisan Karya Tulis Ilmiah, panitia Masa Perkenalan Departemen (MPD) Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan pada tahun 2007, panitia Masa Perkenalan Fakultas (MPF) Pertanian pada tahun 2007, panitia Seminar Nasional Soil and Mining pada tahun 2008, dan panitia kegiatan bakti lingkungan Water Concervation Campaign dalam rangka memperingati Hari Air Sedunia. Selama menjadi mahasiswa penulis mendapatkan beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa (BBM). Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Bioteknologi Tanah pada tahun 2008.

7 i KATA PENGANTAR Puji syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT atas rahmat dan hidayahnya sehingga penulisan skripsi dengan judul Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) dari Beberapa Sampel Tanah di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT) ini bisa diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian di Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Selesainya penelitian ini tentunya tidak terlepas dari bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada : 1. Ir. Fahrizal Hazra, M.Sc dan Dr. Ir. Etty Pratiwi, M.Si selaku dosen pembimbing skripsi yang telah membimbing dengan penuh kesabaran dan ketulusan, sehingga penulis berhasil menyelesaikan penelitian dan skripsi ini dengan baik. 2. Dr. Ir. Dwi Andreas Santosa, M.Sc selaku dosen penguji yang telah bersedia meluangkan waktu dan memberi banyak masukkan bagi penulis. 3. Papa dan Mama tercinta, Bang Indra dan Mba Diyah, Bang Andre dan Mba Fany, Kak Ita, adikku Ibnu, dan keponakanku Queenza serta seluruh keluarga besar yang telah memberikan kasih sayang, perhatian, dukungan, semangat, dan telah mengajarkan arti hidup yang sebenarnya sehingga penulis bisa menjalani hidup dengan lebih baik. A Eko untuk perhatian, dukungan, semangat, serta kesabarannya hingga penelitian dan skripsi ini selesai. 4. Dr. Ir. Komaruddin Idris, MS selaku dosen pembimbing akademik yang telah memberikan bimbingan kepada penulis selama masa perkuliahan. 5. Seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB.Biogen) : Ibu Susi, Ibu Selly, Ibu Titi, Ibu Aminah, Pak Jajang, Pak Eep, Ibu Yuli, dan Mas Alam yang telah memberikan bantuan dalam pelaksanaan penelitian ini. 6. Seluruh staf Laboratorium Bioteknologi Tanah dan staf Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan : Ibu Asih, Ibu Julaeha, Pak Sarjito, Mba

8 ii Hesti, Mba Iko, Ibu Tini atas dukungan dan bantuannya. Semua temanteman Laboratorium Bioteknologi Tanah dan teman-teman MSL khususnya MSL 42 : Dena, Ali, dan lainnya terima kasih atas dukungan dan kebersamaannya selama ini. 7. Sahabat-sahabatku : Shanty, Linda, Rizma, dan Nana. Kalian semua telah menorehkan warna indah dalam hidupku. Teman seperjuangan penelitian dan satu pembimbing : Xenia, Andri, dan Adi. Semoga kebersamaan ini tidak hanya sampai disini dan bisa berlanjut sampai kapan pun. Temanteman kostan Mega : Mba Ririn, Mba Mona, Mba Tuti, Mba Vivin, Eno, Mpit, Mila, Esti, dan Della yang telah memberikan bantuan, dukungan, semangat, dan perhatiannya selama ini. Serta semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu yang telah membantu dalam pelaksanaan penelitian ini. Akhir kata, penulis sangat menyadari bahwa tulisan ini sangat jauh dari sempurna. Namun demikian, penulis berharap tulisan ini akan bermanfaat dan dapat dijadikan sebagai salah satu kajian awal yang dapat menginspirasi penelitian-penelitian berikutnya yang lebih baik. Terima kasih. Bogor, Februari 2010 Penulis

9 iii DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR... i DAFTAR TABEL... v DAFTAR GAMBAR... vi DAFTAR LAMPIRAN... vii I. PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan... 2 II. TINJAUAN PUSTAKA Senyawa P di Dalam Tanah P-Organik P-Anorganik Peranan P Dalam Tanaman Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) Deoxyribonucleic Acid (DNA) Identifikasi Molekuler melalui Amplifikasi Gen 16S rrna Elektroforesis Gel Agarosa Polymerase Chain Reaction (PCR) III. BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Bahan dan Alat Metode Penelitian Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah di sekitar Perakaran (Rizosfer) Karakterisasi dan Pengujian Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Zat Pemacu Tumbuh Indole Acetic Acid (IAA) Pengujian Pewarnaan Gram Bakteri Pelarut Fosfat Pengukuran Pertumbuhan Populasi, ph, dan Kandungan Enzim Fosfatase Bakteri Pelarut Fosfat Identifikasi Molekuler IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat Karakteristik dan Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P... 22

10 iv Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase dan Zat Pengatur Tumbuh Indole Acetic Acid (IAA) serta Karakterisasi Pewarnaan Gram Pertumbuhan Populasi, ph, dan Kandungan Enzim Fosfatase Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat Isolasi DNA Elektroforesis Gel Agarosa Amplifikasi Gen 16S rrna Sekuensing DNA Bakteri Pelarut Fosfat V. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran VI. DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 45

11 v DAFTAR TABEL Nomor Teks Halaman 1. Karakteristik Morfologi Koloni dan Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P pada Medium Pikovskaya Padat Selama 7 Hari Inkubasi Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase dan Indole Acetic Acid (IAA) Selama 3 Hari Inkubasi serta Pewarnaan Gramnya Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih Berdasarkan Kandungan Enzim Fosfatase dan IAA Tertinggi pada Masing-masing Daerah Asal Sampel Tanah Beberapa Ciri Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif Jumlah Populasi Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih pada Medium Pikovskaya Padat dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 Sebagai Sumber P Beberapa Ciri Pertumbuhan Bakteri pada Setiap Fase Pertumbuhan Nilai ph Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih pada Medium Pikovskaya Cair dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 Sebagai Sumber P Kandungan Enzim Fosfatase (ppm) Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih pada Medium Pikovskaya Cair dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 Sebagai Sumber P Lampiran 1. Daftar Sampel Tanah Rizosfer Sumber Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Komponen Reaksi Untuk Proses PCR Hasil Pengukuran Kurva Standar p-nitrophenol (kandungan enzim fosfatase) Hasil Pengukuran Kurva Standar Indole Acetic Acid (IAA)... 53

12 vi DAFTAR GAMBAR Nomor Teks Halaman 1. Siklus fosfor di alam Siklus PCR Hasil isolasi bakteri pelarut fosfat dari rizosfer Pemurnian bakteri pelarut fosfat pada medium Pikovskaya padat Hasil pewarnaan Gram dari sel bakteri pelarut fosfat; (a) isolat P 3.5, (b) isolat P 6.2, dan (c) isolat P 10.1 yang dilihat dibawah mikroskop (perbesaran 100 x 10) Pertumbuhan populasi bakteri pelarut fosfat terpilih pada medium Pikovskaya padat dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 sebagai sumber P Perubahan nilai ph isolat bakteri pelarut fosfat terpilih pada medium Pikovskaya cair dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 sebagai sumber P Kandungan enzim fosfatase bakteri pelarut fosfat terpilih pada medium Pikovskaya cair dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 sebagai sumber P DNA yang telah dililit di ujung tip mikro Hasil elektroforesis DNA genom bakteri pelarut fosfat Hasil amplifikasi gen 16S rrna bakteri pelarut fosfat Lampiran 1. Kurva standar p-nitrophenol Kurva standar Indole Acetic Acid (IAA) Metode penelitian; (a) larutan standar IAA, (b) larutan standar p-nitrophenol, (c) perubahan warna pada medium Pikovskaya setelah diinokulasikan bakteri pelarut fosfat, (d) pengukuran enzim fosfatase dan IAA menggunakan Spectrophotometer, (e) inokulasi bakteri pelarut fosfat pada medium Pikovskaya padat dengan cara disebar Peralatan penelitian; (a) perangkat elektroforesis (Mupid-2plus), (b) perangkat PCR (Swift TM Maxi Thermal Cycler Blocks- ESCO ), (c) Scope UV Transilluminator (Dekstop Gel Imager-SCOPE 21), (d) mikroskop (Olympus)... 55

13 vii DAFTAR LAMPIRAN Nomor Halaman 1. Komposisi medium pertumbuhan bakteri pelarut fosfat Komposisi bufer untuk pengukuran kandungan enzim fosfatase Komposisi dan cara pembuatan bahan untuk identifikasi molekuler... 48

14 I. PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Fosfor (P) merupakan salah satu unsur hara makro yang sangat penting bagi pertumbuhan tanaman, namun kandungannya di dalam tanaman lebih rendah dibanding nitrogen (N), kalium (K), dan kalsium (Ca). Tanaman menyerap P dari - tanah dalam bentuk ion fosfat, terutama dalam bentuk H 2 PO 4 dan HPO 2-4 yang - terdapat dalam larutan tanah. Ion H 2 PO 4 lebih banyak dijumpai pada tanah yang 2- lebih masam, sedangkan pada ph alkali bentuk HPO 4 lebih dominan. Disamping ion-ion tersebut, tanaman dapat menyerap P dalam bentuk asam nukleat, fitin, dan fosfohumat (Havlin et al., 1999). Pemupukan fosfat sering tidak efisien karena fosfat terikat dalam bentuk yang tidak tersedia bagi tanaman. Masalah utama dalam pemupukan fosfat pada lahan pertanian adalah efisiensinya yang rendah, karena hanya 10-30% saja yang dapat dimanfaatkan oleh tanaman. Hal ini terjadi karena adanya proses pengikatan atau fiksasi P yang cukup tinggi oleh tanah terhadap pupuk yang diberikan. Pada tanah yang bersifat basa (ph tinggi), fiksasi P dilakukan oleh kalsium (Ca) dan terbentuk ikatan Ca-P yang bersifat sukar larut, sehingga bentuk P ini sukar atau bahkan tidak tersedia bagi tanaman. Pada tanah yang bersifat masam (ph rendah), fiksasi P dilakukan oleh besi (Fe) atau aluminium (Al) dan terbentuk ikatan Fe-P atau Al-P yang juga sukar larut dan tidak tersedia bagi tanaman (Anonim, 2008). Untuk meningkatkan efisiensi pemupukan fosfat, saat ini mulai dikembangkan pemanfaatan mikroba pelarut fosfat sebagai pupuk hayati, salah satunya adalah bakteri pelarut fosfat (BPF). Penggunaan mikroba pelarut fosfat sebagai pupuk hayati memiliki keunggulan antara lain hemat energi, tidak mencemari lingkungan, mampu membantu meningkatkan kelarutan P yang terjerap, menghalangi terjerapnya P oleh unsur-unsur penjerap, dan mengurangi toksisitas Al 3+, Fe 3+, dan Mn 2+ terhadap tanaman pada tanah masam (Elfiati, 2005). Pemanfaatan BPF dinilai dapat dijadikan sebagai suatu alternatif yang sangat potensial untuk dikembangkan dalam mencari pemecahan masalah efektivitas ketersediaan unsur P di dalam tanah.

15 2 Menurut Subba-Rao (1982) di dalam tanah banyak bakteri yang memiliki kemampuan melepas P dari ikatan Fe, Al, Ca, dan Mg sehingga P yang tidak tersedia menjadi tersedia bagi tanaman. Beberapa bakteri yang memiliki kemampuan melarutkan P antara lain Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter, Micrococcus, Streptomyces, dan Flavobacterium. Beberapa mekanisme pelarutan P pada BPF antara lain melalui kemampuan menghasilkan enzim fosfatase, fitase, dan asam organik hasil metabolisme seperti asam asetat, propionat, glikolat, fumarat, oksalat, suksinat, tartarat, sitrat, laktat, dan ketoglutarat. Sekresi asamasam organik tersebut dapat membentuk kompleks stabil dengan kation-kation pengikat P di dalam tanah yang pada akhirnya akan menurunkan ph dan memecahkan ikatan pada beberapa bentuk senyawa fosfat sehingga akan meningkatkan ketersediaan fosfat dalam larutan tanah (Subba-Rao, 1982) Tujuan Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan isolasi, karakterisasi, dan identifikasi BPF dari beberapa lokasi di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT) yang memiliki kemampuan melarutkan P tertinggi serta mengetahui jenis bakteri tersebut melalui identifikasi molekuler berdasarkan amplifikasi gen 16S rrna.

16 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Senyawa P di Dalam Tanah Tanah-tanah di wilayah tropika yang bereaksi asam ditandai kahat hara fosfat. Sebagian besar bentuk fosfat diikat oleh koloid tanah sehingga tidak tersedia bagi tanaman. Pada kebanyakan tanah tropika diperkirakan hanya 25 % fosfat yang diberikan dalam bentuk superfosfat yang diserap tanaman dan sebagian besar atau 75 % diikat tanah (Sutanto, 2008). Fosfor (P) di dalam tanah dapat dibedakan menjadi dua bentuk, yaitu P- organik dan P-anorganik. Kandungannya sangat bervariasi tergantung pada jenis tanah, tetapi pada umumnya rendah. P-organik berasal dari hewan dan tumbuhan yang mati diuraikan oleh dekomposer atau pengurai menjadi P-anorganik. Sedangkan P-anorganik yang terlarut di air tanah atau air laut akan terkikis dan mengendap di sedimen laut. Oleh karena itu, fosfat banyak terdapat di batu karang dan fosil. Fosfat dari batu dan fosil terkikis dan membentuk P-anorganik terlarut di air tanah dan laut. P-anorganik ini kemudian akan diserap kembali oleh akar tumbuhan, dan siklus ini berulang terus menerus (Anonim, 2000). Siklus P dapat dilihat pada Gambar 1. Tanaman Hewan Melalui mikoriza Penyerapan oleh akar Materi organik mati (Fosfat Organik) Mineralisasi Ortofosfat Immobilisasi Mikroorganisme pelarut P Fosfor anorganik yang tidak tersedia Gambar 1. Siklus fosfor di alam (Subba-Rao, 1994)

17 P-organik Bentuk-bentuk P-organik berasal dari sisa tanaman, hewan, dan jasad renik. P-organik terdapat sebagai senyawa ester dari asam ortofosfat, yaitu inositol fosfolipida, asam nukleat, nukleotida, dan gula fosfat. Inositol, fosfolipida, dan asam nukleat terdapat paling banyak di dalam tanah (Tisdale et al., 1985). Ketersediaan P-organik bagi tanaman sangat bergantung pada aktivitas mikroba untuk memineralisasikannya. Namun seringkali hasil mineralisasi ini segera bersenyawa dengan bagian-bagian anorganik untuk membentuk senyawa yang relatif sukar larut. Enzim fosfatase berperan utama dalam melepaskan P dari ikatan P-organik. Enzim ini banyak dihasilkan oleh mikroba tanah, terutama yang bersifat heterotrof. Aktivitas fosfatase dalam tanah meningkat dengan meningkatnya C-organik, tetapi juga dipengaruhi oleh ph, kelembaban, temperatur, dan faktor lainnya. Dalam kebanyakan tanah, total P-organik sangat berkorelasi dengan C-organik tanah, sehingga mineralisasi P meningkat dengan meningkatnya total C-organik. Semakin tinggi C-organik dan semakin rendah P- organik, maka semakin meningkat immobilisasi P. P-anorganik dapat diimmobilisasi menjadi P-organik oleh mikroba dengan jumlah yang bervariasi antara % (Havlin et al., 1999). Asam organik yang dihasilkan bakteri pelarut fosfat mampu meningkatkan ketersediaan P di dalam tanah melalui beberapa mekanisme, diantaranya adalah (a) anion organik bersaing dengan ortofosfat pada permukaan tapak jerapan koloid yang bermuatan positif; (b) pelepasan ortofosfat dari ikatan logam P melalui pembentukan komplek logam organik; (c) modifikasi muatan tapak jerapan oleh ligan organik (Havlin et al., 1999) P-anorganik Menurut Soepardi (1983) ketersediaan P-anorganik sangat ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu (i) ph tanah; (ii) besi, aluminium, dan mangan larut; (iii) adanya mineral yang mengandung besi, aluminium, dan mangan; (iv) tersedianya kalsium; (v) jumlah dan tingkat dekomposisi bahan organik; dan (vi) kegiatan

18 5 jasad mikro. Empat faktor pertama berhubungan satu sama lain, karena semuanya bergantung dari kemasaman tanah. P-anorganik dalam bentuk padat biasanya dibagi menjadi tiga bagian aktif dan dua bagian yang nisbi tak aktif. Bagian yang aktif dapat dikelompokkan ke dalam fosfat terikat kalsium (Ca-P), fosfat terikat aluminium (Al-P), dan fosfat terikat besi (Fe-P). Bagian yang nisbi tak aktif adalah yang terdapat dalam bentuk terserap dan dalam bentuk larut dalam pereduksi (Sanchez, 1992). P-anorganik di dalam tanah pada umumnya berasal dari mineral flour apatit {Ca 10 (PO 4 ) 6 F 2 }. Dalam proses hancuran iklim dihasilkan berbagai mineral P sekunder seperti hidroksi apatit, karbonat apatit, klor apatit, dan lain-lain sesuai dengan lingkungannya. Selain itu, ion-ion fosfat dengan mudah dapat bereaksi dengan ion Fe 3+, Al 3+, Mn 2+, Ca 2+, ataupun terjerap pada permukaan oksida-oksida hidrat besi, aluminium, dan liat (Premono, 1994). Pada tanah masam, kelarutan Al dan Fe menjadi tinggi. Dengan demikian, ion fosfat (H 2 PO - 4, HPO 2-4, PO 3-4 ) akan segera terikat membentuk senyawa P yang kurang tersedia bagi tanaman. Bila ph tanah dinaikkan, maka P akan berubah menjadi tersedia kembali. Pada ph di atas netral, P juga kurang tersedia bagi tanaman karena diikat oleh Ca menjadi senyawa yang kurang tersedia. Unsur tersebut akan tersedia kembali bila ph diturunkan. Jadi ketersediaan P sangat dipengaruhi oleh ph tanah (Havlin et al., 1999) Peranan P Dalam Tanaman Fosfor (P) yang diserap tanaman tidak direduksi, melainkan berada di dalam senyawa-senyawa organik dan anorganik dalam bentuk teroksidasi. P- anorganik banyak terdapat di dalam cairan sel sebagai komponen sistem penyangga tanaman. Dalam bentuk organik, P terdapat sebagai : (i) fosfolipida, yang merupakan komponen membran sitoplasma dan kloroplas; (ii) fitin, yang merupakan simpanan fosfat dalam biji; (iii) gula fosfat, yang merupakan senyawa antara dalam berbagai proses metabolisme tanaman; (iv) nukleoprotein, komponen utama DNA dan RNA inti sel; (v) ATP, ADP, AMP dan senyawa sejenis, sebagai senyawa berenergi tinggi untuk metabolisme; (vi) NAD dan NADP, keduanya adalah koenzim penting dalam proses reduksi dan oksidasi; (vii)

19 6 FAD dan berbagai senyawa lain, yang berfungsi sebagai pelengkap enzim tanaman (Salisbury dan Ross, 1995). Soepardi (1983) mengemukakan peranan P antara lain penting untuk pertumbuhan sel, pembentukan akar halus dan rambut akar, memperkuat jerami agar tanaman tidak mudah rebah, memperbaiki kualitas tanaman, pembentukan bunga, buah, dan biji serta memperkuat daya tahan terhadap penyakit. Kekurangan P pada tanaman akan mengakibatkan berbagai hambatan metabolisme, diantaranya dalam proses sintesis protein, yang menyebabkan terjadinya akumulasi karbohidrat dan ikatan-ikatan nitrogen. Gejala kekurangan P dapat diamati secara visual, yaitu daun-daun yang tua akan berwarna keunguan atau kemerahan karena terbentuknya pigmen antisianin. Pigmen ini terbentuk karena akumulasi gula di dalam daun sebagai akibat terhambatnya sintesis protein. Gejala lain adalah nekrosis atau kematian jaringan pada pinggir atau helai dan tangkai daun, diikuti melemahnya batang dan akar tanaman Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) Bakteri pelarut fosfat (BPF) merupakan kelompok bakteri tanah yang memiliki kemampuan melarutkan P yang terfiksasi dalam tanah dan mengubahnya menjadi bentuk yang tersedia sehingga dapat diserap tanaman. Beberapa bakteri yang dapat melarutkan fosfat diantaranya Pseudomonas sp., Bacillus sp., Escherichia sp., dan Actinomycetes sp. (Anonim, 2009). Genus Pseudomonas sp. dan Bacillus sp. memiliki kemampuan yang paling besar dalam melarutkan fosfat tak larut menjadi bentuk larut dalam tanah. Pelarutan ini disebabkan oleh adanya sekresi asam organik bakteri tersebut seperti asam formiat, asetat, propionat, laktat, glikolat, glioksilat, fumarat, tartarat, ketobutirat, suksinat, dan sitrat (Subba-Rao, 1982). Mekanisme pelarutan fosfat dari bahan yang sukar larut banyak dikaitkan dengan aktivitas mikroba yang memiliki kemampuan menghasilkan enzim fosfatase, fitase, dan asam organik hasil metabolisme. Tetapi pelarutan P dapat pula dilakukan oleh mikroba yang tidak menghasilkan asam organik, yaitu melalui (i) mekanisme pelepasan proton (ion H + ) pada proses respirasi; (ii) asimilasi amonium (NH 4+ ); dan (iii) adanya kompetisi antara anion organik dengan

20 7 ortofosfat pada permukaan koloid (Illmer dan Schinner, 1995). Menurut Narsian dan Patel (2000) pelarutan P oleh mikroba pelarut fosfat selain terjadi karena proses kelasi dan reaksi pertukaran, juga disebabkan oleh menurunnya ph rizosfer akibat adanya asam organik. Meningkatnya asam-asam organik biasanya diikuti dengan penurunan ph, sehingga mengakibatkan terjadinya pelarutan P yang diikat oleh Ca. Penurunan ph juga dapat disebabkan terbebasnya asam sulfat dan nitrat pada oksidasi kemoautotrofik sulfur dan amonium, berturut-turut oleh bakteri Thiobacillus dan Nitrosomonas (Alexander, 1978). Reaksi pelarutan P oleh penurunan ph dan terdapatnya gugus karboksilat, secara sederhana dapat digambarkan sebagai berikut : Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) H + 10Ca H 2 O + 6H 2 PO 4 OH OH M OH + R COO - M OH - + H 2 PO 4 - H 2 PO 4 OC R M = Al 3+ atau Fe 3+ Selain enzim fosfatase yang dihasilkan oleh BPF yang dapat menghasilkan fosfat bebas, ada pula enzim lain, yaitu fitase, firofosfatase, dan metafosfatase (Anonim, 2009). Reaksi pelarutan oleh berbagai enzim pelarut P dapat ditulis sebagai berikut : Ester fosfat + H 2 O Heksafosfat inositol + 6 H 2 O Firofosfat + H 2 O Metafosfat fosfatase fitase firofosfatase metafosfatase ROH + fosfat (tersedia) Inositol + 6 fosfat (tersedia) 2 Ortofosfat (tersedia) Ortofosfat (tersedia)

21 Deoxyribonucleic Acid (DNA) Asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid atau DNA) adalah substansi kimiawi yang berperanan dalam penerusan informasi yang turuntemurun. Di dalam struktur DNA terkodekan (tersandikan) informasi bagi sintesis semua protein sel. DNA adalah sebuah molekul yang panjang menyerupai tali, biasanya terdiri dari dua utas, saling membelit membentuk heliks ganda. Setiap utas heliks DNA terdiri dari nukleotida-nukleotida yang tergabung membentuk rantai polinukleotida (Pelczar, 1986). Menurut Lehninger (1994) DNA merupakan molekul yang amat panjang, terdiri dari ribuan deoksiribonukleotida yang bergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas bagi tiap organisme. Molekul ini adalah material kromosom yang membawa informasi genetik sel hidup dan umumnya berbentuk untai ganda (double helix). Baik RNA maupun DNA tersusun atas komponen-komponen nukleotida yang terdiri dari gula (pentosa), basa nitrogen, dan asam fosfat. Basa nitrogen pada nukleotida bergabung secara kovalen dalam ikatan N-glikosil dengan atom karbon 1 pada pentosa sementara residu asam fosfat berikatan ester dengan atom karbon 5. Basa nitrogen merupakan turunan dari senyawa heterosiklik purin dan pirimidin. DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies organisme, untuk membuat program pada saat yang tepat dan menempatkan biosintesis sel dan komponen jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu (Lehninger, 1994) Identifikasi Molekuler melalui Amplifikasi Gen 16S rrna Pendekatan analisis pada tingkat molekuler (genomik) dapat diaplikasikan pada spesies yang belum dapat dikulturkan di laboratorium. Berbagai metode dapat dilakukan untuk menganalisis DNA, diantaranya AFLP, ARDRA, PFGE, dan lain-lain. Namun dari berbagai metode yang digunakan, rrna paling banyak digunakan sebagai marka molekuler. Pada prokariot terdapat tiga macam ribosomal RNA (rrna), yaitu 5S rrna, 16S rrna, dan 23S rrna. Molekul 5S

22 9 rrna tersusun dari 120 basa. Urutan basa molekul tersebut sangat pendek, sehingga molekul 5S rrna tidak ideal dari segi analisis statistika. Molekul 23S rrna tersusun dari 2900 basa. Molekul ini menyulitkan analisis karena memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang. Prosedur yang telah baku yang sudah digunakan untuk menentukan hubungan filogenetik dan mendefinisikan spesies adalah melalui amplifikasi gen 16S rrna (Jusuf, 2001). Molekul 16S rrna memiliki beberapa daerah yang relatif konservatif dan daerah yang variatif. Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif lambat dan mencerminkan kronologi ekologi bumi. Sebaliknya urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies (Pangastuti, 2006). Gen 16S rrna merupakan komponen penting dalam sel dan sangat menguntungkan di dalam analisis filogenetik, karena terdiri atas daerah yang konservatif yang mutasinya terbatas (Madigan et al., 1997). Komponen rrna bersifat stabil pada semua sistem hidup dan tidak ada transfer gen rrna antar spesies. Sekuen ini dapat digunakan untuk mengukur jarak filogenetik antar organisme walaupun hubungan kekerabatannya jauh. Urutan basa gen 16S rrna juga dapat menunjukkan nenek moyang dan kekerabatan organisme, akan tetapi organisme yang berkerabat belum tentu memiliki kesamaan aktivitas fisiologis (Atlas, 1997) Elektroforesis Gel Agarosa Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan (Yuwono, 2005). Teknik elektroforesis selalu memiliki dua komponen utama, yaitu medium penyangga (kertas atau gel) dan larutan bufer. Fungsi medium penyangga adalah sebagai reseptor titik dari senyawa-senyawa yang akan dipisahkan dan menyediakan jalur bagi migrasi komponen. Sedangkan fungsi bufer sebagai konduktor arus, yaitu jembatan konduksi di antara dua elektroda, sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik dan menstabilkan ph. Untuk

23 10 elektroforesis DNA dapat digunakan bufer Tris-asetat-EDTA (TAE) dan Trisborate-EDTA (TBE) (Sari, 2006). Elektroforesis DNA akan lebih baik menggunakan medium penyangga berupa gel buatan seperti poliakrilamida atau agarosa. Gel agarosa lebih mudah dalam preparasinya daripada poliakrilamida. Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam elektroforesis bervariasi antara 0.5%-2%. Biasanya gel agarosa dengan konsentrasi 0.8%-1% sangat baik untuk memisahkan fragmen DNA berukuran pasang basa. Gel agarosa dengan konsentrasi kurang dari 0.5% sangat rapuh dan sulit ditangani. Hasil elektroforesis DNA dapat divisualisasikan dengan mewarnai gel (staining) yang berisi DNA menggunakan Etidium Bromida (EtBr) selama 5-10 menit kemudian dilanjutkan dengan pencucian dalam akuades (destaining) selama 5-10 menit yang bertujuan untuk menghilangkan EtBr yang berikatan secara tidak spesifik pada bagian gel yang tidak terdapat DNA. Selanjutnya pita-pita DNA dapat dilihat dengan sinar ultraviolet (UV). Etidium Bromida dapat menangkap sinar UV, sehingga DNA yang terikat dengan EtBr dapat terlihat pendarannya di transilluminator (Sari, 2006). Asam deoksiribonukleat merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga jika diletakkan di medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan muatan pewarna (loading buffer). Pewarna yang biasa digunakan adalah bromofenol biru dan xilen sianol yang mengandung sukrosa sebagai pemberat (Sari, 2006) Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR) atau disebut reaksi rantai polimerase adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu atau DNA dengan cara in vitro (Yuwono, 2006). Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, teknik ini telah melahirkan bermacam teknik berbasis PCR lainnya yang sangat bervariasi. Protokol dasar PCR menurut Anonim (2008) adalah sebagai berikut :

24 11 1. DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95 C sehingga membentuk DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai cetakan. 2. DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan DNA cetakan pada temperatur rendah. Ikatan primer terjadi pada utas yang komplementer dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target. 3. Suhu ditingkatkan menjadi 72 C sehingga enzim DNA polimerase dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru. 4. Utas ganda DNA yang baru disintesis, didenaturasi pada suhu tinggi dan siklus berulang. Tujuan dari PCR adalah untuk membuat sejumlah besar duplikasi suatu gen. Hal ini diperlukan agar diperoleh jumlah DNA cetakan awal yang cukup untuk sekuensing DNA ataupun untuk memperoleh material genetik yang diperlukan dalam proses rekayasa genetik. Tahapan pengerjaan PCR secara umum terdiri dari isolasi DNA/RNA, pengecekan integritas isolat DNA/RNA secara spektrofotometri atau elektroforesis, pencampuran komponen reaksi PCR pemrograman mesin PCR pada kondisi optimum, amplifikasi reaksi dan deteksi atau evaluasi hasil reaksi (Sari, 2006). Reaksi PCR suatu fragmen DNA dimulai dari tahap denaturasi DNA cetakan. Denaturasi ini akan menyebabkan DNA yang semula rantai ganda akan terpisah menjadi DNA rantai tunggal. Denaturasi DNA menggunakan pemanasan pada suhu 90 0 C hingga 95 0 C. Kemudian dilanjutkan dengan tahap penempelan primer pada DNA cetakan yang rantai tunggal. Penempelan primer terjadi pada DNA target untuk mendefinisikan sekuen yang diinginkan. Suhu pada tahap ini dipengaruhi oleh jumlah G+C dan A+T di dalam primer yang digunakan dan konsentrasi amplifikasi primer. Setelah dilakukan penempelan primer, suhu inkubasi dinaikkan hingga 72 0 C. Pada suhu ini akan terjadi polimerisasi rantai DNA yang baru pada DNA target. DNA baru hasil polimerisasi tersebut akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerisasi selanjutnya. Tiga prinsip tahap reaksi tersebut dapat dilakukan 20 hingga 40 kali sehingga pada akhir dari PCR akan didapatkan DNA baru dalam jumlah banyak (Yuwono, 2006). Siklus PCR dapat dilihat pada Gambar 2.

25 Gambar 2. Siklus PCR (Carr, 2005) 12

26 III. BAHAN DAN METODE 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB. Biogen) Cimanggu, Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai dengan bulan Desember Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sampel tanah dari Kebun Percobaan IPB Cikabayan (Bogor, Jawa Barat), Citeureup (Bogor, Jawa Barat), Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT), medium Pikovskaya (dengan 2 sumber P yang berbeda, yaitu Ca 3 (PO 4 ) 2 atau trikalsium fosfat dan Ca 5 (PO 4 ) 3 OH atau hidroksi apatit), larutan fisiologis 0.85%, Modified Universal Buffer (MUB) 1x, 0.5 N NaOH, M p-nitro phenyl phosphate (p-npp), 1 mg/ml p-nitrophenol (p-np), larutan standar indole acetic acid (IAA), pereaksi Salkowski (400 ml H 2 SO 4 pekat; 20 ml FeCl M; 580 ml akuades), akuades, ungu kristal, safranin, iodium, alkohol 95%, medium LB (Luria Bertani), bufer STE (100 mm NaCl; 10 mm Tris-HCl; 1 mm EDTA ph 8), larutan SDS 10%, proteinase-k 10 mg/ml, larutan fenol, larutan kloroform, etanol absolut 95%, aquabidest steril, 10x bufer TAE, agarosa, larutan loading buffer, primer F-63 (5 -CAGGCCTAACACATGCAAGTC) dan primer R-1387 (5 - GGGCGGCGTGTACAAGGC) (Marchesi et al., 1998), 10 mm dntp (deoxynucleotide triphosphates), 10x bufer Polymerase Chain Reaction (PCR), 50 mm MgSO 4, enzim Taq DNA polimerase, dan Etidium Bromida (EtBr). Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain berbagai macam peralatan gelas (cawan Petri, batang penyebar, erlenmeyer, tabung reaksi), neraca analitik, ph meter, shaker, autoklaf, ruang laminar, mikropipet, tip mikro, magnetik stirer, inkubator, tabung Eppendorf, vorteks, waterbath, sentrifuse, Hitachi Spectrophotometer tipe , mikroskop, kaca preparat, microvawe, refrigerator, perangkat elektroforesis (Mupid-2plus), perangkat PCR (Swift TM Maxi Thermal Cycler Blocks- ESCO ), dan Scope UV Transilluminator (Dekstop Gel Imager-SCOPE 21).

27 Metode Penelitian Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah di sekitar Perakaran (Rizosfer) Sebanyak 10 gram tanah dari setiap sampel tanah dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi 90 ml medium Pikovskaya cair ph 6.8, dishaker (120 rpm) selama 7-10 hari pada suhu ruang, kemudian dibuat serial pengenceran sampai Sebanyak 50 µl dari pengenceran 10-3 dan 10-4 dituang di atas permukaan medium Pikovskaya padat secara steril, kemudian disebar merata menggunakan batang penyebar, dan diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu ruang. Adanya pertumbuhan bakteri pelarut fosfat ditandai dengan zona berwarna terang jernih atau zona bening di sekeliling koloni. Koloni yang dikelilingi zona berwarna terang jernih atau zona bening menunjukkan adanya pelarutan fosfat. Koloni-koloni bakteri pelarut fosfat yang diinginkan selanjutnya dimurnikan dengan metode cawan gores dan disimpan di dalam medium agar-miring Pikovskaya Karakterisasi dan Pengujian Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P Setelah terpilih bakteri pelarut fosfat (BPF) hasil isolasi dari beberapa sampel tanah, kemudian dilakukan karakterisasi secara morfologi dengan melakukan pengamatan terhadap koloni BPF meliputi bentuk, tepian, elevasi, dan warna sesuai prosedur Hadioetomo (1993). Selain itu, dilakukan pula pengujian kemampuan BPF dalam melarutkan P pada medium Pikovskaya padat dengan mengukur diameter zona bening dan indeks pelarutan (IP) fosfat. Pengujian karakterisasi dan kemampuan BPF dalam melarutkan P dilakukan dengan membuat larutan fisiologis 0.85%, kemudian dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf sebanyak 20 µl. Sebanyak 1 ose kultur isolat BPF yang telah ditumbuhkan pada medium Pikovskaya padat, dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi larutan fisiologis dengan menggunakan tusuk gigi, kemudian dihomogenkan. Setelah itu, diambil sebanyak 10 µl menggunakan mikropipet kemudian diteteskan di atas medium Pikovskaya padat secara steril, dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan selama 7 hari inkubasi dengan mengamati bentuk, tepian, elevasi, dan warna serta

28 15 mengukur diameter zona bening dan indeks pelarutan (IP) fosfat koloni BPF yang menghasilkan zona bening di sekeliling koloni Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase Bakteri pelarut fosfat (BPF) yang telah terpilih dari hasil isolasi beberapa sampel tanah dan pengujian karakterisasi dan kemampuan BPF dalam melarutkan P pada medium Pikovskaya padat dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 atau trikalsium fosfat sebagai sumber fosfatnya, kemudian dilakukan pengujian BPF tersebut dalam menghasilkan enzim fosfatase. Pengujian ini dilakukan dengan membuat kurva standar p-nitrophenol (p-np) dan mengukur kandungan enzim fosfatase BPF. Pembuatan kurva standar p-nitrophenol (p-np). Sebanyak 0.02 gram p-nitrophenol (p-np) dilarutkan dengan akuades 20 ml (konsentrasi = 1000 ppm), kemudian dibuat beberapa tingkat pengenceran menjadi konsentrasi 800 ppm, 400 ppm, 200 ppm, 100 ppm, dan 50 ppm di dalam tabung reaksi. Ke dalam tabung reaksi uji dimasukkan 2 ml masing-masing konsentrasi larutan standar p- nitrophenol (p-np) dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang. Larutan standar p-nitrophenol berwarna kuning. Larutan standar p-nitrophenol diukur absorbansinya pada panjang gelombang (λ) = 410 nm menggunakan Hitachi Spectrophotometer tipe dan dibuat kurva standar yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi larutan standar p-nitrophenol (x) dan absorbansi (y). Pengukuran kandungan enzim fosfatase. Pengukuran kandungan enzim fosfatase dilakukan sesuai prosedur Tabatabai dan Bremner (1969). Sebanyak 10 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 3 hari pada suhu ruang di dalam medium Pikovskaya cair (dengan 2 sumber P yang berbeda, yaitu Ca 3 (PO 4 ) 2 atau trikalsium fosfat dan Ca 5 (PO 4 ) 3 OH atau hidroksi apatit) disentrifugasi (10000 rpm, 15 menit) untuk memisahkan koloni bakteri dari medium. Supernatan hasil sentrifugasi tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi bersih dan steril sebanyak 1 ml, kemudian ditambahkan 4 ml Modified Universal Buffer (MUB) 1x, dan 1 ml M p-nitro phenyl phosphate (p-npp), kemudian diinkubasi selama 60 menit di dalam waterbath pada suhu 37ºC. Setelah diinkubasi selama 60 menit, ditambahkan 5 ml 0.5 N NaOH untuk menghentikan reaksi. Larutan akan berubah menjadi warna kuning, hal ini

29 16 menandakan bahwa bakteri menghasilkan enzim fosfatase. Semakin pekat warna kuning yang terbentuk, maka semakin tinggi enzim fosfatase yang dihasilkan. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang (λ) = 410 nm menggunakan Hitachi Spectrophotometer tipe Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Zat Pemacu Tumbuh Indole Acetic Acid (IAA) Selain dilakukan pengujian bakteri pelarut fosfat (BPF) dalam menghasilkan enzim fosfatase, dilakukan pula pengujian BPF dalam menghasilkan zat pemacu tumbuh IAA dengan 2 sumber P yang berbeda, yaitu Ca 3 (PO 4 ) 2 atau trikalsium fosfat dan Ca 5 (PO 4 ) 3 OH atau hidroksi apatit. Pengujian ini dilakukan dengan membuat kurva standar IAA dan mengukur kandungan IAA BPF. Pembuatan kurva standar IAA. Sebanyak 10 ml larutan standar IAA 100 ppm dibuat beberapa tingkat pengenceran menjadi konsentrasi 80 ppm, 40 ppm, 20 ppm, 10 ppm, dan 5 ppm di dalam tabung reaksi. Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 2 ml masing-masing konsentrasi larutan standar IAA kemudian ditambahkan 2 ml pereaksi Salkowski (perbandingan 1 : 1) dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang. Setelah penambahan pereaksi Salkowski dan inkubasi selama 60 menit, larutan akan berubah menjadi warna merah muda. Larutan standar IAA diukur absorbansinya pada panjang gelombang (λ) = 530 nm menggunakan Hitachi Spectrophotometer tipe dan dibuat kurva standar yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi larutan standar IAA (x) dan absorbansi (y). Pengukuran kandungan IAA. Pengukuran kandungan IAA dilakukan sesuai prosedur Gordon dan Weber (1993). Sebanyak 10 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 3 hari pada suhu ruang di dalam medium Pikovskaya cair (dengan 2 sumber P yang berbeda, yaitu Ca 3 (PO 4 ) 2 atau trikalsium fosfat dan Ca 5 (PO 4 ) 3 OH atau hidroksi apatit) disentrifugasi (10000 rpm, 15 menit) untuk memisahkan koloni bakteri dari medium. Supernatan hasil sentrifugasi tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi bersih dan steril sebanyak 2 ml, kemudian ditambahkan pereaksi Salkowski sebanyak 2 ml (perbandingan 1 : 1). Campuran supernatan dan pereaksi Salkowski diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang.

30 17 Larutan akan berubah menjadi warna merah muda, hal ini merupakan indikasi adanya kandungan IAA. Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang (λ) = 530 nm menggunakan Hitachi Spectrophotometer tipe Pengujian Pewarnaan Gram Bakteri Pelarut Fosfat Setelah dilakukan pengujian bakteri pelarut fosfat (BPF) dalam menghasilkan zat pemacu tumbuh IAA, kemudian dilakukan pengujian pewarnaan Gram (Hadioetomo, 1993). Sebanyak 1 ose kultur isolat BPF, dioleskan di kaca preparat yang telah diberi setetes air dan difiksasi dengan panas (dilewatkan di atas api). Kemudian diteteskan ungu kristal selama 1 menit, kelebihan zat warna dibuang dan dibilas dengan akuades. Selanjutnya diteteskan iodium selama 2 menit, kelebihan zat warna dibuang dan dibilas dengan akuades. Tahap berikutnya pemucatan dengan meneteskan alkohol 95% selama 30 detik dan dibilas dengan akuades. Kemudian diteteskan safranin selama 30 detik, kelebihan zat warna dibuang dan dibilas dengan akuades. Sisa-sisa air diserap dengan kertas serap kemudian preparat diamati tanpa kaca penutup di bawah mikroskop. Bakteri Gram positif akan tampak berwarna ungu, sedangkan bakteri Gram negatif akan tampak berwarna merah muda Pengukuran Pertumbuhan Populasi, ph, dan Kandungan Enzim Fosfatase Bakteri Pelarut Fosfat Setelah dilakukan karakterisasi dan pengujian kemampuan bakteri pelarut fosfat (BPF) dalam melarutkan P secara kualitatif, pengujian BPF dalam menghasilkan enzim fosfatase dan zat pemacu tumbuh IAA, serta karakteristik pewarnaan Gram, kemudian dipilih tiga isolat BPF berdasarkan kandungan enzim fosfatase dan zat pengatur tumbuh IAA tertinggi pada masing-masing daerah asal sampel tanah (Bogor, NTB, dan NTT). Isolat terpilih tersebut selanjutnya akan dilakukan pengujian lebih lanjut, yaitu pengukuran pertumbuhan populasi, perubahan ph pada medium Pikovskaya cair, dan pengukuran kandungan enzim fosfatase. Pengukuran kandungan enzim fosfatase tersebut dilakukan dengan metode yang sama dengan metode pengukuran kandungan enzim fosfatase sebelumnya, yaitu sesuai dengan prosedur Tabatabai dan Bremner (1969), tetapi

31 18 pada pengukuran kali ini dilakukan selama 7 hari inkubasi (sebelumnya 3 hari inkubasi). Pengukuran perubahan ph pada medium Pikovskaya cair tiap isolat BPF dilakukan menggunakan ph meter. Pengukuran pertumbuhan populasi BPF dilakukan dengan membuat serial pengenceran 10-5, 10-6, dan Sebanyak 25 µl dari setiap pengenceran tersebut dituang di atas permukaan medium Pikovskaya padat secara steril dan disebar merata menggunakan batang penyebar, kemudian diinkubasi pada suhu ruang sampai terbentuk zona bening di sekeliling koloni. Ketiga pengukuran tersebut dilakukan selama 7 hari inkubasi, dimulai dari hari ke-0 sampai hari ke Identifikasi Molekuler Selain dilakukan pengukuran pertumbuhan populasi, perubahan ph pada medium Pikovskaya cair, dan pengukuran kandungan enzim fosfatase, dilakukan pula identifikasi molekuler terhadap tiga isolat BPF terpilih dari masing-masing daerah asal sampel tanah (Bogor, NTB, dan NTT). Identifikasi molekuler ini dilakukan dalam beberapa tahapan sebagai berikut, yaitu isolasi DNA genom bakteri, elektroforesis DNA, Polymerase Chain Reaction (PCR), dan sekuensing DNA. Isolasi DNA Genom Bakteri. Isolasi total DNA genom yang digunakan merupakan modifikasi dari metode Lazo et al. (1987). Sebanyak 10 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 3 hari pada suhu ruang di dalam medium LB (Luria Bertani) disentrifugasi (8000 rpm, 10 menit) untuk memisahkan koloni bakteri dari medium. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan pelet dicuci dengan 1 ml bufer STE (100 mm NaCl; 10 mm Tris-HCl; 1 mm EDTA ph 8), kemudian pelet diresuspensi menggunakan mikropipet. Hasil resuspensi disentrifugasi (8000 rpm, 10 menit) kembali kemudian supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 200 µl bufer STE dan ditambahkan 40 µl larutan SDS 10%. Selanjutnya suspensi diinkubasi dalam waterbath (65ºC, 90 menit). Kemudian suspensi didinginkan pada suhu ruang dan ditambahkan 4 µl proteinase-k 10 mg/ml.

32 19 Suspensi DNA disimpan dalam inkubator 37ºC selama ± 4 jam. Hasil inkubasi ditambahkan larutan fenol dan kloroform masing-masing 120 µl sampai terbentuk emulsi, kemudian tabung Eppendorf yang berisi campuran DNA dibolak-balik secara halus. Suspensi yang telah teremulsi disentrifugasi (8000 rpm, 10 menit) dan supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf steril dan dipresipitasi dengan etanol absolut 95% yang dingin (-20ºC) sebanyak 2 kali volume supernatan yang diperoleh, kemudian diinkubasi pada suhu -20ºC selama 30 menit. DNA dililit keluar menggunakan ujung tip mikro ukuran 200 µl yang steril kemudian dikeringudarakan. Hasil isolasi DNA tersebut dilarutkan ke dalam tabung Eppendorf steril yang berisi 40 µl aquabidest steril. DNA yang telah dicairkan tersebut siap digunakan untuk elektroforesis atau disimpan sebagai stock pada suhu -20ºC. Proses Elektroforesis DNA. Larutan 10x bufer TAE diencerkan menjadi 0.5x bufer TAE. Kemudian dibuat gel agarosa 0.8%, yaitu 0.8 gram agarosa dalam 100 ml 0.5x bufer TAE yang selanjutnya dituang ke dalam cetakan gel agarosa. Setelah gel membeku diletakkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi 0.5x bufer TAE sehingga gel terendam. Sebanyak 2 µl dari masing-masing DNA dicampur dengan 3 µl loading buffer sebagai pemberat. Suspensi larutan DNA dengan loading buffer diinjeksikan ke dalam sumur-sumur pada gel elektroforesis. Setelah semua sumur terisi, power supply perangkat elektroforesis dinyalakan dengan voltase sebesar 110 V selama ± 45 menit. Gel hasil elektroforesis diangkat dan selanjutnya direndam dalam larutan Etidium Bromida (EtBr) selama 10 menit untuk pewarnaan (staining) dan destaining dalam akuades selama 5 menit. Selanjutnya DNA dapat dilihat dan difoto menggunakan perangkat UV Transilluminator yang dilengkapi dengan kamera digital. Proses Polymerase Chain Reaction (PCR). Proses PCR diawali dengan pembuatan campuran komponen reaksi untuk PCR sebanyak 75 µl dengan komposisi sebagai berikut : 7.50 µl 10x bufer PCR, 2.25 µl 10 mm dntp, 1.50 µl 50 mm MgSO 4, 0.75 µl 10 µm primer F, 0.75 µl 10 µm primer R, 1.00 µl template DNA, 1.00 µl Taq DNA polymerase, dan µl aquabidest steril.

33 20 Running PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan kondisi sebagai berikut, denaturasi siklus awal atau pra-denaturasi 94ºC selama 5 menit, diikuti denaturasi untuk siklus selanjutnya pada suhu 94ºC selama 30 detik. Penempelan primer (annealing) dilakukan selama 30 detik pada suhu 50ºC. Polimerisasi dilakukan selama 2 menit pada suhu 72ºC dan pada siklus terakhir, yaitu siklus ke-30 dilakukan perpanjangan waktu polimerisasi selama 7 menit. Terakhir dilakukan penurunan suhu ke 4ºC untuk menghentikan reaksi PCR. Produk hasil PCR divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.0% dalam 0.5x bufer TAE dengan voltase 110 volt selama ± 45 menit. Sekuensing DNA. Produk hasil PCR disekuen menggunakan piranti Automated DNA Sequencer ABI PRISM 377 (Perkin Elmer Biosystem, USA). Cycle sequencing DNA template dilakukan menggunakan kit BigDye Ready Reaction Mix (Perkin Elmer Biosystem, USA). Proses sekuensing dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Fakultas Teknobiologi, Universitas Atmajaya, Jakarta. Sekuen DNA yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen pada database European Bioinformatics Institute (EBI) menggunakan piranti WU-BLASTN 2.0 pada situs

34 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat Sampel tanah rizosfer yang digunakan sebagai sumber isolat bakteri pelarut fosfat (BPF) diperoleh dari areal Kebun Percobaan IPB Cikabayan (Bogor, Jawa Barat), Citeureup (Bogor, Jawa Barat), Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT). Sampel tanah tersebut diambil di dekat areal sungai, perkebunan, dan persawahan warga. Sampel tanah diambil di sekitar perakaran (rizosfer) pada beberapa tanaman. Mikroba pada sampel tanah yang diinokulasikan ke dalam medium Pikovskaya cair kemudian diukur kemampuannya dalam melarutkan P pada medium Pikovskaya padat. Tidak semua mikroba tersebut menghasilkan zona berwarna terang jernih atau zona bening. BPF yang tumbuh pada medium Pikovskaya padat akan melarutkan P ditandai dengan adanya zona berwarna terang jernih atau zona bening yang mengelilingi koloni bakteri tersebut. Hal ini disebabkan adanya pelarutan fosfat dari Ca 3 (PO 4 ) 2 yang terdapat dalam medium. Sebanyak 29 isolat BPF yang menghasilkan zona bening kemudian dimurnikan pada medium Pikovskaya padat dan disimpan dalam medium agar miring (stock culture) untuk digunakan dalam pengujian selanjutnya. Koloni bakteri pelarut fosfat yang dikelilingi oleh zona bening Gambar 3. Hasil isolasi bakteri pelarut fosfat dari rizosfer

35 22 Gambar 4. Pemurnian bakteri pelarut fosfat pada medium Pikovskaya padat 4.2. Karakteristik dan Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P Sebanyak 29 isolat bakteri pelarut fosfat (BPF) yang telah diperoleh selanjutnya dilakukan pengamatan karakteristik morfologi koloni meliputi bentuk, tepian, elevasi, dan warna koloni bakteri sesuai prosedur Hadioetomo (1993), serta pengukuran indeks pelarutan fosfat (IP). Hasil pengamatan dan pengukuran tersebut dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Karakteristik Morfologi Koloni dan Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P pada Medium Pikovskaya Padat Selama 7 Hari Inkubasi No. Isolat Ciri Koloni Kode Asal Warna Elevasi Tepian Bentuk 1. P 1.1 NTT Putih Timbul Licin Bundar dengan tepian timbul IP P 1.2 NTT Kuning Timbul Licin Keriput P 1.3 NTT Putih Seperti kawah Licin Bundar dengan tepian timbul P 1.4 NTT Putih Timbul Licin Bundar P 1.5 NTT Putih Seperti kawah Licin Bundar dengan tepian timbul P 2.1 NTT Putih Timbul Berombak Kompleks 1.10

36 23 Lanjutan Tabel 1... No. Isolat Ciri Koloni Kode Asal Warna Elevasi Tepian Bentuk 7. P 2.2 NTT Putih kekuningan Seperti kawah Licin Bundar dengan tepian timbul IP P 2.3 NTT Putih Seperti kawah Licin Bundar dengan tepian kerang P 2.4 NTT Putih Seperti kawah Berombak Bundar dengan tepian kerang P 3.1 NTT Kuning kecoklatan Timbul Tak beraturan Bundar dengan tepian kerang P 3.2 NTT Kuning kecoklatan Timbul Berombak Bundar dengan tepian menyebar P 3.3 NTT Kuning kecoklatan Timbul Tak beraturan Bundar dengan tepian menyebar P 3.4 NTT Kuning kecoklatan Timbul Tak beraturan Tak beraturan dan menyebar P 3.5 NTT Coklat Timbul Tak beraturan Bundar dengan tepian kerang P 3.6 NTT Kuning Seperti kawah Berombak Bundar dengan tepian kerang P 4.1 NTT Putih kekuningan Seperti tetesan Licin Bundar P 4.2 NTT Putih Seperti kawah Licin Bundar dengan tepian timbul P 4.3 NTT Putih kekuningan Seperti kawah Licin Bundar dengan tepian timbul P 4.4 NTT Putih Seperti tetesan Licin Bundar P 5.1 NTB Putih Seperti kawah Berombak Bundar dengan tepian timbul P 5.2 NTB Putih Timbul Berombak Bundar dengan tepian timbul P 5.3 NTB Putih Timbul Licin Bundar P 6.1 NTB Putih kekuningan Seperti tetesan Licin Bundar 1.25

37 24 Lanjutan Tabel 1... No. Isolat Ciri Koloni Kode Asal Warna Elevasi Tepian Bentuk 24. P 6.2 NTB Putih Seperti kawah Licin Bundar dengan tepian kerang IP P 7.1 CK Kuning Timbul Berombak 26. P 8.1 CK Putih Timbul Licin Bundar dengan tepian menyebar Bundar dengan tepian kerang P 8.2 CK Putih Datar Licin Bundar P 9.1 CT Kuning kecoklatan Timbul Licin Bundar P 10.1 CT Keterangan : Kuning kecoklatan diameterko loni + zonabening IP = diameterko loni Datar Licin Bundar 1.80 IP = Indeks Pelarutan Fosfat NTB = Provinsi Nusa Tenggara Barat NTT = Provinsi Nusa Tenggara Timur CK = Cikabayan (Kebun Percobaan IPB) CT = Citeureup (Bogor, Jawa Barat) Berdasarkan Indeks Pelarutan (IP) yang dihasilkan dapat diketahui bahwa BPF memiliki kemampuan melarutkan P yang bervariasi. Menurut Rachmiati (1995) luas zona bening secara kualitatif diduga menunjukkan besar kecilnya kemampuan bakteri melarutkan P dari fosfat tak larut. Pada pengamatan bentuk koloni yang mengacu kepada Hadioetomo (1993) menujukkan ke-29 isolat ratarata berbentuk bundar, bundar dengan tepian timbul, bundar dengan tepian menyebar, dan bundar dengan tepian kerang. Sebagian besar isolat berwarna putih, putih kekuningan, dan kuning kecoklatan dengan tepian licin, berombak, tak beraturan serta elevasi timbul, datar, seperti kawah (cekung), dan seperti tetesan (cembung).

38 Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase dan Zat Pengatur Tumbuh Indole Acetic Acid (IAA) serta Karakterisasi Pewarnaan Gram Setelah dilakukan pengujian karakteristik dan kemampuan bakteri pelarut fosfat (BPF) dalam melarutkan P pada medium Pikovskaya padat, kemudian dilakukan pengujian kemampuan BPF dalam menghasilkan enzim fosfatase dan IAA serta pewarnaan Gram yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase dan Indole Acetic Acid (IAA) Selama 3 Hari Inkubasi serta Pewarnaan Gramnya No. Isolat Enzim Fosfatase (ppm) IAA (ppm) Ca 3 (PO 4 ) 2 Ca 5 (PO 4 ) 3 OH Ca 3 (PO 4 ) 2 Ca 5 (PO 4 ) 3 OH Pewarnaan Gram 1. P Gram Negatif 2. P 1.2 * * 5.78 Gram Negatif 3. P * Gram Negatif 4. P Gram Negatif 5. P * Gram Negatif 6. P * 8.39 Gram Negatif 7. P * Gram Negatif 8. P * 1.00 Gram Negatif 9. P * Gram Negatif 10. P Gram Negatif 11. P Gram Negatif 12. P Gram Negatif 13. P Gram Negatif 14. P Gram Negatif 15. P Gram Negatif 16. P * * Gram Negatif 17. P * 1.87 Gram Negatif

39 26 Lanjutan Tabel 2 No. Isolat Enzim Fosfatase (ppm) IAA (ppm) Ca 3 (PO 4 ) 2 Ca 5 (PO 4 ) 3 OH Ca 3 (PO 4 ) 2 Ca 5 (PO 4 ) 3 OH Pewarnaan Gram 18. P * Gram Negatif 19. P * 2.30 Gram Negatif 20. P * 2.74 Gram Negatif 21. P * * Gram Negatif 22. P * Gram Negatif 23. P * 3.61 Gram Negatif 24. P * Gram Positif 25. P * 1.44 Gram Negatif 26. P * 8.39 Gram Negatif 27. P * 2.74 Gram Negatif 28. P Gram Negatif 29. P Gram Negatif Keterangan * : Tidak Terdeteksi Enzim fosfatase merupakan kompleks enzim penting di dalam tanah yang berfungsi memutuskan ikatan fosfat yang terikat oleh senyawa-senyawa organik menjadi bentuk yang tersedia bagi tanaman. Pada Tabel 2 terlihat bahwa isolat BPF yang menghasilkan enzim fosfatase tertinggi pada sumber fosfat Ca 3 (PO 4 ) 2 adalah isolat P 3.3 dengan kandungan enzim fosfatase sebesar ppm. Sedangkan isolat yang menghasilkan enzim fosfatase terendah adalah isolat P 7.1, yaitu sebesar 0.17 ppm. Isolat P 3.3 dan P 7.1 masing-masing diisolasi dari sampel pasir Sungai Pinti, Nusa Tenggara Timur (NTT) dan sampel tanah rizosfer tanaman kedelai di Kebun Percobaan IPB Cikabayan (Bogor, Jawa Barat). Pada sumber fosfat Ca 5 (PO 4 ) 3 OH, isolat yang menghasilkan enzim fosfatase tertinggi adalah P 3.2 dengan kandungan enzim fosfatase sebesar ppm. Sedangkan isolat yang menghasilkan enzim fosfatase terendah adalah isolat P 3.3, yaitu sebesar 2.13 ppm. Kedua isolat tersebut diisolasi dari sampel pasir Sungai Pinti, Nusa Tenggara Timur (NTT). Sebagian besar sampel tanah yang

40 27 berasal dari Sungai Pinti, Nusa Tenggara Timur (NTT) memiliki kandungan enzim fosfatase yang tinggi. Pada pengujian kemampuan BPF dalam menghasilkan IAA diketahui bahwa tidak semua isolat BPF mampu menghasilkan IAA (Tabel 2). Beberapa isolat diketahui tidak terdeteksi dalam menghasilkan IAA. Berdasarkan pengujian tersebut, diperoleh 10 isolat yang diketahui mampu menghasilkan IAA pada medium Pikovskaya cair dengan sumber fosfat Ca 3 (PO 4 ) 2, dan 27 isolat diketahui dapat menghasilkan IAA pada medium Pikovskaya cair dengan sumber fosfat Ca 5 (PO 4 ) 3 OH. Produksi IAA ditandai dengan adanya warna merah muda pada larutan, hal ini karena adanya penambahan pereaksi Salkowski. Semakin pekat warna merah mudanya, maka konsentrasi IAA yang dihasilkan akan semakin tinggi. Berdasarkan data pada Tabel 2 juga diketahui bahwa isolat BPF yang menghasilkan IAA tertinggi pada sumber fosfat Ca 3 (PO 4 ) 2 adalah isolat P 3.4, yaitu sebesar ppm. Sedangkan isolat yang menghasilkan IAA terendah adalah isolat P 1.1 dengan kandungan IAA sebesar 0.04 ppm. Isolat P 3.4 dan P 1.1 masing-masing diisolasi dari sampel pasir Sungai Pinti, Nusa Tenggara Timur (NTT) dan sampel tanah rizosfer pohon mahoni, Nusa Tenggara Timur (NTT). Pada sumber fosfat Ca 5 (PO 4 ) 3 OH, isolat yang menghasilkan IAA tertinggi adalah isolat P 3.5, dengan kandungan IAA sebesar ppm. Sedangkan isolat yang menghasilkan IAA terendah adalah isolat P 2.3, yaitu sebesar 1.00 ppm. Isolat P 3.5 dan P 2.3 masing-masing diisolasi dari sampel pasir Sungai Pinti, Nusa Tenggara Timur (NTT) dan sampel tanah rizosfer tanaman padi sawah, Nusa Tenggara Timur (NTT). Dari data pada Tabel 2, diseleksi tiga isolat BPF berdasarkan kandungan enzim fosfatase dan zat pengatur tumbuh IAA tertinggi pada masing-masing daerah asal sampel tanah (Bogor, NTB, dan NTT) yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel 3. Isolat BPF terpilih tersebut selanjutnya dilakukan pengujian lanjut, yaitu pengukuran pertumbuhan populasi, perubahan ph pada medium Pikovskaya cair, dan pengukuran kandungan enzim fosfatase selama 7 hari inkubasi.

41 28 Tabel 3. Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih Berdasarkan Kandungan Enzim Fosfatase dan IAA Tertinggi pada Masing-masing Daerah Asal Sampel Tanah Isolat Enzim Fosfatase (ppm) IAA (ppm) Kode Asal Ca 3 (PO 4 ) 2 Ca 5 (PO 4 ) 3 OH Ca 3 (PO 4 ) 2 Ca 5 (PO 4 ) 3 OH P 3.5 NTT P 6.2 NTB * P 10.1 Citeureup, Bogor Keterangan * : Tidak Terdeteksi Berdasarkan hasil pewarnaan Gram yang telah dilakukan, diketahui bahwa semua isolat BPF merupakan bakteri Gram negatif. Isolat P 3.5 dan isolat P 10.1 merupakan bakteri Gram negatif berbentuk kokus atau bulat, sedangkan isolat P 6.2 merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basilus atau batang (Gambar 5). Pewarnaan Gram dapat membedakan sel bakteri yang termasuk Gram negatif atau Gram positif. Bakteri Gram positif akan tampak berwarna ungu, sedangkan bakteri Gram negatif akan tampak berwarna merah muda. Perbedaan antara bakteri Gram positif dengan Gram negatif disajikan pada Tabel 4. Tabel 4. Beberapa Ciri Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif (Pelczar, 1986) CIRI Struktur dinding sel Komposisi dinding sel PERBEDAAN RELATIF Gram Positif Gram Negatif Tebal (15-80 nm) Tipis (10 15 nm) Berlapis tunggal (mono) Berlapis tiga (multi) Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi (11 (1-4%) 22%) Peptidoglikan ada sebagai Peptidoglikan ada di dalam lapisan tunggal; komponen lapisan kaku sebelah dalam; utama merupakan lebih dari jumlahnya sedikit, merupakan 50% berat kering pada sekitar 10% berat kering beberapa sel bakteri Tidak ada asam tekoat Asam tekoat Kerentanan terhadap penisilin Lebih rentan Kurang rentan Pertumbuhan dihambat oleh zat-zat warna dasar, misalnya ungu kristal Pertumbuhan dihambat dengan nyata Persyaratan nutrisi Resistensi terhadap gangguan fisik Relatif rumit pada banyak spesies Lebih resisten Pertumbuhan tidak begitu dihambat Relatif sederhana Kurang resisten

42 29 10 µm (a) 10 µm (b) 10 µm (c) Gambar 5. Hasil pewarnaan Gram dari sel bakteri pelarut fosfat; (a) isolat P 3.5, (b) isolat P 6.2, (c) isolat P 10.1 yang dilihat di bawah mikroskop (perbesaran 100 x 10)

43 Pertumbuhan Populasi, ph, dan Kandungan Enzim Fosfatase Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih Ketiga isolat BPF terpilih, yaitu P 3.5 yang berasal dari sampel tanah Nusa Tenggara Timur (NTT), P 6.2 yang berasal dari sampel tanah Nusa Tenggara Barat (NTB), dan P 10.1 yang berasal dari sampel tanah Citeureup (Bogor, Jawa Barat) dilakukan pengujian lanjut, yaitu (i) pertumbuhan populasi; (ii) perubahan ph pada medium Pikovskaya cair; dan (iii) kandungan enzim fosfatase. Ketiga pengujian tersebut dilakukan selama 7 hari inkubasi. Pertumbuhan populasi tiap isolat BPF terpilih disajikan pada Tabel 5 dan Gambar 6. Tabel 5. Isolat Jumlah Populasi Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih pada Medium Pikovskaya Padat dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 Sebagai Sumber P Hari ke P x x x x x x x10 8 P x x x x x x x10 8 P x x x x x x x10 8 Pertumbuhan Populasi 10 Log Jum lah K oloni P 3.5 P 6.2 P Waktu (hari) Gambar 6. Pertumbuhan populasi bakteri pelarut fosfat terpilih pada medium Pikovskaya padat dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 sebagai sumber P Kurva pertumbuhan bakteri umumnya berbentuk sigmoid, diawali oleh suatu periode awal yang tanpa ada pertumbuhan (lag phase atau fase lamban)

44 31 diikuti oleh suatu periode pertumbuhan yang cepat (log phase), kemudian mendatar (stationary phase atau fase statis), dan akhirnya diikuti oleh suatu penurunan populasi sel-sel hidup (death phase atau fase kematian) (Pelczar, 1986). Beberapa ciri pertumbuhan bakteri disajikan pada Tabel 6. Tabel 6. Beberapa Ciri Pertumbuhan Bakteri pada Setiap Fase Pertumbuhan (Pelczar, 1986) FASE PERTUMBUHAN Lamban (lag) Logaritma atau eksponensial Statis Penurunan atau kematian CIRI Tidak ada pertambahan populasi Sel mengalami perubahan dalam komposisi kimiawi dan bertambah ukurannya; substansi intraseluler bertambah Sel membelah dengan laju yang konstan Massa menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama Aktivitas metabolik konstan Keadaan pertumbuhan seimbang Penumpukan produk beracun dan/atau kehabisan nutrien Beberapa sel mati sedangkan yang lain tumbuh dan membelah Jumlah sel hidup menjadi tetap Sel menjadi mati lebih cepat daripada terbentuknya sel-sel baru Laju kematian mengalami percepatan menjadi eksponensial Bergantung kepada spesiesnya, semua sel mati dalam waktu beberapa hari atau beberapa bulan Pada Gambar 6 terlihat bahwa ketiga isolat mengalami fase lag atau fase permulaan pada hari ke-0 sampai hari ke-1. Pada fase ini bakteri baru menyesuaikan diri dengan lingkungan yang baru, sehingga sel belum membelah diri. Sel mikroba mulai membelah diri pada fase pertumbuhan yang dipercepat, tetapi waktu generasinya masih panjang. Fase logaritma terjadi pada hari ke-1 sampai hari ke-3. Pada fase ini terjadi kecepatan sel membelah diri paling cepat, dengan waktu generasi pendek dan konstan. Selama fase logaritma, metabolisme sel paling aktif, sintesis bahan sel sangat cepat dengan jumlah konstan sampai nutrien habis atau terjadinya penimbunan hasil metabolisme yang menyebabkan terhambatnya pertumbuhan (Sumarsih, 2003). Pada hari ke-3 sampai hari ke-4 terjadi fase stasioner. Pada fase pertumbuhan yang mulai terhambat, kecepatan pembelahan sel berkurang dan jumlah sel yang mati mulai bertambah. Pada fase stasioner maksimum jumlah sel yang mati semakin meningkat sampai terjadi jumlah sel hidup hasil pembelahan

45 32 sama dengan jumlah sel yang mati, sehingga jumlah sel hidup konstan, seolaholah tidak terjadi pertumbuhan (pertumbuhan nol). Sedangkan fase kematian terjadi mulai dari hari ke-5 sampai ke-6. Pada fase kematian, kecepatan kematian sel terus meningkat sedang kecepatan pembelahan sel nol, sampai pada fase kematian logaritma maka kecepatan kematian sel mencapai maksimal, sehingga jumlah sel hidup menurun dengan cepat seperti deret ukur. Walaupun demikian penurunan jumlah sel hidup tidak mencapai nol, dalam jumlah minimum tertentu sel mikroba akan tetap bertahan sangat lama dalam medium tersebut (Sumarsih, 2003). Perubahan kemasaman media merupakan salah satu indikator aktivitas metabolisme sel. Pengukuran nilai ph pada medium Pikovskaya cair cenderung menurun untuk ketiga isolat yang diamati (Tabel 7 dan Gambar 7). Tabel 7. Nilai ph Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih pada Medium Pikovskaya Cair dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 Sebagai Sumber P Isolat Hari ke P P P Perubahan ph 7 p H 6 5 P 3.5 P 6.2 P Waktu (hari) Gambar 7. Perubahan nilai ph isolat bakteri pelarut fosfat terpilih pada medium Pikovskaya cair dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 sebagai sumber P

46 33 Penurunan ph pada medium disebabkan oleh disekresikannya asam-asam organik yang dibebaskan oleh sejumlah BPF dalam aktivitasnya. BPF akan membebaskan sejumlah asam-asam organik antara lain asam sitrat, glutamat, suksinat, laktat, oksalat, glikooksalat, malat, fumarat, tartarat, asam α-ketobutirat. Meningkatnya asam-asam organik tersebut biasanya diikuti pula dengan penurunan ph yang tajam, sehingga berakibat terjadinya pelarutan Ca-P (Subba- Rao, 1982). Rachmiati (1995) berpendapat bahwa setiap jenis BPF mempunyai kemampuan berbeda secara genetik dalam menghasilkan jumlah jenis asam-asam organik yang berperan dalam menentukan tinggi rendahnya pelarutan P. Tabel 8. Kandungan Enzim Fosfatase (ppm) Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih pada Medium Pikovskaya Cair dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 Sebagai Sumber P Isolat Hari ke P P P Kandungan Enzim Fosfatase Konsentrasi Fosfatase (ppm) P 3.5 P 6.2 P 10.1 Waktu (hari) Gambar 8. Kandungan enzim fosfatase bakteri pelarut fosfat terpilih pada medium Pikovskaya cair dengan Ca 3 (PO 4 ) 2 sebagai sumber P Kandungan enzim fosfatase untuk ketiga isolat BPF terpilih dapat dilihat pada Tabel 8 dan Gambar 8. Pada Gambar 8 diketahui bahwa kandungan enzim fosfatase cenderung meningkat sampai hari ke-4 kemudian menurun pada hari ke-

47 34 5 tetapi meningkat kembali pada hari ke-6 (untuk isolat P 3.5 dan P 10.1). Sedangkan untuk isolat P 6.2 peningkatan kandungan enzim fosfatase tidak begitu tajam dibandingkan dengan isolat P 3.5 dan P Isolat P 10.1 memiliki kandungan enzim fosfatase tertinggi diikuti dengan isolat P 3.5 kemudian isolat P 6.2. Hasil pengukuran dari kandungan enzim fosfatase yang diukur pada setiap pengamatan untuk ketiga isolat BPF terpilih tersebut didapatkan hasil absorbansi yang meningkat pada setiap pengukuran, tetapi setelah absorbansi dihitung dalam hasil kurva standar p-nitrophenol terjadi penurunan hasil kandungan enzim fosfatase pada hari ke-5, hal ini disebabkan adanya perbedaan dari hasil kurva standar p-nitrophenol, karena pada setiap pengamatan diukur pula kurva standar p-nitrophenol yang hasilnya berbeda-beda pada setiap pengamatan. Selain itu, kandungan enzim fosfatase pada inkubasi hari ke-3 diperoleh hasil yang berbeda dengan hasil kandungan enzim fosfatase pada masa inkubasi yang sama pada pengujian sebelumnya (Tabel 2). Hal ini disebabkan pula karena adanya perbedaan waktu pengukuran dan perbedaan kurva standar p-nitrophenol Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat Isolasi DNA Isolasi DNA bakteri pelarut fosfat (BPF) menggunakan metode Lazo et al. (1987) sebagai awal untuk mendapatkan informasi genetik bakteri tersebut. BPF yang diidentifikasi secara molekuler merupakan isolat terpilih yang memiliki kandungan enzim fosfatase dan IAA yang tinggi pada masing-masing daerah asal sampel tanah (Bogor, NTB, dan NTT). Ketiga isolat tersebut adalah P 3.5 (NTT), P 6.2 (NTB), dan P 10.1 (Citeureup, Bogor). Sel BPF yang diinokulasikan ke dalam medium Luria Bertani (LB) dishaker dengan kecepatan 120 rpm dan diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu ruang. Pada metode Lazo et al. (1987) isolasi DNA secara keseluruhan banyak dilakukan secara kimiawi. Sel BPF yang telah ditumbuhkan kemudian disentrifugasi dan diresuspensi menggunakan bufer STE. Bufer STE mengandung NaCl yang akan menghilangkan interaksi ionik antara DNA dan kation sehingga DNA akan larut lebih baik dan lebih stabil pada garam. Selain itu, bufer STE juga

48 35 mengandung etilen diamin tetra asetat (EDTA) yang berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat (Muladno, 2002). Sodium dodesil sulfat (SDS) 10% yang digunakan dalam isolasi DNA merupakan sejenis deterjen yang dapat digunakan untuk merusak membran sel, hal ini mengakibatkan sel mengalami lisis. Isolasi DNA juga menggunakan proteinase-k. Enzim tersebut yang mengkatalisis degradasi polipeptida menjadi unit-unit yang lebih kecil. Kotoran (debris) sel yang disebabkan oleh pengrusakan sel oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara disentrifugasi sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan digunakan larutan fenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan) (Muladno, 2002). Pemberian larutan fenol dan kloroform dapat dilakukan berulang agar protein dan pengotor pada proses isolasi DNA dapat terbuang lebih maksimal. Pengambilan fase yang mengandung DNA pada bagian atas dilakukan dengan sangat hati-hati. Selanjutnya DNA dipresipitasi menggunakan etanol absolut 95%. DNA terlihat berwarna bening dan kental saat dililit menggunakan ujung tip mikro (Gambar 9). Gambar 9. DNA yang telah dililit di ujung tip mikro

49 Elektroforesis Gel Agarosa DNA yang telah berhasil diisolasi kemudian dilakukan pengujian untuk mendeteksi keberadaan DNA tersebut menggunakan elektroforesis pada gel agarosa (Gambar 10) Keterangan : 1 = 1 kb DNA ladder marker 2 = isolat P = isolat P = isolat P 10.1 Gambar 10. Hasil elektroforesis DNA genom bakteri pelarut fosfat Amplifikasi Gen 16S rrna Isolasi DNA dilakukan sebagai tahap awal untuk melakukan proses PCR. Konsentrasi DNA yang terlalu tinggi akan menghambat tahapan denaturasi PCR, karena dapat memacu terjadinya snapback, yaitu kembalinya DNA utas tunggal menjadi DNA utas ganda, hal ini akan menyebabkan DNA cetakan untuk reaksi PCR berkurang. Hasil amplifikasi PCR isolat BPF menggunakan primer 16S rrna (Gambar 11) menghasilkan satu amplikon atau produk PCR berukuran sekitar 1300 bp. Primer yang digunakan dalam proses PCR ini, yaitu primer F-63 (5 - CAGGCCTAACACATGCAAGTC) dan primer R-1387 (5 - GGGCGGCGTGTACAAGGC) (Marchesi et al., 1998). Selanjutnya amplikon ini disekuen untuk mengetahui urutan nukleotida pada gen 16S rrna masingmasing isolat.

50 bp Keterangan : 1 = 1 kb DNA ladder marker 2 = isolat P = isolat P = isolat P bp Amplikon ~1300 bp Gambar 11. Hasil amplifikasi gen 16S rrna bakteri pelarut fosfat Sekuensing DNA Bakteri Pelarut Fosfat Berdasarkan hasil analisis sekuen gen 16S rrna pada program WU- BLASTN 2.0 diketahui homologi spesies dari tiga isolat bakteri pelarut fosfat yang diuji. Isolat P 3.5 (NTT) dan isolat P 10.1 (Citeureup, Bogor) memiliki kemiripan sebesar 98% dengan Gluconacetobacter sp. strain Rh1-MS-CO, sedangkan isolat P 6.2 (NTB) memiliki kemiripan sebesar 97% dengan Enterobacter sp. strain pp9c. Hasil analisis sekuen gen 16S rrna dari tiga isolat BPF pada data GenBank sebagai berikut : Isolat 3.5 > Gluconacetobacter sp. Rh1-MS-CO 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Length=1394 Score = 708 bits (784), Expect = 0.0 Identities = 401/406 (98%), Gaps = 1/406 (0%) Query 40 GGATCTGTCNTNCCGGTGGGGGATAACACTGGGAAACTGGTGCTAATACCGCATGACACC 99 Sbjct 60 GGATCTGTCCATG-GGTGGGGGATAACACTGGGAAACTGGTGCTAATACCGCATGACACC 118 Query 100 TGAGGGTCAAAGGCGAGAGTCGCCTGTGGAGGAACCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTGG 159 Sbjct 119 TGAGGGTCAAAGGCGAGAGTCGCCTGTGGAGGAACCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTGG 178 Query 160 GGTAACTGCCTACCAAGGCGATGATCGATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTG 219 Sbjct 179 GGTAACTGCCTACCAAGGCGATGATCGATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTG 238 Query 220 GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGG 279 Sbjct 239 GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGG 298

51 38 Query 280 GGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTT 339 Sbjct 299 GGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTT 358 Query 340 TCGACGGGGACGATGATGACGGTACCCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCA 399 Sbjct 359 TCGACGGGGACGATGATGACGGTACCCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCA 418 Query 400 GCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATGACTGGGC 445 Sbjct 419 GCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATGACTGGGC 464 Isolat 10.1 > Gluconacetobacter sp. Rh1-MS-CO 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Length=1394 Score = 719 bits (796), Expect = 0.0 Identities = 407/412 (98%), Gaps = 1/412 (0%) Query 42 GGATCTGTCNTTCCNGTGGGGGATAACACTGGGAAACTGGTGCTAATACCGCATGACACC 101 Sbjct 60 GGATCTGTCCATG-GGTGGGGGATAACACTGGGAAACTGGTGCTAATACCGCATGACACC 118 Query 102 TGAGGGTCAAAGGCGAGAGTCGCCTGTGGAGGAACCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTGG 161 Sbjct 119 TGAGGGTCAAAGGCGAGAGTCGCCTGTGGAGGAACCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTGG 178 Query 162 GGTAACTGCCTACCAAGGCGATGATCGATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTG 221 Sbjct 179 GGTAACTGCCTACCAAGGCGATGATCGATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTG 238 Query 222 GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGG 281 Sbjct 239 GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGG 298 Query 282 GGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTT 341 Sbjct 299 GGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTT 358 Query 342 TCGACGGGGACGATGATGACGGTACCCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCA 401 Sbjct 359 TCGACGGGGACGATGATGACGGTACCCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCA 418 Query 402 GCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATGACTGGGCGTAAAG 453 Sbjct 419 GCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATGACTGGGCGTAAAG 470 Isolat 6.2 > Enterobacter sp. pp9c 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Length=1535 Score = 708 bits (784), Expect = 0.0 Identities = 408/419 (97%), Gaps = 1/419 (0%) Query 29 CGAGAGGANNANGGGTGAGTTTTCTTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACT 88 Sbjct 92 CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGT-CTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACT 150 Query 89 GGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTC 148 Sbjct 151 GGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTC 210 Query 149 TTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGC 208 Sbjct 211 TTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGC 270

52 39 Query 209 GACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG 268 Sbjct 271 GACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG 330 Query 269 ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA 328 Sbjct 331 ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA 390 Query 329 TGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGT 388 Sbjct 391 TGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGT 450 Query 389 TGNGGTTAATAACCNCAGCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGT 447 Sbjct 451 TGAGGTTAATAACCTCAGCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGT 509 berikut : Hasil sekuen isolat P 3.5 dan P 10.1 termasuk ke dalam taksonomi sebagai Kingdom Phylum Class Order Family Genus Spesies : Bacteria : Proteobacteria : Alphaproteobacteria : Rhodospirillales : Acetobacteraceae : Gluconacetobacter : Gluconacetobacter sp. Sedangkan hasil sekuen isolat P 6.2 termasuk ke dalam taksonomi sebagai berikut : Kingdom : Bacteria Phylum : Proteobacteria Class : Gammaproteobacteria Order : Enterobacteriales Family : Enterobacteriaceae Genus : Enterobacter Spesies : Enterobacter sp. Proteobacteria merupakan filum terbesar dalam Kingdom/Domain Eubacteria. Semua Proteobacteria merupakan bakteri Gram negatif, tetapi memiliki bentuk bermacam-macam (batang, bulat, dan spiral). Kebanyakan bergerak dengan flagela, tetapi ada yang bergerak meluncur atau tidak dapat bergerak. Sebagian besar anggotanya termasuk mikroorganisme anaerob

53 40 fakultatif atau obligat. Anggota Proteobacteria ada yang hidup bebas, bersimbiosis ataupun sebagai patogen pada manusia, hewan, dan tumbuhan. Berdasarkan rangkaian rrna-nya, Proteobacteria dibagi menjadi lima kelompok, yaitu Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, dan Epsilonproteobacteria. Alphaproteobacteria meliputi bakteri fototrof dan bakteri yang menggunakan senyawa C1. Anggota kelompok ini ada yang bersimbiosis dengan tanaman (contohnya, Rhizobium sp) dan hewan. Ada pula yang merupakan patogen pada hewan dan manusia, contohnya Rickettsia prowazek. Bakteri ini menyebabkan demam pada penyakit tifus jika berpindah dari kutu ke manusia. Contoh lainnya adalah Agrobacterium tumefaciens dan Magnetospirilum magnerotuctlicum (Siregar, 2008). Betaproteobacteria terdiri atas kelompok bakteri aerob fakultatif, bakteri kemolitotrof (misalnya, Nitrosomonas), serta bakteri fototrof (misalnya, Rhodocyclus). Contoh spesies patogen dalam kelompok ini adalah Neisseria gonorrhoea. Gammaproteobacteria terdiri atas kelompok-kelompok bakteri yang banyak digunakan untuk keperluan medis dan penelitian, contohnya Enterobacteri, Vibrio, dan Pseudomonas. Namun ada pula yang merupakan patogen, misalnya Salmonella (tifus), Vibrio (kolera), dan Yersinia. Kelompok Deltaproteobacteria terdiri atas bakteri pembentuk badan buah, yaitu Myxobacteria. Bakteri tersebut ditemukan di tanah dan bahan-bahan organik yang membusuk. Kelompok Epsilonproteobacteria diantaranya dua anggota kelompok kecil ini merupakan patogen pada manusia. Contohnya, Helicobacter pylori yang menyebabkan tukak lambung dan Campylobacter jejuni yang menyebabkan gangguan gastrointestinal (Siregar, 2008).

54 V. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan Dari hasil penelitian diperoleh beberapa kesimpulan, yaitu : 1. Telah diperoleh 29 isolat bakteri pelarut fosfat dari hasil isolasi tanah Kebun Percobaan IPB Cikabayan (Bogor, Jawa Barat), Citeureup (Bogor, Jawa Barat), Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT). 2. Berdasarkan kemampuan dalam menghasilkan enzim fosfatase dan IAA tertinggi diperoleh tiga isolat terpilih pada masing-masing daerah asal sampel tanah (Bogor, NTB, dan NTT), yaitu isolat P 3.5 (NTT), P 6.2 (NTB), dan P 10.1 (Citeureup, Bogor). 3. Semua isolat bakteri pelarut fosfat yang diperoleh merupakan bakteri Gram negatif. Isolat P 3.5 (NTT) dan isolat P 10.1 (Citeureup, Bogor) merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk kokus atau bulat, sedangkan isolat P 6.2 (NTB) merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk basilus atau batang. 4. Isolat P 10.1 memiliki kemampuan melarutkan P tertinggi dengan indeks pelarutan (IP) terbesar, yaitu 1.80, kandungan enzim fosfatase tertinggi ( ppm), dan penurunan ph tertinggi pada setiap pengamatan. 5. Hasil analisis sekuen gen 16S rrna menunjukkan bahwa isolat P 3.5 dan isolat P 10.1 memiliki kemiripan sebesar 98% dengan Gluconacetobacter sp. strain Rh1-MS-CO pada data GenBank, sedangkan isolat P 6.2 memiliki kemiripan sebesar 97% dengan Enterobacter sp. strain pp9c pada data GenBank Saran Perlu dilakukan penelitian yang lebih lanjut dengan mengaplikasikan bakteri pelarut fosfat (BPF) pada tanaman dan pengujian patogenisitas bakteri pelarut fosfat (BPF) pada tanaman. Selain itu, perlu diteliti pula efisiensi penggunaan bakteri pelarut fosfat (BPF) dibandingkan dengan pupuk P kimia.

55 VI. DAFTAR PUSTAKA Alexander, M Introduction to Soil Microbiology. 2 nd Ed. Willey Eastern Limited. New Delhi. Anonim Siklus Biogeokimia. Pendamping/Praweda/Biologi?003220Bio%201-7c.htm [diakses tanggal 25 Juni 2009]. Anonim Marker Molekuler. [diakses tanggal 23 November 2009]. Anonim Mikroorganisme Meningkatkan Efisiensi Pemupukan Fosfat. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanah dan Agroklimat. Bogor. Anonim [diakses tanggal 1 April 2009]. Atlas, R.M Principles of Microbiology. 2 nd Ed. WNC Browm. Iowa. Carr, S.M The Polymerase Chain Reaction. [diakses tanggal 12 September 2009]. Elfiati, D Peranan Mikroba Pelarut Fosfat terhadap Pertumbuhan Tanaman. Jurusan Kehutanan. Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara [diakses tanggal 25 Oktober 2008]. Gordon, S.A. and K.J. Weber Colorimetric estimation of indole acetic acid. Plant Physiol. 26: Hadioetomo, R.S Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta. Havlin, J.L., J.P. Beaton., S.L. Tisdale., and W.L. Nelson Soil Fertility and Fertilizers, an Introduction to Nutrient Management. 6 th. Prentice Hall. New Jersey. Illmer, P., Barbato, A., and Schinner, F Solubilization of hardly-soluble AlPO 4 with P-solubilizing microorganisms. Soil Biol. Biochem. 27: Jusuf, M Genetika I : Struktur dan Ekspresi Gen. Infomedika. Jakarta. Lazo, G.R., Roeffey R., and Gabriel, D.W Conservation of plasmid DNA sequences and pathovar identification of strains Xanthomonas camprestis. Phytopathol. 77:

56 43 Lehninger, A.L Dasar-dasar Biokimia. Jilid 3. Terjemahan Maggy Thenawijaya dari Principles of Biochemistry. Erlangga. Jakarta. Madigan, M.T., and Martinko, J.M Brock Biology of Microorganisms. Edisi ke-12. Pearson Prentice Hall. New Jersey. Marchesi, J.R., et al Desaign and evaluation of useful bacterium spesific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rrna. Appl. Enviro. Microbial. 64: Muladno Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor. Narsian, V., and Patel, H Aspergillus aculeatus as a rock phosphate solubilizer. Soil Biol. Biochem. 32: Pangastuti A Definisi spesies berdasarkan urutan basa gen penyandi 16S rrna dan gen penyandi protein. Biodiversitas 7: Pelczar, M.J., dan E.C.S. Chan Dasar-Dasar Mikrobiologi. Terjemahan Ratna Siri Hadioetomo, Teja Imas, S. Sutarmi Tjitrosomo, Sri Lestari Angka dari Elements of Microbiology. UI Press. Jakarta. Premono, E.M Jasad Renik Pelarut Fosfat, Pengaruhnya terhadap P Tanah dan Efisiensi Pemupukan P Tanaman Tebu [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Rachmiati, Y Bakteri pelarut fosfat dari rizosfer tanaman dan kemampuannya dalam melarutkan fosfat. Prosiding Kongres Nasional VI HITI. Jakarta, Desember Salisbury, F.B. dan C.W. Ross Fisiologi Tumbuhan. Terjemahan D.R. Lukman dan Sumaryono. ITB Press. Bandung. Sari, I.P Analisis Keragaman Genetik Bakteri Endofitik dan Filosfer Padi dengan Teknik ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Shancez, P.A Sifat dan Pengelolaan Tanah Tropika. Jilid 1. Terjemahan Johara T. Jayadinata. ITB Press. Bandung. Siregar, A. Z Biologi Pertanian. Jilid 2. Direktorat Pembinaan Sekolah Menengah Kejuruan, Direktorat Jenderal Manajemen Pendidikan Dasar dan Menengah, Departemen Pendidikan Nasional. Jakarta. Soepardi, G Sifat dan Ciri Tanah. Departemen Ilmu Tanah, Institut Pertanian Bogor. Bogor.

57 44 Subba-Rao, N.S Mikroorganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Terjemahan Susilo H. dari Soil Microorganisms and Plant Growth. UI Press. Jakarta Biofertilizer in Agriculture. Oxford and IBH Publishing Co. New Delhi Advanced of Agricultural Microbiology. Oxford and IBH Publishing Co. New Delhi. Sumarsih, S Diktat Mikrobiologi Dasar. Jurusan Ilmu Tanah. Fakultas Pertanian, UPN Veteran Yogyakarta. Sutanto, R Penerapan Pertanian Organik, Pemasyarakatan dan Pengembangannya. Cetakan ke-6. Kanisius. Yogyakarta. Tabatabai, M.A. and J.M. Bremner Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil Biol. Biochem. 1: Tisdale, S.L., W. L. Nelson, and J. P. Beaton Soil Fertility and Fertilizer. MacMillan Publishing Co. New York. Yuwono, T Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta. Yuwono, T Teori dan Aplikasi: Polymerase Chain Reaction. Penerbit Andi. Yogyakarta.

58 LAMPIRAN

59 46 Lampiran 1. Komposisi medium pertumbuhan bakteri pelarut fosfat Medium Pikovskaya Glukosa : 10.0 gram Ca 3 (PO 4 ) 2 : 5.0 gram (NH 4 ) 2 SO 4 : 0.5 gram NaCl : 0.2 gram MgSO 4.7H 2 O : 0.1 gram KCl : 0.2 gram Yeast Extract : 0.5 gram MnSO 4 : gram FeSO 4.7H 2 O : gram Agar : 15.0 gram Akuades : 1000 ml ph : 6.8

60 47 Lampiran 2. Komposisi bufer untuk pengukuran kandungan enzim fosfatase Modified Universal Buffer (MUB) 5x Tris (hydroxyl methyl) amino methane : gram Maleic acid : gram Citric acid : gram Boric acid : 6.02 gram NaOH (1 N) : 488 ml Akuades : ditera hingga 1000 ml ph : M p-nitrophenol phosphate : Sebanyak gram p-nitrophenol phosphate ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 100 ml Modified Universal Bufer (MUB) 1x.

61 48 Lampiran 3. Komposisi dan cara pembuatan bahan untuk identifikasi molekuler Media Tumbuh Bakteri Luria Bertani (LB) NaCl : 2.0 gram Yeast Extract : 1.0 gram Tripton : 2.0 gram Akuades : 200 ml ph : 7.5 Bahan Isolasi DNA 5 M NaCl Ditimbang sebanyak gram padatan NaCl dan dilarutkan di dalam 50 ml akuades. Selanjutnya larutan disterilisasi dengan autoklaf (121ºC, 1 atm). 0.5 M EDTA ph 8.0 Ditimbang sebanyak gram padatan EDTA dan dilarutkan dalam 25 ml akuades. Larutan diatur agar ph-nya 8.0, kemudian ditambahkan kembali akuades sampai tepat 50 ml. Selanjutnya larutan disterilisasi dengan autoklaf (121ºC, 1 atm). 1 M Tris-HCl ph 8.0 Ditimbang sebanyak gram padatan Tris base dan dilarutkan dalam 25 ml akuades. Larutan diatur agar ph-nya 8.0, kemudian ditambahkan kembali akuades sampai tepat 50 ml. Selanjutnya larutan disterilisasi dengan autoklaf (121ºC, 1 atm). Bufer STE (100 mm NaCl; 10 mm Tris-HCl ph 8.0; 1 mm EDTA ph 8.0) Ke dalam erlenmeyer steril dimasukkan 1.5 ml NaCl, 0.75 ml Tris-HCl ph 8.0, dan 0.15 EDTA ph 8.0, selanjutnya ditambahkan 72.6 ml akuades ke dalam campuran dan diaduk hingga homogen.

62 49 10% SDS ph 7.2 Ditimbang 10 gram padatan SDS dan dilarutkan di dalam 70 ml akuades. Larutan diatur agar ph-nya 7.2, kemudian ditambahkan kembali akuades sampai tepat 100 ml. Selanjutnya larutan disterilisasi dengan autoklaf (121ºC, 1 atm). Bahan Untuk Elektroforesis 10x Bufer TAE Ditimbang 48.4 gram Tris base, 37.2 gram Na 2 EDTA.2H 2 O dan dilarutkan dalam akuades. Kemudian ditambahkan ml Asam asetat glasial, kemudian ditambahkan dengan akuades sampai tepat 1000 ml. Larutan diatur agar ph-nya 8.5. Larutan diaduk sampai homogen. Selanjutnya larutan bufer disterilisasi dengan autoklaf (121ºC, 1 atm). Pengenceran menjadi 0.5x Bufer TAE sebanyak 1 liter M 1 x V 1 = M 2 x V 2 10x bufer TAE x V 1 = 0.5x bufer TAE x 1000 ml V 1 = 500 = 50 ml 10 Maka 50 ml 10x bufer TAE dilarutkan dalam 950 ml akuades steril. Gel agarosa 0.8% Untuk membuat 250 ml gel agarosa 0.8% maka dibutuhkan agarosa : 0.8 x 250 ml = 2 gram 100 Maka 2 gram agarosa dilarutkan dalam 250 ml 0.5x bufer TAE yang telah dibuat kemudian diaduk dan dipanaskan sehingga larutan homogen, kemudian dituang dalam cetakan agar elektroforesis.

63 50 Tabel Lampiran 1. Daftar Sampel Tanah Rizosfer Sumber Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Kode Isolat Sumber Isolat Asal Isolat P 1.1 Tanah rizosfer pohon mahoni Nusa Tenggara Timur P 1.2 Tanah rizosfer pohon mahoni Nusa Tenggara Timur P 1.3 Tanah rizosfer pohon mahoni Nusa Tenggara Timur P 1.4 Tanah rizosfer pohon mahoni Nusa Tenggara Timur P 1.5 Tanah rizosfer pohon mahoni Nusa Tenggara Timur P 2.1 Tanah rizosfer tanaman padi sawah Nusa Tenggara Timur P 2.2 Tanah rizosfer tanaman padi sawah Nusa Tenggara Timur P 2.3 Tanah rizosfer tanaman padi sawah Nusa Tenggara Timur P 2.4 Tanah rizosfer tanaman padi sawah Nusa Tenggara Timur P 3.1 Pasir Sungai Pinti Nusa Tenggara Timur P 3.2 Pasir Sungai Pinti Nusa Tenggara Timur P 3.3 Pasir Sungai Pinti Nusa Tenggara Timur P 3.4 Pasir Sungai Pinti Nusa Tenggara Timur P 3.5 Pasir Sungai Pinti Nusa Tenggara Timur P 3.6 Pasir Sungai Pinti Nusa Tenggara Timur P 4.1 Pasir Sungai Oesaka Nusa Tenggara Timur P 4.2 Pasir Sungai Oesaka Nusa Tenggara Timur P 4.3 Pasir Sungai Oesaka Nusa Tenggara Timur P 4.4 Pasir Sungai Oesaka Nusa Tenggara Timur P 5.1 Tanah rizosfer di bawah pohon Nusa Tenggara Barat durian pakem ungu P 5.2 Tanah rizosfer di bawah pohon Nusa Tenggara Barat durian pakem ungu P 5.3 Tanah rizosfer di bawah pohon Nusa Tenggara Barat durian pakem ungu P 6.1 Tanah rizosfer di bawah pohon Nusa Tenggara Barat durian pakem ungu P 6.2 Tanah rizosfer di bawah pohon Nusa Tenggara Barat durian pakem ungu P 7.1 Tanah rizosfer tanaman kedelai Kebun Percobaan IPB Cikabayan P 8.1 Tanah rizosfer di bawah pohon turi Kebun Percobaan IPB Cikabayan P 8.2 Tanah rizosfer di bawah pohon turi Kebun Percobaan IPB Cikabayan P 9.1 Tanah rizosfer tanaman kedelai Citeurep, Bogor P 10.1 Tanah rizosfer tanaman sereh Citeurep, Bogor

64 51 Tabel Lampiran 2. Komponen Reaksi Untuk Proses PCR No. Komponen Jumlah (µl) 1. ddh2o x Buffer PCR mm dntp mm MgSO Primer 1387-Reverse Primer 63-Forward Taq DNA polimerase Template DNA 1.00 Total 75.0

65 52 Tabel Lampiran 3. Hasil Pengukuran Kurva Standar p-nitrophenol (kandungan enzim fosfatase) Konsentrasi p-nitrophenol (ppm) Absorbansi Kurva Standar p-nitrophenol Absorbans y = x R 2 = Konsentrasi p-nitrophenol (ppm) Gambar Lampiran 1. Kurva standar p-nitrophenol

66 53 Tabel Lampiran 4. Hasil Pengukuran Kurva Standar Indole Acetic Acid (IAA) Konsentrasi IAA (ppm) Absorbansi Kurva Standar IAA Absorbans y = x R 2 = Konsentrasi IAA (ppm) Gambar Lampiran 2. Kurva standar Indole Acetic Acid (IAA)

67 54 (a) (b) (c) (d) (e) Gambar Lampiran 3. Metode penelitian; (a) larutan standar IAA, (b) larutan standar p-nitrophenol, (c) perubahan warna pada medium Pikovskaya setelah diinokulasikan bakteri pelarut fosfat, (d) pengukuran enzim fosfatase dan IAA menggunakan Spectrophotometer, (e) inokulasi bakteri pelarut fosfat pada medium Pikovskaya padat dengan cara disebar

68 55 (a) (b) (c) (d) Gambar Lampiran 4. Peralatan penelitian; (a) perangkat elektroforesis (Mupid- 2plus), (b) perangkat PCR (Swift TM Maxi Thermal Cycler Blocks- ESCO ), (c) Scope UV Transilluminator (Dekstop Gel Imager-SCOPE 21), (d) mikroskop (Olympus)