BAB I PENDAHULUAN. A. Latar Belakang. Kanker payudara, dalam istilah medis biasa disebut carcinoma mammae, sejak

Transkripsi

1 BAB I PENDAHULUAN BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kanker payudara, dalam istilah medis biasa disebut carcinoma mammae, sejak tahun 2013 telah menjadi penyebab kematian tertinggi kedua di Indonesia (Anonim, 2015). Seperti kanker pada umumnya, kanker payudara merupakan suatu keadaan dimana sel, khususnya di payudara, kehilangan kemampuan pengendalian terhadap regulasi maupun fungsi homeostatis sel, sehingga sel akan berproliferasi terusmenerus dan tidak terkendali sampai menimbulkan pertumbuhan jaringan abnormal yang menyebar dan menghancurkan jaringan dan organ-organ lain tubuh. Proses karsinogenesis pada kanker payudara terjadi akibat adanya ekspresi berlebih dari ikatan estrogen pada reseptor estrogen (RE). Ikatan estrogen dengan RE akan menstimulasi proliferasi sel-sel payudara sehingga menimbulkan peningkatan pembelahan sel dan replikasi DNA yang dapat menimbulkan mutasi (Jordan, 2003). Berbagai penelitian dilakukan sebagai upaya menekan angka mortalitas akibat kanker. Studi epidemiologi menunjukkan bahwa konsumsi kedelai (Glycine max L.) pada populasi dengan ras Asia dapat menurunkan insidensi kanker payudara (Barnes et al., 1990). Kedelai telah banyak menarik perhatian peneliti di bidang onkologi karena memiliki kandungan fitoestrogen yang tinggi berupa isoflavon. Fitoestrogen merupakan suatu senyawa yang berasal dari tanaman dan memiliki struktur menyerupai hormon estrogen pada mamalia. Hal tersebut menyebabkan fitoestrogen dapat menggantikan kedudukan estrogen pada RE 1

2 2 sehingga fitoestrogen dapat bekerja sebagai antiestrogen dengan jalan mencegah aktivasi transkripsi gen. Salah satu kelompok senyawa yang termasuk fitoestrogen adalah isoflavon. Genistein, genistin, daidzein, daidzin, glisitein dan glisitin merupakan senyawa isoflavon terbesar dari famili Leguminoceae seperti kedelai (Mense, 2008). Bouker et al. (2000) menyatakan bahwa genistein, salah satu senyawa aglikon isoflavon, berpotensi kuat dalam pencegahan dan pengobatan kanker payudara karena kemampuan antiproliferasinya. Isoflavon pada kedelai terdapat dalam bentuk glikosida sebanyak %, antara lain genistin, daidzin, dan glisitin (Islam et al., 2014). Genistin, sebagai bentuk glikosida dari genistein, diketahui menunjukkan pengaruh yang serupa dengan genistein terhadap proliferasi sel kanker payudara melalui penelitian secara in vivo (Kwon et al., 2007). Penelitian secara in silico juga telah dilakukan untuk mengetahui beberapa senyawa isoflavon yang berpotensi memiliki aktivitas terhadap RE sebagai biomarker prediktif kanker payudara. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa genistein dan genistin memiliki afinitas yang tinggi untuk berikatan dengan RE (Istiyastono dan Yuniarti, 2016). Adanya gugus O-glikosida menjadikan polaritas genistin lebih tinggi dibandingkan genistein. Senyawa dengan polaritas yang tinggi diketahui memiliki permeabilitas sel yang kurang baik. Oleh sebab itu, perlu dilakukan penelitian terhadap aktivitas sitotoksik senyawa genistin secara in vitro untuk mengetahui mekanisme pada penelitian secara in vivo sebelumnya. Hingga saat ini, belum ada penelitian yang membuktikan aktivitas sitotoksik senyawa genistin terhadap sel T47D sebagai model kanker payudara secara in vitro.

3 3 Parameter yang digunakan dalam penelitian ini adalah nilai IC50, yaitu konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian terhadap setengah dari total populasi sel. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan data valid ilmiah untuk pengembangan ilmu pengetahuan mengenai aktivitas sitotoksik senyawa glikosida isoflavon. B. Rumusan Masalah 1) Bagaimana pengaruh pemberian senyawa genistin terhadap morfologi sel kanker payudara T47D? 2) Apakah senyawa genistin menunjukkan adanya aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D secara in vitro? C. Tujuan Penelitian 1) Mengetahui pengaruh pemberian senyawa genistin terhadap morfologi sel kanker payudara T47D. 2) Mengetahui aktivitas sitotoksik senyawa genistin terhadap sel kanker payudara T47D secara in vitro. D. Urgensi Penelitian Penelitian ini penting baik bagi mahasiswa, institusi, ilmu pengetahuan, maupun masyarakat. Bagi mahasiswa dan institusi penelitian ini dapat menjadi salah satu sarana peningkatan kualitas penelitian dan menjadi bahan publikasi pada jurnal ilmiah sehingga dapat menambah kekayaan informasi dan menjadi acuan data untuk pengembangan penelitian selanjutnya. Bagi ilmu pengetahuan,

4 4 penelitian ini menjadi penting karena menjadi sumber informasi dan sumber data yang valid mengenai senyawa isoflavon yang bersifat sebagai agen sitotoksik. Bagi masyarakat, penelitian ini dapat menjadi tambahan sumber informasi mengenai senyawa dengan aktivitas sebagai antikanker payudara. E. Tinjauan Pustaka 1. Kanker Payudara Kanker merupakan suatu penyakit yang ditandai dengan hilangnya fungsi kontrol sel terhadap regulasi daur sel maupun fungsi homeostatis sel pada organisme multiseluler (Lodish et al., 2000). Payudara terdiri dari jaringan duktural, fibrosa yang mengikat lobus-lobus dan jaringan lemak di dalam dan di antara lobus-lobus. Jaringan payudara 85% terdiri dari lemak. Sedikit di bawah pusat payudara dewasa terdapat puting (papilla mamaria), tonjolan yang berpigmen dikelilingi oleh areola (Santi, 2015). Kanker payudara merupakan keadaan malignansi yang berasal dari sel-sel yang terdapat pada duktus payudara pada umumnya ataupun di lobules dan jaringan lain (Ellis et al., 2003). Kanker payudara menjadi penyebab tertinggi kematian perempuan di dunia (Anonim, 2016). Prevalensi kanker payudara cukup tinggi di Indonesia dengan angka kejadian sebesar 40 per perempuan. Berdasarkan data dari Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan Republik Indonesia dalam Buletin Jendela Data dan Informasi Kesehatan 2015, kanker payudara menduduki peringkat kedua sebagai penyebab kematian tertinggi akibat kanker di Indonesia. Pada tahun

5 5 2013, kejadian kanker payudara diperkirakan mencapai jiwa (Anonim, 2015). Berkembangnya suatu kanker payudara pada umumnya berhubungan dengan faktor hormonal dan genetik (Crum, 2003). Keadaan mutase sporadik berhubungan dengan paparan hormon, jenis kelamin, usia menarche dan menopause, usia reproduktif, riwayat menyusui dan estrogen eksogen. Keadaan kanker umumnya dijumpai pada wanita postmenopause dan overekspresi reseptor estrogen (RE). Overekspresi RE pada 70% kasus kanker payudara menjadikan RE biomarker prediktif utama dari suatu kanker payudara (Levin, 2005). Reseptor estrogen merupakan salah satu anggota reseptor inti yang memperantarai aksi hormon estrogen di dalam tubuh. Estrogen bekerja meregulasi pertumbuhan dan diferensiasi sel-sel sistem reproduksi baik pada wanita dan pria. Pada sisi lain, estrogen dapat memicu pertumbuhan, proliferasi dan metastase kanker payudara (Ikawati, 2014). Proses pengikatan hormon estrogen pada RE di membran sel terjadi melalui pembentukan dimer. Setelah hormon berikatan dengan reseptornya, reseptor berpindah ke inti sel dan kemudian reseptor tersebut berikatan ERE (estrogen response element) dan kompleks tersebut akan berikatan dengan koaktivator sehingga faktor transkripsi menjadi aktif kemudian dapat mengubah ekspresi gen. Regulasi transkripsi gen akan menghasilkan suatu protein spesifik yang terlibat dalam fungsi biologis tertentu (Putra et al., 2008). Proses karsinogenesis pada kanker payudara terjadi melalui ikatan estrogen pada RE dengan menstimulasi proliferasi sel-sel payudara yang dapat menimbulkan peningkatan pembelahan sel dan replikasi DNA sehingga menimbulkan mutasi

6 6 (Jordan, 2003). Salah satu titik tangkap pengobatan kanker, khususnya kanker payudara, adalah dengan menghambat aktivitas estrogen pada RE sehingga proliferasi sel dapat dihambat (Molteni et al., 1995). 2. Genistein dan Genistin Genistein (Gambar 1) merupakan suatu senyawa fitoestrogen dan tergolong dalam kelompok isoflavon. Fitoestrogen adalah senyawa yang berperilaku seperti estrogen alami dalam tubuh ketika kadar estrogen kita rendah. Hal ini disebabkan karena fitoestrogen memiliki struktur yang mirip dengan estrogen dalam tubuh. Fitoestrogen mampu berkompetisi dengan estrogen yang berasal dari dalam tubuh kita sehingga estrogen tidak mampu berikatan dengan RE dan proliferasi sel kanker pun dapat dihambat (Mense et.al., 2008). Gambar 1. Struktur Genistein (Mense, 2008) Genistein ditemukan pertama kali pada tahun 1899 dan disintesis pertama kali pada tahun Genistein, yang ditemukan tinggi kandungannya dalam tanaman, utamanya famili Leguminoceae seperti kedelai (Glycine max L.), telah menarik perhatian ilmuan sejak lama. Studi epidemiologi menunjukkan bahwa konsumsi kedelai dapat menurunkan insidensi kanker pada populasi dengan ras Asia (Barnes et al., 1990). Hasil studi epidemiologi tersebut kembali diperkuat dengan studi yang

7 7 dilakukan oleh Guha et al. (2009) yang menyatakan wanita yang didiagnosa kanker payudara menunjukkan penurunan risiko ketika mengonsumsi kedelai secara rutin. Studi in vitro terhadap genistein menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki aktivitas sebagai agen kemopreventif, antineoplastik, aktivitas antioksidan, penghambatan proliferasi sel dan angiogenesis (Fotsis et al., 1997). Bouker et al. (2000) menyatakan bahwa genistein berpotensi kuat dalam pencegahan dan pengobatan kanker payudara dikarenakan kemampuan penghambatan proliferasinya. Genistein telah banyak menuai perhatian sehubungan dengan potensinya sebagai antiestrogenik dan kemampuan menghambat beberapa enzim terkait karsinogenesis. Genistein dengan aktivitas antiestrogenik, mampu berkompetisi dengan estrogen yang berasal dari dalam tubuh, sehingga estrogen tidak mampu berikatan dengan RE dan proliferasi sel kanker pun dapat dihambat (Molteni et al., 1995). Gambar 2. Struktur Genistin (Ji et al., 1999) Selain genistein, isoflavon paling besar yang terkandung dalam kedelai antara lain genistin, daidzein, daidzin, glisitein dan glisitin. Genistin merupakan suatu bentuk glikosida dari genistein (Ji et al., 1999). Genistin pertama kali diisolasi pada

8 8 tahun 1931 dari ekstrak methanol kedelai (Walter, 1941). Genistin (Gambar 2) memiliki gugus O-glikosida yang menjadikan genistin memiliki polaritas yang lebih tinggi dibandingkan senyawa aglikonnya yaitu genistein. Genistin sebagai fitoestrogen, seperti halnya genistein, juga menunjukkan adanya pengaruh terhadap proliferasi sel kanker payudara melalui penelitian secara in vivo (Allred, 2001). Penelitian secara in silico juga telah dilakukan untuk mengetahui beberapa senyawa isoflavon yang berpotensi memiliki aktivitas terhadap RE sebagai biomarker prediktif kanker payudara. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa genistein dan genistin memiliki afinitas yang tinggi untuk berikatan dengan RE (Istyastono dan Yuniarti, 2016). 3. Sel T47D American Type Culture Collection (2012) menyatakan sel T47D merupakan continous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Epitelial substrain dari sel T47D yang mengalami diferensiasi, diketahui memiliki cytoplasmic junction dan reseptor terhadap 17-βestradiol, kalsitonin, dan steroid lain seperti glukokrtikoid, prolaktin, progesteron, dan androgen. Sel T47D digunakan secara luas dalam penelitian kanker payudara secara in vitro karena mudah penangannya, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas tinggi serta mudah diganti dengan frozen stock jika terjadi kontaminasi (Holliday dan Speirs, 2011). Seperti halnya sel kanker payudara MCF-7, sel T47D memiliki ekspresi RE+ hormone dependent breast cancer cell line. Selain responsif terhadap reseptor

9 9 estrogen, sel T47D dalam kondisi pengkulturan normal juga mengekspresikan resptor progesteron secara konstitusif (Holliday dan Speirs, 2011). Sel dapat mengalami kehilangan reseptor estrogen bila mengalami deprivasi estrogen jangka panjang secara in vitro (Schafer et al., 2000). A B Gambar 3. Sel T47D yang Dibiakkan dalam Media Setelah 1 Hari (A) dan 7 Hari (B) (American Type Culture Collection, 2012)

10 10 Sel kanker payudara T47D mengekspresikan protein p53 yang termutasi. Misssence mutation terjadi pada residu 194 (dalam zinc-binding domain, L2), sehingga p53 tidak dapat berikatan dengan respon elemen pada DNA. Hal ini mengakibatkan berkurang bahkan hilangnya kemampuan p53 untuk regulasi siklus sel. Oleh sebab itu, sel T47D seringkali digunakan sebagai model kanker payudara untuk penelitian resistensi obat terinduksi tamoxifen pada pasien dengan mutan p53 (Schafer et al., 2000). Perlakuan terhadap sel T47D dengan suatu senyawa yang memiliki aktivitas sitotoksik akan menyebabkan perubahan morfologi hingga kematian sel T47D. Morfologi sel T47D yang hidup dalam kondisi pertumbuhan optimum akan menyerupai sel epitel seperti pada Gambar Sistem Transpor Membran Sel Membran sel merupakan lapisan yang melindungi inti sel dan sitoplasma, serta membungkus organel-organel di dalam sel. Membran sel memegang peranan penting sebagai lalu lintas molekul dan ion secara dua arah. Komponen penyusun membran sel antara lain adalah fosfolipid, protein, oligosakarida, glikolipid, dan kolesterol (Alberts et al., 2002). Membran sel memiliki bagian kepala polar hidrofilik dengan daya ikat gliserofosforilester yang terdiri dari gliserol, fosfat, dan gugus tambahan seperti kolina, serina dengan dua rantai hidrofobik asam lemak yang membentuk ikatan ester. Membran sel (Gambar 4) berbentuk layar ganda atau double layer dimana masing-masing layar memiliki bagian hidrofobik dan hidrofilik. Oleh karena itu,

11 11 membran sel dikenal dengan sebutan membran lipid bilayer (Alberts et al., 2002). Molekul-molekul yang dapat melewati membran sel antara lain molekul hidrofobik seperti karbon dioksida (CO2) dan oksigen (O2) serta molekul polar yang sangat kecil seperti air dan etanol. Sementara itu, molekul lain seperti ion, substansi hidrofilik, dan molekul polar dengan ukuran besar misalnya glukosa membutuhkan mekanisme khusus agar dapat masuk ke dalam sel (Watson, 2015). Lalu lintas membran terbentuk akibat banyaknya molekul yang masuk dan keluar membran. Lalu lintas membran (Gambar 5) dapat digolongkan menjadi dua, yaitu transpor pasif untuk molekul-molekul yang mampu melalui membran tanpa mekanisme khusus dan transpor aktif untuk molekul yang membutuhkan mekanisme khusus (Watson, 2015). a. Transpor Pasif Gambar 4. Membran Sel (Alberts et al., 2002)

12 12 Transpor pasif merupakan suatu perpindahan molekul menuruni gradien konsentrasinya. Transpor pasif merupakan mekanisme transpor yang tidak memerlukan energi dan terjadi secara spontan. Transpor terjadi akibat perbedaan konsentrasi antara zat dengan pelarutnya. Bergerak dari konsentrasi zat yang lebih tinggi (hipertonis) ke konsentrasi zat yang lebih rendah (hipotonis). Difusi, osmosis, dan difusi terfasilitasi merupakan contoh transpor pasif (Watson, 2015). Difusi merupakan pergerakan acak molekul dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi yang lebih rendah. Difusi bertujuan untuk mencapai keseimbangan konsentrasi antara zat dengan pelarutnya. Selain itu, difusi juga berperan dalam peristiwa pertukaran materi dari suatu sel dengan lingkungannya (Alberts et al., 2002). Kecepatan difusi bergantung pada beberapa aspek, diantaranya adalah: 1) Wujud materi, semakin besar ikatan antar molekul, makin lama difusi terjadi (padat lebih sulit melakukan difusi). 2) Suhu, semakin tinggi suhu, maka ikatan antar molekul akan cepat terputus. Hal itu menyebabkan difusi menjadi cepat. 3) Ukuran molekul, molekul yang berukuran kecil akan lebih mudah untuk melintasi suatu membran dari pada molekul yang besar pada suhu yang sama. 4) Konsentrasi, semakin besar perbedaan konsentrasi antara zat dan pelarutnya, atau perbedaan konsentrasi zat pada dua tempat yang berbeda, menyebabkan semakin besar rata-rata difusinya (Watson, 2015). Difusi terfasilitasi merupakan mekanisme transpor yang dibantu oleh proteinprotein tertentu dalam membran plasma. Protein-protein tersebut membentuk

13 13 struktur menyerupai saluran-saluran, sehingga molekul bisa melintasi membran sel. Beberapa protein ada yang berikatan dengan suatu molekul dan melintasi membran plasma. Bentuk protein yang demikian disebut sebagai protein pembawa (carrier protein). Protein pembawa juga merentangkan membran sel sehingga menyediakan suatu mekanisme untuk pergerakan molekul. Difusi terfasilitasi melibatkan difusi dari molekul polar dan ion melewati membran dengan bantuan protein pembawa. Difusi terfasilitasi juga merupakan transpor pasif karena hanya mempercepat proses difusi dan tidak merubah arah gradien konsentrasi. Kemampuan suatu senyawa untuk menembus membran diukur dengan permeabilitas sel. Permeabilitas sering dinyatakan sebagai fluks atau koefisien permeabilitas (Alberts et al., 2002). Gambar 5. Sistem Transpor Membran Sel (Watson, 2015) Secara umum, senyawa yang mengandung gugus gula akan memiliki polaritas yang lebih tinggi dibandingkan dengan senyawa yang telah mengalami hidrolisis

14 14 menjadi senyawa aglikonnya. Podolak et al. (2010), dalam penelitiannya menyebutkan bahwa dioscin, suatu jenis senyawa saponin, menunjukkan terjadinya penurunan aktivitas sitotoksik secara signifikan dibandingkan senyawa diosgenin yang merupakan senyawa aglikonnya. Dioscin, yang terbentuk akibat asetilasi gugus hidroksi pada senyawa diosgenin, memiliki permeabilitas sel yang kurang baik akibat adanya gugus gula pada senyawa tersebut, sehingga dioscin tidak mudah melintasi membran lipid bilayer. b. Transpor Aktif Transpor aktif merupakan kebalikan dari transpor pasif dan bersifat tidak spontan. Arah perpindahan dari transpor aktif adalah melawan gradien konsentrasi sehingga mekanisme transpor aktif memerlukan energi untuk membawa molekul melawan gradien konsentrasi. Transpor aktif sangat diperlukan untuk memelihara keseimbangan molekul-molekul di dalam sel. Sumber energi untuk transpor aktif adalah ATP (adenosin trifosfat). Transpor aktif hampir sama dengan difusi terfasilitasi, namun berbeda pada protein pembawa (carrier protein). Transpor aktif memerlukan energi agar bisa melakukan transportasi melawan konsentrasi. Contoh protein yang terlibat dalam transpor aktif ialah channel protein dan carrier protein, serta ionophore. Transpor aktif terbagi atas transport aktif primer dan sekunder (Watson, 2015). Transpor aktif primer merupakan jenis mekanisme transpor aktif yang memerlukan energi dalam bentuk ATP secara langsung untuk membawa molekul melawan gradien konsentrasi. Transpor aktif sekunder memiliki energi yang bebas dipakai karena mekanisme ini menggunakan energi secara berkala. Energi yang

15 15 tersimpan dalam mekanisme ini dalam bentuk gradien konsentrasi ion. Pada transpor aktif sekunder, terjadinya bergantung kepada potensi membran yang ada dan bergantung pada adanya transpor aktif sekunder (Watson, 2015). F. Landasan Teori Berkembangnya suatu kanker payudara pada umumnya dijumpai pada wanita postmenopause dan overekspresi ikatan estrogen dengan reseptor estrogen (RE) yang berkaitan dengan faktor genetik dan hormonal. Aktivitas hormon estrogen dalam mengaktivasi RE menyebabkan mutasi atau perusakan DNA-radikal bebas yang akhirnya menyebabkan proliferasi lesi premaligna menjadi suatu maligna. Berbagai penelitian dilakukan sebagai upaya penemuan obat kanker payudara. Salah satu senyawa yang banyak menuai perhatian sehubungan dengan aktivitasnya sebagai antiestrogen adalah senyawa genistein. Genistein dapat bertindak sebagai antiestrogen dengan jalan mencegah terjadinya ikatan estrogen pada RE yang dapat menyebabkan proliferasi berlebih pada keadaan kanker payudara. Sebanyak % isoflavon pada kedelai terdapat dalam bentuk glikosida. Genistin, yang merupakan bentuk glikosida genistein, diketahui memiliki aktivitas serupa dengan genistein dalam mempengaruhi proliferasi sel kanker payudara melalui penelitian secara in vivo, namun polaritas genistin yang lebih tinggi akibat adanya gugus O-glikosida akan menyebabkan permeabilitas genistin kurang baik dibanding senyawa genistein. Penelitian secara in silico menunjukkan bahwa baik genistein maupun genistin dapat membentuk kompleks dengan RE. Oleh sebab itu, perlu dilakukan penelitian terhadap aktivitas sitotoksik senyawa genistin secara in

16 16 vitro terhadap sel T47D sebagai model kanker payudara. Sel T47D mengekspresikan RE/RP+ dan protein p53 yang termutasi sehingga kemampuan regulasi siklus sel berkurang atau bahkan hilang. Perlakuan terhadap sel T47D dengan suatu senyawa yang memiliki aktivitas sitotoksik akan menyebabkan perubahan morfologi hingga kematian sel T47D. G. Hipotesis Berdasarkan landasan teori yang telah dipaparkan sebelumnya, maka dapat dihipotesiskan bahwa: 1) Pemberian senyawa genistin terhadap sel kanker payudara T47D secara in vitro tidak menyebabkan perubahan signifikan pada morfologi sel. 2) Senyawa genistin memiliki aktivitas sitotoksik yang sangat lemah dibandingkan dengan senyawa aglikonnya, genistein, pada sel kanker payudara T47D secara in vitro.