2/23/2010 PEMISAHAN BIOKIMIAWI PIGMEN MATA KROMATOGRAFI KERTAS DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PENDAHULUAN PENDAHULUAN

Transkripsi

1 Praktikum Genetika 25 Februari 2010 PENDAHULUAN PEMISAHAN BIOKIMIAWI PIGMEN MATA KONTROL EKSPRESI GEN DENGAN KROMATOGRAFI KERTAS DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Laboratorium Genetika Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia Depok 2 PENDAHULUAN CENTRAL DOGMA One gene-one enzyme One gene-one polypeptide Hipotesis One Gene One Enzyme Satu gen bertanggung jawab terhadap pembentukan satu enzim yang spesifik. Enzim yang dipelajari terdiri atas satu polipeptida, tetapi ada enzim lain yang terdiri atas satu atau lebih rantai polipeptida. Oleh karena itu, hipotesis tersebut diperbaharui menjadi hipotesis One Gene One Polypeptide 4 terhambatnya ekspresi suatu enzim Mutasi pada gen Metode untuk memisahkan, mengidentifikasi dan menentukan komponen kimia dalam suatu normal mutan campuran berdasarkan tingkat yang berbeda Prinsip kromatografi adalah interaksi molekul Enzim terekspresi secara normal Enzim terekspresi secara abnormal yang berbeda melalui medium stasioner (fase diam) di bawah pengaruh fase gerak. Kromatografi 1

2 ADSORPTION Berdasarkan fase stasioner, kromatografi dibagi menjadi empat macam yaitu: merupakan kompetisi antara fase stasioner padat dengan fase gerak cair Adsorption chromatography Partition chromatography PC TLC Ion exchange chromatography Permeation chromatography PARTITION ION EXCHANGE merupakan kompetisi antara fase stasioner cair dengan fase gerak cair merupakan kompetisi antara fase resin penukar ion dengan fase gerak cair. IEC HPLC HPLC banyak digunakan dalam analisis kimia, karena memiliki kemampuan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan menghitung kuantitas komponen 9 pada berbagai sampel yang dapat dilarutkan pada zat cair. PERMEATION Merupakan kompetisi antara matriks polimer dengan fase gerak cair. Alasan penggunaan Kromatografi kertas Prosedur sederhana dan lebih cepat GPC Dapat digunakan untuk berbagai sampel Kecepatan pemisahan tinggi karena pori-pori rapat Harga relatif lebih murah Sensitifitas tinggi 2

3 KROMATOGRAFI KERTAS Hadorn & Mitchell menemukan metode untuk meneliti perbedaan kimiawi pigmen mata antara normal dan mutan, yaitu dengan kromatografi kertas Pemisahan berdasarkan perbedaan daya larutnya atau daya adsorbsinya dalam larutan yang bergerak melalui pori-pori kertas akibat gaya kapilaritas. Fase diam berupa kertas/planar layer, sedangkan fase gerak berupa zat cair. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Perbedaan antara kromatografi kertas dan lapis tipis Prosedur sederhana dan cepat yang memberikan jawaban PC TLC Lempengan TLC terbuat dari lembaran plastik, logam, atau Kerapatan rendah Kerapatan tinggi kaca yang dilapisi dengan adsorben padat. Umumnya Kecepatan rendah Kecepatan tinggi Sensitivitas rendah Sensitivitas tinggi Tidak dilapisi aluminium/silika dilapisi aluminium/silika Lebih murah Lebih mahal tentang jumlah komponen di dalam campuran. berupa silika (SiO2) atau alumina (Al2O3). JALUR PEMBENTUKAN PIGMEN MATA Pigmen mata Normal 2-amino-4hydroxypteridine tetrathydroisopterin xanthopterin isoxanthopterin biopterin sepiapterin drosopterin isoxanthopterin 18 3

4 Mutan white Mutan scarlet Jalur Ommochrom Mutan brown 19 Pigmen mata normal 20 Pigmen mata mutan? ALAT Pengaduk kaca Kaca mata pelindung UV Botol Selai Gunting Kertas Karbon Sumber UV Pensil & Penggaris Tujuan Praktikum: untuk mengetahui pigmen mata Drosophila melanogaster mutan menggunakan kromatografi kertas BAHAN normal dan mutan (berkelamin betina) Pelarut berupa campuran 28% ammonium hidroksida (NH4OH) dan n-propil alkohol (1:1). Kertas kromatografi disiapkan Mata digerus Kertas saring Whatman no 1 (PC) atau kertas silika (TLC). Dietil Eter Botol selai ditutup dengan kertas karbon simpan selama 90 menit Pelarut dan kertas dimasukkan ke dalam botol selai 4

5 Perhitungan Nilai Rf: Retention Factor adalah parameter yang digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan karakteristik spesifiknya. Rf diukur Rf (retention factor) dihitung dengan mengukur: Jarak pergerakan sampel dibagi dengan Jarak pergerakan larutan (fase gerak)