KAJIAN PUSTAKA Karakter Tibouchina

Transkripsi

1 KAJIAN PUSTAKA Karakter Tibouchina Genus Tibouchina (sinonim dengan Chaetogastra, Hephestionia, Itatiaia, Lasiandra, Micranthella, Oreocosmus, Pleroma, Purpurella) terdiri dari 300 spesies (Faravani & Bakar 2007). Tibouchina biasa dikenal dengan nama princess flower, glory bushes atau kadang-kadang glory trees (Judd et al. 2005; Faravani & Bakar 2007). Tanaman ini merupakan tanaman asli di hutan hujan Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan, terutama Brazil. Namanya berasal dari adaptasi tempat asalnya yaitu Guiana (Faravani & Bakar 2007). Tibouchina merupakan anggota famili Melastomaceae (di dalam literatur biasa ditulis Melastomataceae), merupakan tanaman dikotil berbunga, berbiji tertutup (angiospermae). Famili melastomataceae terdiri dari 3000 spesies di neotropika, 1000 di Asia tropis, 240 di Afrika, 225 di Madagaskar ( genus), dan 70 di Thailand (15 genus) (Renner et al. 2001). Melastomataceae kemudian menyebar di India, Australia, Sri Lanka, Asia Tenggara termasuk Filipina dan Taiwan, sampai Papua New Guinea, Pulau Pasifik, Mauritius, Jamaica, dan Amerika Serikat (Renner 1993). T. langsdorffiana digunakan sebagai tanaman hias karena nilai estetikanya yaitu warna bunga ungu cerah yang sangat menarik. Sebagian besar Melastomataceae dan Memecylaceae memiliki warna bunga ungu, bervariasi dari merah muda sampai magenta. Sebagai contoh, warna bunga ungu umumnya ditemui pada Dichaetanthera, Meriania, Mouriri, Rhynchanthera dan Tibouchina, dimana kebanyakan merupakan akumulator Al (Jansen et al. 2002). Tanaman ini tumbuh dengan baik pada tanah yang bersifat asam. Jika tanah tidak cukup asam, ujung daun akan seperti terbakar, kemudian menjadi coklat atau bahkan daun akan mati. Jika hal itu terjadi, keasaman tanah dibuat dengan menambahkan sulfur ke tanah di sekitar akar, atau menggunakan pupuk yang bersifat asam. Tanaman ini tidak perlu dipangkas, karena dapat tumbuh menjadi pohon besar ( Tibouchina yang berupa semak cantik yang banyak tumbuh di daerah tropis Amerika latin mirip sekali dengan Dissotis canescens yang masih sekerabat

2 4 yaitu memiliki ciri-ciri semak berkayu lembut, mencapai tinggi 1.5 m dengan lebar tajuk 1 m, bunganya yang besar dan berwarna magenta muncul di bulan Desember sampai April, bunganya unik karena memiliki dua set benang sari yang berbeda satu dengan yang lain, lima di antaranya panjang berwarna ungu dengan ujung melengkung sementara lima lainnya lebih pendek dan berwarna kuning ( Perbanyakan T. langsdorffiana ini melalui stek secara vegetatif karena tanaman ini tidak menghasilkan biji. Berbunga melimpah antara bulan Mei sampai Januari. Spesies T. langsdorffiana biasanya memiliki daun yang berbulu halus dengan tulang daun yang menonjol dan memperlihatkan warna bunga ungu menarik sehingga ditanam sebagai hiasan. Nama lokal tanaman ini di kalangan penjual tanaman hias, dikenal dengan nama violet, tibocina/tebocina (Sunda). Kedudukan T. langsdorffiana dalam taksonomi adalah sebagai berikut: Domain Kingdom Subkingdom Filum Kelas Subkelas Ordo Famili Genus Spesies : Eukariota : Plantae : Viridaeplantae : Magnoliophyta : Magnoliopsida : Rosidae : Myrtales : Melastomataceae : Tibouchina : Tibouchina langsdorffiana Baill T. langsdorffiana merupakan tanaman perennial, termasuk herba, semak, atau pohon, tegak, dengan tinggi 0.5 m sampai 25 m (Gambar 1a), daun tunggal (Gambar 1b), bertangkai, duduk daun berhadapan, pertulangan daun menyirip, ujung runcing, pangkal tumpul, tepi rata, bentuk lanset, permukaan bersisik. Bunga T. langsdorffiana merupakan bunga terbatas tipe malai rata (corymbiform cyme) dengan jumlah bunga 5-25 kuntum bunga (Gambar 1c), kelopak (sepal) berjumlah 5 saling bebas, mahkota (petal) berjumlah 5 saling bebas (Gambar 1d), simetri bunga beraturan (actinomorph), benang sari berjumlah 10 saling bebas

3 5 (polyandrous) dengan panjang sama, tipe perlekatan tangkai sari dengan kepala sari yaitu versatile, tipe putik syncarp karena memiliki 5 buah karpel yang dipisahkan oleh sekat (septum), tipe kepala putik clavate, sedangkan tipe tangkai putik geneculate (Gambar 1e). Tipe plasentasi bakal buah axial (Gambar 1f), dan merupakan bakal buah tenggelam (inferior), tetapi dalam perkembangannya, bakal buah beserta biji di dalamnya akan gugur sehingga tanaman ini tidak menghasilkan buah dan biji. a 20 cm b 2 cm c 2 cm d 2 cm e 1 mm f 1 mm Gambar 1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana: a. tanaman berupa semak berkayu; b. daun tunggal; c. tipe malai cabang bunga; d. tipe kelopak dan mahkota bunga; e. tipe benang sari dan putik bunga; f. plasentasi bakal buah.

4 6 Pustaka Genom Suatu pustaka gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuen (urutan) DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah di klon ke dalam vektor tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan dan analisisnya. Pada dasarnya terdapat dua macam pustaka gen yang dapat dikonstruksi, tergantung sumber DNA yang digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebut pustaka genom. Sementara itu, jika DNA yang digunakan merupakan hasil transkripsi balik suatu populasi mrna, maka pustaka yang diperoleh dinamakan pustaka complementary DNA (cdna). Hasil pengklonan seluruh DNA total dari spesies tertentu disebut dengan pustaka genom. Pustaka genom sangat bermanfaat dalam usaha isolasi dan karakterisasi suatu gen (Cross et al. 1999; Suharsono et al. 2003), dan juga untuk pemetaan gen secara fisik. Pustaka genom dapat dibuat melalui sintesis cdna dari mrna atau DNA genom. Vektor yang diperlukan dalam pembuatan pustaka genom dapat berupa bakteriofage, P1 artificial chromosome (PAC), yeast artificial chromosome (YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), atau kosmid, bergantung pada ukuran panjang fragmen DNA (Wahyudi 2001). Pada penelitian ini dipakai vektor pengklonan yaitu fage lambda ( BlueSTAR-1 (Novagen 1997). Fage BlueSTAR-1 adalah vektor yang didesain untuk membuat pustaka genom DNA dengan efisiensi kloning fragmen DNA berukuran 7-20 kb. Vektor mengandung gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxp yang digunakan untuk autosubkloning (Novagen 1997). Konstruksi pustaka genom diawali dengan isolasi DNA total. DNA total biasanya dipotong secara parsial menggunakan enzim restriksi Sau3AI atau enzim lain disesuaikan dengan situs yang terdapat pada vektor yang akan digunakan dalam konstruksi pustaka agar mendapatkan fragmen DNA yang berukuran besar. Pemotongan parsial ini menghasilkan fragmen berukuran besar karena tidak semua situs pengenalan suatu enzim restriksi dalam rantai DNA genom terpotong oleh enzim restriksi yang bersangkutan. Fragmen DNA berukuran besar ini kemudian disisipkan ke dalam vektor yang telah dipotong dengan enzim restriksi

5 7 tertentu sehingga hasil potongannya cocok dengan fragmen DNA. Untuk menghindari adanya penyatuan kembali (religasi) ujung-ujung potongan biasanya dimodifikasi dengan penambahan nukleotida tertentu (fill-in). Dalam mengkonstruksi pustaka genom DNA, DNA umumnya dipotong dengan enzim restriksi yang mengenali situs yang terdiri dari 4 pasang basa (pb) (contohnya Sau3AI). Pengenalan dan pemotongan sekuen 4 pb yang spesifik ini akan terjadi rata-rata sekali setiap 4 4 = 256 pb. Untuk meningkatkan kemungkinan semua daerah genom berhasil diklonkan dan terkandung dalam pustaka genom, DNA genom biasanya dipotong secara parsial untuk menghasilkan fragmen restriksi yang saling tumpang tindih (overlapping) yang berukuran besar, sekitar 20 kb. Vektor fage dapat menampung sekitar 20 kb. Bakteriofage Lambda Bakteriofage (atau fage) adalah virus yang menginfeksi bakteri. Satuan dasar virus disebut virion. Virion fage memiliki kepala, yang mengandung genom DNA virus, dan sebuah ekor, yang berfungsi menginfeksi sel inang Escherichia coli (E. coli). Virus hanya dapat memperbanyak diri jika berada di dalam suatu sel inang yang sesuai. Jika berada di luar suatu sistem selular, virus tidak mampu memperbanyak diri karena tidak mempunyai sistem enzim yang dapat digunakan untuk mensintesis partikel virus baru. Diameter virus bervariasi dari nm sehingga ukurannya lebih kecil dari sel prokariot yang paling kecil (Yuwono 2008). Bahan genetik virus ada yang berupa molekul DNA dan ada yang berupa RNA. Molekul DNA dan RNA tersebut ada yang berupa molekul untai tunggal dan ada yang berupa molekul untai ganda. Ekspresi genetik virus dilakukan dengan menggunakan sistem enzim yang ada di dalam sel inang. Salah satu jenis bakteriofage yang biasa digunakan sebagai vektor pengklonan adalah bakteriofage. Bakteriofage merupakan virus bakterial yang telah banyak diteliti, dan telah diketahui secara luas mengenai genetika dan biologi molekulernya. Urutan lengkap basa nukleotida bakteriofage ini sudah diketahui. Genom bakteriofage berupa DNA untai ganda linier yang terdiri atas pb (Chauthaiwale et al. 1992). Molekul DNA bakteriofage ini mempunyai

6 8 struktur yang unik karena pada kedua ujungnya terdapat 12 basa tambahan berupa molekul DNA untai tunggal. Kedua ujung molekul DNA tersebut dapat membentuk ikatan komplementer jika terjadi pelingkaran DNA, sehingga ujungujung DNA tersebut disebut sebagai ujung kohesif (cohesive ends, disingkat COS) (Chauthaiwale et al. 1992). Fage mempunyai gen-gen penyandi protein yang diperlukan dalam penyusunan kepala dan ekor dan gen-gen yang menyandikan protein yang diperlukan dalam siklus litik yang terdapat di bagian kedua ujung genomnya (Gambar 2). Beberapa daerah di bagian tengah dari genom dapat digantikan oleh DNA eksogen atau dihilangkan tanpa mempengaruhi kemampuan fage λ dalam menginfeksi sel inang dan menyusun virus baru. DNA eksogen yang menyisip diantara gen J dan N bisa berukuran lebih dari 25 kb. Terdapat sekitar 60 gen yang ada di dalam genom λ (Lodish et al. 2000). Gambar 2 Peta genetik bakteriofage (Lodish et al. 2000). Bakteriofage menginfeksi E. coli dengan cara menempel pada suatu reseptor spesifik yang terdapat pada permukaan sel E. coli, kemudian menginjeksikan DNAnya (Dale 1994). DNA linier utas ganda diubah menjadi bentuk sirkuler segera setelah terjadi infeksi. Setelah memasuki sel bakteri, ujung kohesif mengalami perpasangan basa membentuk molekul DNA sirkuler, dimana masih terdapat 2 buah nick pada tempat perpasangan basa tersebut. Kedua nick ini ditutup oleh DNA ligase inang sehingga dihasilkan molekul DNA sirkuler seutuhnya. DNA sirkuler ini berfungsi sebagai cetakan dalam proses transkripsi selama fase infeksi awal (Sambrook et al. 1989). Ketika DNA memasuki sitoplasma sel inang setelah menginfeksi, selanjutnya DNA fage akan mengalami pertumbuhan siklus litik atau lisogenik. Siklus litik menyebabkan lisisnya sel inang dan menghasilkan partikel fage baru, sedangkan siklus lisogenik terjadi karena genom bakteriofage terintegrasi dengan

7 9 genom sel inang sebagai profage. Dalam kondisi cekaman nutrisi dan lingkungan, DNA yang terintegrasi dapat dikeluarkan dari kromosom inang dan selanjutnya memasuki siklus litik (Glick & Pasternak 1994). Ketika bakteriofage digunakan sebagai vektor pengklonan, dia mampu mengalami pertumbuhan litik, tetapi fungsi virus lainnya menjadi tidak relevan. Sebagai akibatnya, gen-gen yang terlibat dalam jalur lisogenik dan gen-gen virus lainnya yang tidak penting bagi jalur litik akan dihilangkan dari DNA virus dan digantikan dengan DNA yang akan diklonkan. Bakteriofage ini memiliki efisiensi pengemasan sebesar % dari ukuran DNA lambda tipe liar (Chauthaiwale et al. 1992). DNA asing yang berukuran di atas 25 kb dapat disisipkan ke dalam genom, menghasilkan DNA rekombinan yang dapat dikemas secara in vitro untuk membentuk virusvirus yang mampu bereplikasi dan membentuk plak di dalam sel inang E. coli (Lodish et al. 2000). Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda Bakteriofage merupakan salah satu vektor untuk konstruksi pustaka genom. Replikasi DNA di dalam sel inang menghasilkan molekul DNA multimerik, yang disebut concatomers, yang terdiri dari kopi-kopi ganda genom virus yang bersambungan dari ujung hingga ujung yang dibatasi oleh sekuen nukleotida spesifik yang disebut situs COS. Dua protein, yaitu Nu 1 dan A, terikat dengan situs COS dan menyisip secara langsung ke DNA di antara dua situs COS yang berdekatan kemudian masuk ke dalam kepala yang akan disusun (Lodish et al. 2000). Setiap kepala fage mengemas genom tunggal sebesar 50 kb dari concatomers multimerik. DNA kromosom sel inang tidak menyisip ke dalam kepala karena tidak mengandung kopi dari sekuen COS. Kepala dan ekor yang kosong disusun dari kopi-kopi ganda dari beberapa protein λ yang berbeda. Selama fase akhir, membentuk molekul DNA yang panjang yang disebut concatomers. Molekul multimerik ini terdiri dari kopi-kopi genom yang bersambungan dari ujung ke ujung dan dipisahkan oleh situs COS yang merupakan sebuah sekuen nukleotida yang dapat mengikat protein. Setiap kopi

8 10 dari genom λ mengandung COS. Protein λ Nu1 dan A yang menempel pada situs COS memicu penyisipan DNA diantara dua situs COS yang berdekatan ke dalam kepala yang kosong. Setelah kepala-kepala terisi DNA, ekor yang siap disusun akan menempel, menghasilkan virus λ lengkap yang mampu menginfeksi sel-sel E. coli (Gambar 3). Gambar 3 Penyusunan virus bakteriofage λ (Lodish et al. 2000). Berbagai vektor pengklonan turunan dari fage telah dikonstruksi untuk berbagai tujuan berdasarkan ukuran fragmen DNA sisipan dan situs penyisipan (Singer & Berg 1991). Fage BlueSTAR-1 merupakan vektor yang didesain untuk membuat pustaka genom DNA dengan ukuran sisipan sebesar 7-20 kb. Vektor ini mengandung gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxp yang digunakan untuk autosubkloning (Novagen 1997). Seleksi biru-putih diperoleh karena adanya gen lacz E. coli lengkap dan daerah kontrol yang terdapat dalam lengan

9 11 fragmen yang berukuran 13 kb. Lengan vektor akan bereligasi dengan lengan DNA genom, menghasilkan fage yang dapat menghasilkan β-galaktosidase aktif di dalam sel-sel yang terinfeksi. Virus rekombinan yang diinfeksikan ke bakteri ini, yang kemudian ditumbuhkan di cawan petri akan menghasilkan plak-plak rekombinan dalam jumlah besar. Setiap plak yang muncul dari virus rekombinan tunggal akan menghasilkan turunan fage yang jika ditumbuhkan akan identik secara genetik dimana klon yang dibentuk telah membawa insert DNA genomik khusus. Plak yang berbeda berhubungan dengan klon fage yang dibentuk, setiap plak membawa DNA insert yang berbeda, dan secara kolektif mereka menyusun pustaka genom. Pengemasan DNA Lambda Untuk menyiapkan virus yang infektif yang membawa DNA rekombinan, perakitan fage dilakukan secara in vitro dengan melakukan pengemasan molekul DNA fage. Salah satu metode untuk memproduksi protein pengemas fage adalah dengan menumbuhkan dua macam fage mutan secara terpisah. Kedua macam mutan ini hasil dari mutasi pada gen yang berbeda. Mutan yang satu tidak dapat mensintesis protein kepala A, dan mutan yang lain tidak mampu mensintesis protein kepala Nu 1. Dengan mencampur kedua ekstrak ini, fragmen DNA akan dikemas dalam kepala dan ekor fage akan ditempelkan pada kepala yang sudah mengandung DNA. Pengemasan dengan ekstrak protein ini menghasilkan virus-virus rekombinan dalam jumlah besar yang sangat infektif dan secara efisien dapat menginfeksi sel-sel E. coli. Setiap partikel virus berikatan dengan reseptor pada permukaan sel inang dan menginjeksikan DNA rekombinan yang telah dikemas ke dalam sel (Lodish et al. 2000).