IDENTIFIKASI DAN UJI PENDAHULUAN AKTIVITAS ANTIKANKER SENYAWA NON FENOLIK DARI EKSTRAK DIKLOROMETANA BATANG TUMBUHAN ASHITABA (Angelica keiskei)

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI DAN UJI PENDAHULUAN AKTIVITAS ANTIKANKER SENYAWA NON FENOLIK DARI EKSTRAK DIKLOROMETANA BATANG TUMBUHAN ASHITABA (Angelica keiskei) IDENTIFICATION AND PRELIMINARY TESTING ANTICANCER ACTIVITY FROM THE STEMS ASHITABA (Angelica keiskei) OF DICLOROMETHANE EXTRACT Ririn Sri Hartini, Suyatno Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya Jl. Ketintang Surabaya (60231), Telp Abstrak.Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui struktur molekul senyawa non fenolik dari ekstrak diklorometana batang tumbuhan ashitaba (Angelica keiskei) dan uji pendahuluan aktivitas antikankernya.dalam penelitian ini, ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi, pemisahan dilakukan dengan metode kromatografi cair vakum (KCV) yang dimonitoring dengan kromatografi lapis tipis (KLT), dan pemurnian dilakukan dengan metode rekristalisasi.uji kualitatif dilakukan dengan pereaksi Liebermann-Burchard dan struktur molekul senyawa hasil isolasi ditentukan dengan metode spektroskopi (UV-Vis, IR, dan MS).Uji pendahuluan aktivitas antikanker dilakukan dengan metode BSLT. Dari hasil penelitian diperoleh isolat berupa serbuk tak berwarna dengan titik leleh 70,23 ºC. Hasil uji kualitatif senyawa hasil isolasi dengan pereaksi Liebermann-Burchard menunjukkan warna biru yang mengindikasikan bahwa isolat merupakan senyawa steroid.berdasarkan data spektroskopi, isolat mengandung campuran dua senyawa steroid yaitu stigmasterol dan β-sitosterol.berdasarkan hasil uji BSLT, senyawa steroid hasil isolasi menunjukkan toksisitas berkategori sangat toksik terhadap Artemia salina dengan nilai LC 50 sebesar 119,048 µg/ml.dengan demikian isolat berpotensi untuk dikembangkan sebagai bahan antikanker. Kata-kata kunci: Ashitaba (Angelica keiskei), ekstrak diklorometana, steroid, uji BSLT. Abstract.The aims of research is to determine the molecular structure of non phenolic compounds from the stems ashitaba (Angelica keiskei) of dichloromethane extract and preliminary testing anticancer activity. In this research, the extraction was carried by maceration method, separation by Vacuum Liquid Chromatography (VLC) monitored using Thin Layer Chromatography (TLC), and purified by recrystallization method. The qualitative test was carried by Liebermann-Burchard reagent and the molecular structure of the isolate was determined by spectroscopic methods (UV-Vis, IR and MS). Preliminary test of anticancer activity was performed by the BSLT. Based on the research, it was obtained aisolates as colorless powderwith a melting point of C. The qualitative test to isolate showed a blue color indicating that it was a steroid compound. Based on spectroscopic data, isolate was contained a mixture of two steroid compounds, namely stigmasterol and β-sitosterol. The BSLT test showed that it had toxicity of highly toxic category to Artemia salina with LC 50 of 119,048 mg / ml. Thus isolate had potency to be developed as an anticancer agent. Keywords: Ashitaba (Angelica keiskei), dichloromethane extract, steroid, BSLT test. C-81

2 PENDAHULUAN Kesehatan adalah hal yang penting bagi semua manusia karena jika kesehatan terganggu, maka setiap aktivitas manusia juga akan terganggu. Terganggunya kesehatan dapat disebabkan karena tubuh seseorang terserang penyakit.salah satu penyakit yang hingga saat ini menjadi masalah kesehatan di seluruh dunia, termasuk juga di Indonesia adalah kanker. Kanker merupakan penyakit yang disebabkan oleh sel tunggal yang tumbuh secara tidak terkendali sehingga dapat merusak sel atau jaringan normal[1]. Pengobatan kanker dapat dilakukan secara tradisional maupun medis. Pengobatan secara medis dapat dilakukan dengan beberapa cara, seperti seperti imunoterapi, kemotrapi, dan radioterapi. Tetapi pengobatan tersebut dapat menimbulkan efek negatif bagi tubuh karena pengobatan tersebut tidak bersifat selektif dan juga dapat menyebabkan rusaknya jaringan normal. Pengobatan secara tradisional diharapkan dapat bersifat selektif yang dilakukan dengan obatobatan herbal yang berasal dari tumbuhan yang memiliki khasiat sebagai obat. Indonesia memiliki kekayaan alam berupa tumbuhan obat yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber obat tradisional.obat tradisional sangat penting bagi masyarakat karena lebih mudah diperoleh dan relatif lebih murah karena dapat diperoleh tanpa resep dokter [2].Salah satu tumbuhan yang banyak dimanfaatkan oleh masyarakat, baik sebagai bahan makanan maupun obat-obatan adalah tumbuhan ashitaba (Angelica keiskei). Masyarakat Indonesia belum banyak yang mengetahui tanaman ashitaba, namun masyarakat Jepang sudah mengenal baik tumbuhan tersebut.ashitaba biasanya ditambahkan pada makanan yang disajikan sehari-hari.di Indonesia, tumbuhan ini dapat tumbuh subur hanya di beberapa tempat, salah satunya di Desa Ketapanrame, Kec. Trawas, Kab. Mojokerto. Dari tumbuhan Angelica keiskei sudah dilakukan isolasi maupun pengujian aktivitas biologisnya.ekstrak etil asetat batang tumbuhan ashitaba (Angelica keiskei) berpotensi sebagai antitumor [3].Penelitian uji aktivitas antidiabetes dari ekstrak etanol akar ashitaba (Angelica keiskei) berhasil diisolasi dua senyawa kalkon, yaitu 4-hydroxyderricin dan xanthoangelol. Isolat tersebut menunjukkan kemampuan mencegah kadar gula pada hewan uji [4]. Beberapa tanaman famili Angelica telah berhasil diuji aktivitas antikankernya.ekstrak etanol tumbuhan Angelica gigas Nakai (AGN) dapat menghambat pertumbuhan sel kanker prostat PC-3 and DU145 yang diberikan pada mencit [5]. Mengingat bahwa struktur molekul dari senyawa non-fenolik batang ashitaba (Angelica keiskei) dan aktivitas antikankernya belum pernah dilaporkan, maka peneliti tertarik untuk melakukan penelitian tentang uji pendahuluan aktivitas antikanker senyawa non fenolik dari ekstrak diklorometana batang tumbuhan ashitaba (Angelica keiskei).dalam penelitian ini uji pendahuluan aktivitas antikanker ditentukan berdasarkan toksisitas senyawa terhadap Artemia salina. BAHAN DAN METODE Alat Beberapa alat yang digunakan antara lain : seperangkat alat ekstraksi dengan metode maserasi, seperangkat alat penyaring Buchner, rotary vacuum evaporator (Heidolp laborata 4001), seperangkat alat kromatografi cair vakum, differential scanning calorimetry (DSC), spektrofotometer UV (Shimadzu Pharma Spec. UV-1700), spektrofotometer IR (Perkin Elmer USA 89485), spektrofotometer massa (Shimadzu QP-2010S), dan alat gelas yang biasa C-82

3 digunakan dalam laboratorium organik bahan alam. Bahan Bahan-bahan yang di butuhkan adalah n- heksana teknis, diklorometana teknis, etil asetat teknis, kloroform p.a, asam sulfat pekat p.a, metanol p.a, asam asetat anhidrida p.a, kiesegel 60 GF-254, pelat KLT silika gel F-254 (20 x 20; 0,25 mm), dan larva udang Artemia salina L. Prosedur Penelitian Tahap Pengumpulan dan Penyiapan Sampel Tumbuhan Sampel berupa batang tumbuhan ashitaba yang diperoleh dari Desa Ketapanrame, Kecamatan Trawas, Kabupaten Mojokerto dibersihkan, dipotong hingga ukurannya kecil, kemudian dikeringkan dengan cara dianginanginkan, dan selanjutnya digiling hingga menjadi serbuk halus yang siap untuk diekstraksi. Ekstraksi dan Isolasi Sampel berupa serbuk halus batang tumbuhan ashitaba sebanyak 2 kg diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut n- heksana. Maserasi dilakukan selama 3 x 24 jam dengan volume n-heksana 1 liter untuk setiap maserasi. Selanjutnya dilakukan maserasi menggunakan pelarut diklorometana selama 3 x 24 jam dengan volume diklorometana 1 liter untuk setiap maserasi. Hasil maserasi diklorometana disaring dengan corong Buchner, sehingga diperoleh ekstrak diklorometana dan residu.ekstrak diklorometana diuapkan dengan rotary evaporator dan didapatkan ekstrak pekat dan pelarut diklorometana. Kromatografi cair vakum (KCV) selanjutnya digunakan untuk memisahkan konponen-komponen yang ada dalam ekstrak pekat yang telah didapatkan. Fasa diam yang digunakan dalam metode ini adalah silika gel GF-254 dan eluen yang digunakan adalahnheksana, campuran n-heksana-etilasetat, dan etil asetat. Kromatografi lapis tipis (KLT) selanjutnya digunakan untuk memonitor hasil pemisahan dengan menggunakan perbandingan eluen n-heksana:etil asetat = 4:1. Fraksi-fraksi yang nilai Rf-nya sama dan pada plat KLT sudah menunjukkan satu noda kemudian digabung. Selanjutnya dilakukan rekristalisasi untuk pemurnian isolat yang telah didapat menggunakan pelarut yang sesuai. Uji kemurnian isolat dilakukan dengan penentuan titik leleh menggunakan Differential Scanning Calorimetry (DSC) dan KLT tiga sistem eluen. Uji Pendahuluan Antikanker Senyawa Hasil Isolasi Sebanyak 5 mg isolat ditambah dengan 1 ml kloroform dengan diaduk hingga isolat larut seluruhnya.larutan tersebut disebut larutan induk berkonsentrasi 5000 µg/ml.larutan tersebut masing-masing diambil sebanyak 10, 25, 50, 75, dan 100 µl dan dimasukkan dalam vial yang berbeda.masing-masing vial dibiarkan hingga pelarutnya menguap, kemudian ditambahkan DMSO sambil diaduk hingga isolat larut dan dimasukkan 10 ekor larva udang, diisi sampai volumenya 5 ml dengan air laut dan dibiarkan selama 24 jam. Jumlah larva udang yang mati dihitung setelah 24 jam.dilakukan analisis probit pada hasil yang diperoleh menggunakan program SPSS untuk menentukan besarnya LC 50 senyawa hasil isolasi[6]. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Ekstraksi dan Isolasi Senyawa Non Fenolik dari Batang Tumbuhan Ahitaba (Angelica keiskei) Sebanyak 2 kg serbuk halus batang tumbuhan ashitaba (Angelica keiskei) diekstraksi dengan cara maserasi berurutan menggunakan pelarut n-heksana teknis dan diklorometana teknis.penyaringan dilakukan pada ekstrak yang C-83

4 diperoleh menggunakan penyaring Buchner sehingga didapatkan ekstrak diklorometana dan residu. Ekstrak diklorometana selanjutnya diuapkan menggunakan rotary vacuum evaporator hingga didapatkan ekstrak pekat diklorometana berwarna hijau kehitaman sebanyak 55,225 gram. Dilakukan kromatografi cair vakum (KCV) untuk memisahkan komponen-komponen yang ada dalam ekstrak pekat diklorometana menghasilkan 127 fraksi. Jenis eluen yang digunakan pada saat KCV ditingkatkan kepolarannya mulai dari eluen yang kurang polar yaitu n-heksana sampai ke eluen yang lebih polar yaitu etil asetat. Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan untuk memonitor hasil pemisahan dari KCV fraksi dengan eluen n-heksana etil asetat = 4 : 1. Fraksi-fraksi yang memiliki nilai Rf sama yaitu fraksi digabung dan diuapkan hingga diperoleh berat sebanyak 0,754 gram. Selanjutnya dilakukan rekristalisas dengan pelarut metanol dan didapatkan 0,127 gram serbuk tak berwarna. Uji kemurnian dilakukan pada serbuk tersebut dengan pengukuran titik leleh dan KLT tiga sistem eluen. Uji titik leleh isolat menggunakan Differential Scanning Calorimetry (DSC) dan didapatkan hasil sebesar 70,23 ºC. Pada uji KLT tiga sistem eluen, isolat diuji sebanyak 3 kali dengan eluen yang berbeda. Perbandingan eluen yang digunakan, yaitu n-heksana:etil asetat = 4:1, n-heksana:etil asetat = 9:1, n- heksana:kloroform = 1:1. Hasil uji KLT menunjukkan satu noda dengan masing-masing nilai Rf 0,65 ; 0,25 ; dan 0,325. Hasil uji kualitatif menggunakan pereaksi Liebermann- Burchard menghasilkan warna biru yang mengindikasi bahwa senyawa hasil isolasi adalah senyawa steroid. Penentuan Struktur Molekul Senyawa Hasil Isolasi Hasil pengukuran spektrum ultraviolet-sinar tampak (UV-Vis) senyawa hasil isolasi dalam pelarut n-heksana terlihat bahwa senyawa hasil isolasi menunjukkan puncak serapan maksimum pada panjang gelombang 196,2 nm. Dengan demikian senyawa hasil isolasi menunjukkan adanya transisi elektron π π*. Hal ini disebabkan oleh adanya ikatan rangkap C=C yang tidak terkonjugasi karena panjang gelombang serapan maksimumnya berada di bawah 215 nm. Berdasarkan data spektrum IR senyawa hasil isolasi menunjukkan adanya tekuk C-H alkil (1463,82 dan 1381,95 cm -1 ) dan regang C- H alkil (2918,17 cm -1 ). Hal ini mendukung bahwa dalam isolat terkandung kerangka senyawa steroid. Regang C-O (1169,09 dan 1049,80 cm -1 ) dan vibrasi regang O-H (3435,18 cm -1 ) yang mendukung adanya senyawa steroid pada isolat yang diperoleh karena memiliki gugus hidroksil. Selanjutnya dilakukan pengujian GC-MS untuk menentukan struktur dan juga massamolekul senyawa hasil isolasi. Hasil analisis GC-MS menunjukkan bahwa terdapat campuran 2 senyawa pada isolat yang masingmasing memiliki massa molekul relatif 412 (1) dan 414 (2) dengan persen luas area masingmasing 66,61 dan 33,39 %. Senyawa 1 memberikan ion-ion fragmen pada m/z 394, 379, 369, 351, 327, 314, 300, 285, 271, 255, 241, 229, 213, 199, 185, 173, 159, 145, 133, 123, 105, 97, 83, 69, 55, dan 41.Senyawa 2 memberikan ion-ion fragmen pada m/z 396, 381, 354, 329, 303, 283, 273, 255, 241, 231, 213, 199, 187, 173, 159, 145, 133, 119, 107, 95, 81, 57, 43, dan 41. Berdasarkan hasil analisis data uji kualitatif dan spektroskopi (UV, IR, dan MS) dapat disimpulkan bahwa senyawa non fenolik hasil isolasi merupakan campuran senyawa steroid yaitu stigmasterol dan β-sitosterol.adanya kandungan senyawa tersebut membuktikan bahwa dalam batang tumbuhan ashitaba terdapat senyawa golongan non fenolik.struktur molekul senyawa tersebut ditunjukkan pada Gambar 1. C-84

5 HO HO Gambar 1. Struktur Senyawa Hasil Isolasi Uji Pendahuluan Aktivitas Antikanker Senyawa Hasil Isolasi Dalam penelitian ini metode BSLT digunakan pada uji pendahuluan aktivitas antikanker dengan larva udang Artemia salina L. yang berumur 48 jam sebagai hewan uji.hasil uji BSLT ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel 1.Kematian Larva Artemia salina Konsentrasi Jumlah Kematian Jumlah Awal Rata- Rata Jumlah Kematian Rata- Rata % Kematian 0 ppm ppm ,667 6, ppm ,333 13, ppm ,333 23, ppm ,333 33, ppm ,667 36,667 Data pada Tabel 1 selanjutnya dianalisis dengan analisis probit menggunakan program SPSS untuk mendapatkan nilai LC 50.Hasil analisis probit dari senyawa hasil isolasi menunjukkan nilai LC 50 sebesar 119,048 µg/ml.suatu senyawa dikatakan sangat toksik jika nilai LC 50 < 250 µg/ml [7].Berdasarkan nilai LC 50 isolat dapat dikategorikan memiliki tingkat toksisitas sangat toksik sehingga dapat dikatakan bahwa isolat tersebut memiliki potensi sebagai antikanker. KESIMPULAN stigmasterol β-sitosterol Berdasarkan hasil pembahasan di atas, maka dapat disimpulkan bahwa: 1. Senyawa non fenolik dalam isolat dari ekstrak diklorometana batang tumbuhan ashitaba (Angelica keiskei) adalah campuran senyawa steroid yaitu stigmasterol (stigmast- 5,22-dien-3-ol) dengan rumus molekul C 29 H 48 O dan β-sitosterol (stigmast-5-en-3-ol) dengan rumus molekul C 29 H 50 O. Isolat tersebut berupa serbuk tak berwarnadengan berat 0,127 gram dan memiliki titik leleh 70,23 ºC. 2. Senyawa non fenolik hasil isolasi berpotensi sebagai antikanker pada uji pendahuluan dengan metode BSLT diperoleh nilai LC 50 sebesar 119,048 µg/ml dan memiliki tingkat toksisitas sangat toksik terhadap tingkat kematian larva udang Artemia salina Leach. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terimakasih disampaikan kepada Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Purwodadi, Pasuruan Jawa Timur yang telah mengidentifikasi tumbuhan ashitaba (Angelica keiskei).. DAFTAR PUSTAKA 1. Ahmad, N.R Cara Mudah Mencegah dan Mengobati Kanker dengan Ramuan Tradisional dan Alami. Surabaya: Aulia Publishing. 2. Pudjarwoto, T., Simanjuntak, C, H; Nur Indah P Daya Antimikroba Obat Tradisional Diare terhadap Beberapa Jenis Bakteri Enteropatogen. Cermin Kedokteran. 76(1): Akihisa T., H. Tokuda, M. Ukiya, M. Iizuka, S. Schneider, K. Ogasawara, T. Mukainaka, K. Iwatsuki, T. Suzuki dan H. Nishino Chalcones, coumarines, and flavonones from the exudate of Angelicakeiskei and their chemopreventive effects. Cancer Letters. 201 : C-85

6 4. Enoki, T., Ohnogi, H. and Nagamine K Antidiabetic Activities of Chalcones Isolated from a Japanese Herb Angelica keiskei. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 : Lee, H.J., Hyo, J.L., Eun, O.L., Jae, H.L., Kuen, S.L., Kwan, H.K., Sung, H.K.,Junxuan, L In vivo Anti-Cancer Activity of Korean Angelica gigas and its Major Pyranocoumarin Decursin. Chinese Medicine. Vol. 37, No. 1, Mc Laughlin, J.L., Chang, Ching-Jer & Smith, D.L The Unesco Regional Workshop on the Bioassay of Natural Product with Special Emphasis on Anticancer Agent. UM Malaysia. 7. Anderson R.N Deaths: Leading Causes for National Vital Statistics Reports. Hyattsville, Maryland; National Center for Health Statistics. 49:11. Prosiding Seminar Nasional Kimia dan Pembelajarannya, ISBN : C-86