BAB III METODELOGIPENELITIAN. PeneJJtian ini dijakukan di Laboratorium Biokimia PakuJtas Matematika dan

Transkripsi

1 BAB III METODELOGIPENELITIAN 3.1. Waktu dan tempat penelitian PeneJJtian ini dijakukan di Laboratorium Biokimia PakuJtas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau dan selama lebih kurang enam bulan Alat dan bahan 3.2.L Aiat-alat yang digunakan Alat-alat yang digunakan adalah Spektrofotometer Genesis II keluaran Milton Roy Co; USA (No. Catolog 400/40); Autoklaf 1925x (Winconsin Aluminium Foundry Co. Inc., MOnitowoc); Waterbath thermostat WK-24 (Sibata Scientific Technology Ltd); Rotary Shaker (Stuart Scientific Inggris); Kertas saring GF/C Whatman (Cat. No ) ph meter 210 A Orion; Laminar Flow (ESCO Micro PTE LTD HD 3); Pompa vakum P-169 (Fisher General Scientific Private Limited, Singapura); Vortex mixer Genie 2 Cat. No ; Corning Sterile Syringe filter 0,45 \im khusus produksi selulase yang tidak mengandung selulosa <No. Katalog ). Tabung eppendrof dan peralatan laboratorium biokimia standar lainnya sesuai dengan prosedur Bahan-bahan yang digunakan Bahan-bahan yang digunakan adalah empat galur Aspergillus spp (asal dari kulit jeruk diperoleh dari kebun jeruk yang terdapat di pasar bangkinang dan pasar Arengka yang ada di Pekanbaru) koleksi Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau, CMC (karboksi metil selulosa) keluaran BDH Chemical Ltd Poole England (Cat No ), Polivinil polipirolidon keluaran SIGMA-Aldrich chemical Co. St. Louis, Mo, (nomor katalog P-6755), standar protein untuk penentuan konsentrasi protein adalah albumin bovine serum fraction V (ex. Hopkin & Williams, Cat. No Agar batang dan bahan-bahan lain yang digunakan adalah bahan tingkat analisis {analitycal grade) sesuai metode. 15

2 3.3. Rancangan penelitian Penelitian diawali dengan peremajaan isolat jamur Aspergillus spp {Aspergillus sp.l TT, Aspergillus sp. 3 KP, Aspergillus fumigatus KK, Aspergillus fiimigatus KP) pada media padat PDA (Saryono dkk, 2002) kemudian jamur tersebut diukur OD660nm dan dikorelasikan dengan kurva standar. Hal ini dilakukan untuk mengetahui jumlah spora/ml yang akan diinokulasi. Selanjutnya diinokulasi dalam medium cair spesifik pada beberapa suhu. Ekstrak kasar enzim diisolasi dari medium cair produksi enzim yang aktivitasnya diukur berdasarkan kemampuannya melepaskan gula pereduksi yang dibebaskan dari selulosa per satuan waktu oleh kerja enzim selulase dengan metode Nelson-Samogyi dengan tiga kali pengulangan. Pada Metode Nelson-Samogyi larutan berwama yang dihasilkan merupakan senyawa kompleks Cu"^ hasil reduksi oleh glukosa dengan Arsenomolibdat. Larutan bewarna ini diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 660 nm (Green III dkk., 1989). Data aktivitas enzim hasil analisis diuji secara statistik dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) untuk menentukan strain yang paling optimal menghasilkan enzim selulase. Bagan rancangan penelitian dapat dilihat pada Lampiran Prosedur penelitian Pembuatan medium padat untuk peremajaan jamur penghasil enzim selulase Komposisi bahan dan prosedur kerja untuk pembuatan medium padat agar miring (PDA) (Saryono dkk., 2002) yang ditunjukkan pada Tabel 2. label 2. Media Potato Dextrose Agar (PDA) No Bahan Jumlah 1 Kentang 200 gram 2 Glukosa 20 gram 3 Agar 20 gram 4 Akuades 1000 ml 16

3 Media padat ini dipersiapkan sebagai berikut : Kentang 200 gram diiris-iris dan dimasukkan ke dalam 300 ml akuades. Campuran dididihkan selama menit. Campuran ini kemudian disaring dengan kain kasa. Filtrat yang diperoleh dicampur dengan glukosa dan agar batang yang telah ditimbang serta akuades hingga volume 1000 ml. Larutan ini dipanaskan sampai agamya larut. Untuk pembuatan agar miring, 5 ml cairan media dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 25 \il asam sitrat 0,05 %. Tabung-tabung ditutup dengan kapas dan disterilisasi pada tekanan 15 lb, 121^C selama 20 menit dalam autoklaf. Selanjutnya tabung-tabung tersebut dimiringkan serta dibiarkan larutan media di dalamnya membeku. Media ini dapat digunakan apabila tidak ada tanda-tanda kontaminasi setelah dibiarkan selama kurang lebih dua hari sampai pada tabung tidak terdapat uap air Peremajaan jamur Jamur stok yaitu empat strain Aspergillus spp diambil dengan jarum ose secara aseptis, kemudian diinokulasi pada medium agar miring. Selanjutnya diinkubasi pada temperatur kamar selama 5 hari, lalu masing-masing jamur diinokulasi kembali ke medium cair produksi enzim selulase jika tidak ada tandatanda kontaminasi Penentuan jumlah spora Aspergillus spp Jamur Aspergillus spp yang telah diremajakan pada agar miring berisi 5 ml PDA selama 5 hari. Kemudian jamur tersebut dibilas dengan akuades steril dengan berbagai variasi volume sehingga diperoleh variasi konsentrasi spora/ml. Jamur dikerok, lalu disaring dengan glass woll untuk masing-masing variasi. Sebagian dari suspensi jamur hasil penyaringan (selanjutnya disebut suspensi) diukur ODeeo nm dengan spektrofotometer sinar tampak. Suspensi A diencerkan secara serial dari lo'-lo'^, lalu 100 il dari setiap pengenceran ditanam pada cawan petri berisi PDA. Suspensi jamur tersebut disebar pada media PDA dengan batang L steril. Jamur dibiarkan meresap selama 1 jam, lalu cawan petri dibungkus parafilm dan kertas. Setelah itu, cawan petri dibalik dan 17

4 diinkubasi pada suhu kamar sampai tumbuh koloni jamur yang terpisah dan dapat dihitung koloninya, dikonversi kembali sesuai kuat pengencerannya, untuk menentukan konsentrasi spora hidup/ml yang berada dalam suspensi A. Selanjutnya dibuat grafik korelasi antara konsentrasi spora/ml suspensi A dengan ODeeonm Pembuatan media cair untuk produksi selulase dan peremajaan Aspergillus spp Bahan untuk media produksi enzim selulase adalah sesuai dengan media Supiandi (1999) yang telah dimodifikasi ditunjukkan pada Tabel 3. Tabel 3. Medium cair produksi enzim No. Bahan Jumlah 1 KNO3 0,5 gram 2 KH2PO4 0,25 gram 3 MgS04.7H20 0,125 gram 4 CMC 0,1 gram 5 Polivinil polipirolidon 0,5 gram 6 Dapar sitrat-phospat 50 ml Cara pembuatan medium cair adalah semua bahan di atas dilarutkan dengan 50 ml buffer fosfat ph 5,5 (0,05 M) dalam erienmeyer 100 ml. Campuran ini kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 15 lb 121 C, selama 20 menit. Media siap untuk digunakan sebagai media produksi enzim selulase. Peremajaan dari 4 strain Aspergillus spp dalam media cair produksi dilakukan sebagai berikut: Media cair diambil sebanyak 25 ml kemudian dimasukkan ke dalam erienmeyer (erienmeyer A, B, C, D). Masing-masing ke dalam erienmeyer dimasukkan strain Aspergillus spp (Aspergillus sp.l TT, Aspergillus sp. 3 KP, Aspergillus fiimigatus KK, Aspergillus fumigatus KP) hasil peremajaan dari agar miring kemudian diinkubasi didaiam rotary shaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu kamar selama 3 hari. 18

5 3.4.5, Produksi enzim selulase dari Aspergillus spp Setelah keempat strain ini ditumbuhkan selama 3 hari, masing-masing strain diambil dimasukkan kembali ke dalam Erienmeyer yang telah berisi media produksi (50 ml). Suspensi mikroba diinkubasi pada suhu 50''C dengan pengocokan pada rotary shaker selama 7 hari. Setelah itu media kultur yang mengandung enzim selulase didinginkan terlebih dahulu pada suhu 4 C selama 1 jam setelah itu baru disentrifiigasi selama 10 menit dengan diperoleh ekstrak kasar. Ekstrak kasar yang diperoleh disaring dengan filter glass fiber (Whatman GF/C ) dan disterilisasi dengan Coming sterile syringe filter 0,45 ^m, kemudian ditambahkan NaNs hingga konsentrasinya 0,02 % ke dalam setiap larutan supematan jika enzim tidak langsung digunakan Penentuan aktivitas enzim selulase dengan metode Nelson-Samogyi Sampel 0,05 gr karboksil metil selulosa (CMC) dilarutkan dalam 100 ml buffer 0,05 M ph 6 sebagai substrat. Substrat diambil 2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian diprainkubasi dalam waterbath pada suhu 50 C dan 45^C selama 5 menit. Tanpa mengeluarkan tabung reaksi dari waterbath ditambahkan 0,5 ml larutan enzim, diaduk deengan hati-hati. Larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 50 C dan 45 C. Setelah 30 menit tabung diangkat secara cepat dari waterbath dan langsung dipanaskan dalam penangas mendidih selama 10 menit. Mulut tabung ditutup dengan kelereng. Kontrol Penyediaan dan perlakuan larutan kontrol dilakukan serentak dengan sampel. Tabung reaksi kosong diprainkubasi dalam waterbath pada suhu 50 C dan 45 C selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan enzim, diaduk dengan hatihati. Larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 50 C dan 45 C. Setelah 30 menit tabung diangkat secara cepat dari waterbath, ditambahkan 2 ml substrat dan langsung dipanaskan dalam penangas mendidih selama 10 menit. Mulut tabung ditutup dengan kelereng. 19

6 Blanko Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 2,5 ml larutan buffer sitrat 0,05 M ph 6. Blanko diperlakukan dengan cara yang sama seperti sampel dan kontrol. Sampel, kontrol dan blanko disentrifiigasi selama 25 menit. Selanjutnya masing-masing sampel, kontrol dan blanko dipipet ke dalam tabung reaksi sebanyak 0,5 ml untuk menentukan gula pereduksinya dengan metode Nelson-Samogyi. Selain itu juga disediakan standar glukosa, juga dipipet sebanyak 0,5 ml. Ke dalam masingmasing tabung ditambahkan 0,5 ml reagen Nelson-Samogyi dan dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 20 menit dengan mulut tabung ditutup dengan kelereng. Setelah itu didinginkan dengan cepat (menggunakan es) hingga suhu kamar. Masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml reagen arsenomolibdat dan 3,5 ml aquades. Campuran diaduk dengan menggunakan vortex dan diukur absorbannya pada panjang gelombang 660 nm Penentuan aktivitas enzim Dari data absorban yang diperoleh, dapat ditentukan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Aktivitas enzim diketahui dari gula pereduksi yang dihasilkan permililiter (jxmol gula pereduksi/ml menit'').. ftmol gula pereduksi sampel-fimol gula pereduksi kontrol Aktivitas enzim = ; ; ; : : : Volume ekstrak enzim. x jam x menit Satu unit (lu) selulase adalah sejumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1,0 mikromol (nmol 10'^ mol) gula pereduksi per menit Analisis data Data yang diperoleh dari empat percobaan dengan jamur yang berbeda, masing-masing dianalisis secara statistik. Perbandingan aktivitas enzim selulase dari berbagai aspergillus spp {Aspergillus sp. 2 TT, Aspergillus sp. 3 KP, Aspergillus fumigatus KK, Aspergillus fumigatus KP) digunakan uji Duncan jarak berganda menurut Bender dkk (1982). 20