8. PEMBAHASAN UMUM. Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at:

Transkripsi

1 8. PEMBAHASAN UMUM Peningkatan intensitas warna dan kadar lovastatin angkak, diupayakan dengan melakukan ko-kultur M.purpureus dengan khamir amilolitik indigenus. Aplikasi ko-kultur pada produksi angkak dilakukan melalui beberapa tahapan meliputi : seleksi terhadap 16 strain khamir indigenus untuk mendapatkan khamir yang memiliki aktivitas amilolitik, ko-kultur enam strain M. purpureus dengan khamir terpilih, analisis intensitas pigmen, kadar lovastatin dan sitrinin angkak, analisis ekspresi gen yang berperan dalam biosintesis lovastatin, serta analisis stabilitas pigmen dan lovastatin oleh pengaruh suhu dan ph. Sebanyak 16 isolat khamir telah diseleksi untuk mendapatkan khamir yang mempunyai aktivitas amilolitik. Hasil seleksi menunjukkan hanya satu isolat khamir yang memiliki aktivitas amilolitik yaitu Endomycopsis burtonii. Secara umum sebagian besar khamir tidak memiliki aktivitas amilolitik, aktifitas yang biasanya dimiliki adalah menghidrolisis gula menjadi alkohol Kelompok khamir yang mempunyai kemampuan amilolitik jumlahnya relatif sedikit antara lain Schwaniomyces occidentalis, Saccharomycopsis fibuliger, Sacch diastiticus, Candida dan Pichia. Jenis-jenis khamir lainnya tidak memproduksi amilase. Enzim amilase sebagai aktivitas amilolitik pada khamir, diproduksi secara ekstraseluler. (Roosifta 2004). Aplikasi ko-kultur M.purpureus dengan E. burtonii ternyata berhasil meningkatkan intensitas pigmen dan lovastatin angkak. Produksi pigmen merah angkak menunjukkan peningkatan oleh penambahan E. burtonii pada waktu dan konsentrasi tertentu oleh semua strain M.purpureus dibanding tanpa ko-kultur (kontrol). Secara umum penambahan E.burtonii yang terlalu awal (hari ke 2) pada semua level konsentrasi, menyebabkan penurunan produksi pigmen merah oleh semua strain M.purpureus. Peningkatan intensitas pigmen merah baru terjadi pada penambahan E.burtonii hari ke 4 pada semua level konsentrasi oleh semua strain M.purpureus, sedangkan pada penambahan E.burtonii hari ke 6 respon strain M 110

2 .purpureus bervariasi. Strain-strain TOS dan JmbA masih menunjukkan peningkatan intensitas pigmen merah, di sisi lain strain AID, JmbA3M, JmbA5K dan As3K relatif tetap. Produksi pigmen merah tertinggi ditunjukkan oleh strain TOS dengan penambahan E.burtonii pada hari ke 6 dengan konsentrasi 10 4 cfu/ml. Penurunan produksi pigmen merah oleh penambahan E.burtonii yang terlalu awal (hari ke 2) diduga disebabkan oleh hal-hal sebagai berikut. Pada tahap awal mikroba membutuhkan fase adaptasi terhadap lingkungan pertumbuhannya. Penambahan khamir pada tahap awal fermentasi, dapat mengganggu pertumbuhan M. purpureus. Kehadiran khamir pada awal pertumbuhan dapat menjadi kompetitor bagi kapang. Lim et al. (2000) melaporkan bahwa masalah utama pada teknik ko-kultur, produksi pigmen dapat menurun disebabkan kehadiran S. cerevisiae dapat menekan pertumbuhan M. purpureus bila penambahan S. cerevisiae terlalu awal dan dalam jumlah yang terlalu tinggi.. Penelitian terdahulu oleh Shin et al (1998) melakukan ko-kultur antara M. purpureus dengan Saccharomyces cerevisiae rekombinan yang diinsert gen penghasil enzim glukoamilase dari Aspergillus niger, dilaporkan terjadi peningkatan pigmen kali dibanding monokultur pada kultur cair. Sebaliknya ko-kultur antara Monascus dengan Bacillus cereus tidak terjadi peningkatan produksi pigmen. Beberapa enzim hidrolitik diproduksi oleh S. cerevisiae rekombinan seperti glukoamilase berfungsi sebagai efektor. Enzim hidrolitik menyebabkan peningkatan produksi pigmen berkaitan dengan kemampuannya mendegradasi dinding sel Monascus. Dengan adanya gangguan tersebut, menyebabkan Monascus melakukan upaya pertahanan diri (defense mechanism) dengan memproduksi komponenkomponen hidrofobik seperti lovastatin dan pigmen. Kandungan pigmen angkak terdiri dari pigmen merah, kuning dan jingga, namun produksi pigmen dalam angkak didominasi oleh pigmen merah dimana setelah 14 hari fermentasi, intensitas pigmen merah dapat mencapai 14,5 pada absorbansi 500 nm, disisi lain intensitas pigmen jingga dan kuning masing-masing hanya 8,5 pada absobansi 470 nm dan 8,9 pada absorbansi 410 nm 111

3 Kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur menunjukkan, bahwa keenam strain M. purpureus memberikan respon yang bervariasi (spesifik strain) terhadap penambahan E. burtonii dengan jumlah dan waktu yang divariasikan. Beberapa strain seperti JmbA5K dan AID menunjukkan peningkatan produksi lovastatin mulai hari ke 2 sampai hari ke 6 penambahan E. burtonii pada semua level konsentrasi. Disisi lain strain TOS pada penambahan E. burtonii pada hari ke 2 dengan konsentrasi 10 3 cfu/ml, justru menyebabkan penurunan kadar lovastatin, pada penambahan dengan konsentrasi cfu/ml, produksi lovastatin relatif tetap, kemudian menunjukkan peningkatan pada penambahan E. burtonii pada hari ke 4 dengan konsentrasi cfu/ml serta hari ke 6 pada konsentrasi 10 4 cfu/ml. Berbeda lagi dengan strain mutan JmbA3M dan As3K, penambahan E. burtonii pada semua waktu dan semua level konsentrasi, menyebabkan penurunan produksi lovastatin. Strain JmbA memberikan respon yang berbeda pula, pada hari ke 2 penambahan E. burtonii dengan konsentrasi 10 3 cfu/ml menyebabkan penurunan kadar lovastatin, pada konsentrasi 10 4 cfu/ml produksi lovastatin menunjukkan peningkatan, kemudian menurun pada penambahan dengan konsentrasi 10 5 cfu/ml. Peningkatan produksi lovastatin terjadi pada penambahan E. burtonii pada hari ke 4 dengan konsentrasi cfu/ml, pada konsentrasi 10 5 cfu/ml, dan penambahan pada hari ke 6 pada semua level konsentrasi menyebabkan penurunan produksi lovastatin. Untuk mengetahui hubungan sifat fenotipik produksi lovastatin dengan sifat genotipiknya, dilakukan analisis ekspresi gen lov B dari M. purpureus. Gen lovb diketahui bertanggung jawab terhadap enzim lovastatin nonketida sintase (LNKS) yang menentukan tahap akhir perubahan ketida menjadi lovastatin (Stocking dan Williams, 2003). Dipilih tiga strain hasil ko-kultur yang menghasilkan lovastatin tinggi yaitu JMBA H410 3, AID H210 4, TOS H610 4 disertai masing-masing strain kontrol tanpa ko-kultur yaitu: JMBA (k), AID (k), TOS (k). Isolasi dilakukan terhadap total RNA yang mengandung fragmen-fragmen trna (RNA transfer), rrna (RNA ribosom), dan mrna (messenger RNA), mengingat isolasi terhadap fragmen mrna sebagai fragmen pembawa pesan sangat sulit dan sensitif. Total 112

4 RNA dari semua strain yang diisolasi, menghasilkan kemurnian yang baik ditunjukkan dengan rasio absorbansi A 260nm /A 280nm semua strain di atas 1,8. Hasil pengukuran konsentrasi total RNA terhadap isolat JMBA H4103, AID H210 3, TOS H610 4 dan kontrol tanpa ko-kultur yaitu JMBA (k), AID (k), TOS (k), menunjukkan bahwa semua isolat mempunyai konsentrasi yang lebih tinggi dari kontrol. Konsentrasi total RNA tertinggi ditunjukkan oleh strain TOS H610 4 (strain TOS hasil ko-kultur dengan penambahan E. burtonii pada penambahan hari ke 6 dengan konsentrasi 10 4 ) yakni 1860 µg, konsentrasi tersebut tiga kali lipat lebih tinggi dibandingkan kontrol. Konsentrasi yang ditunjukkan oleh TOS H610 4 ini sesuai dengan kadar lovastatin yang diproduksi oleh strain TOS H610 4 (2,19%) sebagai pengaruh dari ko-kultur dengan E. burtonii yang mengalami peningkatan dibanding kontrol (0,8%). Demikian juga untuk strain AID H210 4 dan JMBA H410 3 memiliki konsentrasi total RNA sekitar dua kali lebih tinggi dibanding kontrol. Konsentrasi total RNA dengan produksi lovastatin yang tinggi pada strain TOS H610 4 kemungkinan berkaitan dengan hal-hal berikut. Total RNA didalamnya terkandung fragmen mrna atau messenger RNA yang berfungsi sebagai pembawa pesan atau informasi dalam sebuah gen untuk disampaikan kepada mesin pembuat protein atau enzim. Tiap-tiap mrna dipergunakan sebagai cetakan untuk membentuk molekul yang sesuai. Dengan semakin banyak jumlah mrna ditunjukkan dengan konsentrasi total RNA yang tinggi, maka akan semakin banyak pula molekul yang sesuai (dalam hal ini lovastatin) yang akan diproduksi (Murray et al, 2003). Biosintesis lovastatin telah diketahui dimulai dari asetil KoA dan malonil koa menjadi beberapa ketida (2 sampai 9) dimana didalamnya terlibat beberapa gen-gen penting diantaranya lovb dan lovc (Stocking dan Williams, 2003). Gen lovb diketahui bertanggungjawab terhadap enzim lovastatin nonketide sintase (LNKS) yang menentukan tahap akhir perubahan ketida menjadi lovastatin, sedangkan lovc berperan dalam tahap awal perubahan asetil koa dan malonil koa menjadi triketida dan tetraketida. Semua strain menunjukkan ekspresi gen lov B yakni gen penghasil lovastatin. Ekspresi gen lov B yang ditunjukkan berukuran 200 pb (pasang basa). 113

5 Sifat fenotipik M. purpureus TOS H610 4 yang mampu memproduksi lovastatin tinggi ko-kultur dengan E. burtonii, sejalan dengan sifat genotipiknya, yang ditunjukkan dengan tingginya intensitas ekspresi gen penghasil lovastatin. Aplikasi angkak sebagai pigmen alami dan ingredien pangan fungsional secara luas pada bidang pangan, dibutuhkan informasi karakteristik kestabilannya terutama terhadap pengaruh temperatur dan ph. Dipilih satu strain M. purpureus hasil ko-kultur yang menghasilkan pigmen merah dan lovastatin tertinggi yaitu TOS H610 4 disertai kontrol (TOS) untuk dianalisis stabilitasnya terhadap berbagai variasi suhu (70, 100, 121 C dengan berbagai waktu kontak 15, 30, dan 45 menit) dan ph (3,0, 5,0, 7,0 dengan berbagai waktu kontak 2, 4, 6, dan 8 jam). Pigmen merah angkak yang diproduksi oleh M. purpureus TOS baik secara monokultur maupun secara ko-kultur dengan E. burtonii bersifat stabil pada suhu tinggi ( C) dengan waktu kontak cukup lama (15-45 menit). Kestabilan pigmen merah angkak hasil ko-kultur M. purpureus TOS dengan E. burtonii oleh pengaruh suhu, sangat potensial untuk tujuan aplikasi secara luas pada produk olahan pangan, mengingat proses pengolahan pangan secara umum melibatkan penggunaan suhu yang relatif tinggi, misalnya pada makanan kaleng yang disterilisasi pada suhu 121 C dengan lama waktu (15-45) menit. Aplikasi pigmen merah angkak juga dapat digunakan sebagai pengganti nitrit pada produk olahan daging. Fabre et al. (1993) melaporkan bahwa pigmen angkak lebih stabil dibanding pewarna yang biasa digunakan untuk mewarnai produk-produk daging seperti garam-garam nitrit. Shin (2005) juga melaporkan bahwa pigmen angkak secara umum mempunyai kemampuan mewarnai yang kuat dan produk pangan yang diberi warna angkak memiliki penampilan yang baik terhadap panas. Pigmen angkak juga stabil terhadap sinar radiasi maupun ultraviolet. Faktor-faktor seperti oksidasi, logam, alkalinitas dan keasaman berpengaruh kecil terhadap intensitas warna pigmen angkak. Pengaruh ph terhadap stabilitas pigmen merah angkak (monokultur dan kokultur) menunjukkan bahwa, ph 7,0 dengan waktu kontak 2-8 jam tidak mempengaruhi stabilitas pigmen merah angkak monokultur maupun hasil ko-kultur (p>0,05). Sebaliknya pada ph asam (ph 3,0 dan 5,0) dengan waktu kontak 2-8 jam, 114

6 menyebabkan penurunan secara nyata intensitas pigmen merah angkak monokultur maupun hasil ko-kultur. Kestabilan intensitas pigmen merah angkak pada ph netral, sangat potensial untuk tujuan aplikasi pada produk olahan makanan dan minuman yang phnya netral. Timotius (2004) juga melaporkan bahwa pigmen merah dan kuning angkak lebih stabil terhadap panas pada ph tinggi daripada ph asam. Fabre et al (1993) juga menyatakan bahwa pigmen merah angkak lebih stabil pada kondisi alkali dan paling sensitif terhadap ph asam. Carvalho et al (2005) menyatakan bahwa penurunan pigmen lebih cepat pada ph rendah, kemungkinan berhubungan dengan percepatan interaksi air dengan pigmen oleh adanya asam seperti rusaknya ikatan ester dari rubropunktamin atau monaskorubramin. Kadar lovastatin angkak (monokultur dan ko-kultur) oleh pengaruh suhu menunjukkan bahwa perlakuan suhu 70 C, 100 C, 121 C dengan waktu kontak15-45 menit dan suhu 70 C-121 C dengan waktu kontak 15 dan 30 menit, tidak mempengaruhi kadar lovastatin angkak yang diproduksi secara monokultur maupun secara ko-kultur (p>0,05). Apabila waktu pemanasan pada suhu 121 C diperpanjang hingga 45 menit, maka menyebabkan penurunan kadar lovastatin angkak ko-kultur (p<0,05). Penurunan kadar lovastatin angkak akibat perlakuan sampai suhu tertentu, kemungkinan disebabkan oleh kerusakan pada struktur lovastatin. Lovastatin mempunyai kerangka utama poliketida, suatu cincin hidroksiheksahidronaptalen, pada rantai sisi C6 dan C8, terikat metilbutirat dan suatu hidroksilakton. Akibat perlakuan panas dimungkinkan terjadi kerusakan pada gugus penyusun lovastatin, antara lain akibat terlepasnya gugus yang menyusun kerangka poliketida yang berupa cincin hidroksiheksahidronaptalen. Juga dimungkinkan terjadi kerusakan ikatan rangkap pada struktur tersebut atau menyebabkan ikatan rangkap terbuka (Simpson, 1985). Meskipun terjadi penurunan kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur M purpureus TOS dengan E. burtonii oleh pengaruh perlakuan suhu121 C dengan waktu kontak 45 menit, namun kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur tersebut masih lebih tinggi dibandingkan kadar lovastatin angkak penelitian-penelitian sebelumnya. 115

7 Angkak hasil ko-kultur dengan kadar lovastatin yang masih relatif tinggi, memiliki potensi yang cukup tinggi untuk diaplikasikan pada produk-produk pangan sekaligus sebagai pangan fungsional. Disamping itu, produk angkak hasil ko-kultur berpeluang sebagai salah satu sumber lovastatin yang sangat potensial dan relatif murah. Lovastatin merupakan bahan bioaktif kelompok statin yang sangat penting dalam perkembangan biomedis (Altieri,2001). Sudah lama lovastatin dikenal sebagai senyawa penurun kolesterol dengan melakukan penghambatan enzim HMG-CoA reductase (3-hidroksi metilglutaril CoA reduktase) yang berperan penting dalam biosintesis kolesterol. Sampai saat ini Indonesia masih tergantung pada impor bahan ini. Kadar lovastatin angkak (monokultur dan ko-kultur) oleh pengaruh perlakuan ph. Perlakuan ph 3,0, 5,0 dan 7,0 pada semua waktu kontak tidak mempengaruhi stabilitas kadar lovastatin angkak monokultur dan ph 7,0 pada semua waktu kontak terhadap angkak ko-kultur, tidak mempengaruhi kadar lovastatin angkak dan ko-kultur (p>0,05). Sedangkan ph 3,0 dan ph 5,0 pada semua waktu kontak, menyebabkan penurunan kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur (p<0,05). Lovastatin angkak hasil ko-kultur M purpureus TOS dengan E. burtonii memiliki karakteristik stabil pada ph netral, dan tidak stabil atau mengalami penurunan pada ph asam (3,0 dan 5,0). Aplikasi angkak secara luas pada produk pangan diupayakan pada kondisi ph netral (7,0) dan dihindari penggunaan pada produk pangan yang mempunyai ph asam untuk mencegah penurunan kadar lovastatin angkak. 116