memiliki IC50 sebesar 760,55 ppm

Transkripsi

1 ISOLASI ANTIOKSIDAN EKSTRAK menghambat METANOLIK peroksida lipid pada makanan DAUN SIRSAK (Annona (Subeki,1998). muricata L.) Rianes membuktikan adanya Selpida Handayani, Abd.Malik, aktivitas Asril anti Lalangko Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Hasil Indonesia, penelitian JL. Urip Sumiharjo yang KM.5, telah Makassar dilakukan sebelumnya terhadap efek Correspondens antioksidan ekstrak etanolik daun ABSTRAK sirsak dengan mengukur serapan DPPH pada λ 516 nm didapatkan Isolasi senyawa aktif antioksidan ekstrak metanolik nilai daun Sirsak IC50 sebesar (Annona 60,74 muricata ppm L.) yang telah dilakukan. Penelitian ini dimaksudkan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa aktif dibandingkan dengan jus buah sirsak antioksidan daun Sirsak (Annona muricata L.). Sampel sebanyak 200 gr dimaserasi dengan memiliki IC50 sebesar 760,55 ppm metanol menghasilkan 24,667 gr ekstrak kental. Isolasi ekstrak metanolik dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom cair vakum dan dan didapatkan IC50 dari sebanyak vitamin 12 fraksi. C sebesar Kemudian 4 diisolasi lebih lanjut menggunakan kromatografi lapis ppm. tipis Hasil dengan satu tersebut perbandingan menandakan eluen n- heksan : etil asetat (6:4). Hasil isolat diidentifikasi bahwa dengan menggunakan adanya aktivitas spektrofotometri antioksidan UV- Vis diperoleh panjang gelombang maksimum sebesar pada 418,120 daun nm, sirsak dan pereaksi yang kimia lebih spesifik baik AlCl 3 dan sitroborat menunjukkan bahwa isolat merupakan dibandingkan golongan dengan flavonoid. jus buah sirsak Kata kunci : Isolasi, Antioksidan,Daun Sirsak (Rianes, 2012). senyawa hidroksinat, kumarin dan ABSTRACT tokoferol yang berasal dari bahan alam. Sehingga memicu Isolation and identification of active compounds in antioxidant methanolic extract of leaves of Soursop (Annona muricata L.) has been done. This research is intended to isolate and identify the active compounds are antioxidants Soursop leaf (Annona muricata L.). 200 gr sample has been macerated with methanol produces a viscous extract 24,667 gr. Isolation metanolic extracts performed using vacuum liquid chromatography column and found as many as 12 fraction. Then further isolated using thin layer chromatography with a comparison: eluen n-heksan ethyl acetate (6: 4). Results of the isolates to be identified with UV-Vis spectrophotometry obtained the maximum wavelength of 418,120 nm, and reagent specific AlCl 3 and sitroborat showed that isolates a group of flavonoids. Keywords : Isolation,Antioxidant,Soursop Leaf PENDAHULUAN Radikal bebas bersifat reaktif, dan jika tidak diinaktifkan akan dapat merusak makromolekul pembentuk sel, yaitu protein, karbohidrat, lemak, dan asam nukleat, sehingga dapat menyebabkan penyakit degeneratif (Youngson, 2005). Antioksidan adalah zat penghambat reaksi oksidasi akibat radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan asam lemak tak jenuh sehingga menimbulkan penyakit. Senyawa antioksidan ini dapat diperoleh dari bahan alami. Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan spesies oksigen reaktif, mampu menghambat terjadinya penyakit degeneratif serta mampu Rianes pada tahun 2012 membuktikan adanya aktivitas antioksidan ekstrak etanolik daun sirsak lebih baik dengan nilai IC 50 sebesar 60,74 ppm yang dibandingkan dengan jus buah sirsak memiliki IC 50 sebesar 760,55 ppm pada serapan DPPH pada λ 516 nm. Penelitian Rachmawati (2012) tentang efek ekstrak etanolik daun sirsak terhadap proliferasi dan apoptosis sel hela yang dimediasi oleh p53 dimana pada penelitian ini didapatkan IC 50 sebesar 111,75 µg/ml yang dapat diasumsikan menghambat pertumbuhan sel Hela dan menginduksi apoptosis sel hela 257

2 Senyawa antioksidan termasuk golongan senyawa fenolat seperti flavonoid, senyawa hidroksinat, kumarin dan tokoferol yang berasal dari bahan alam. Sehingga memicu masyarakat pada umumnya dan peneliti pada khususnya untuk mengeksplorasi bahan-bahan alam yang dianggap potensial sebagai alternatif agen antiradikal bebas (Trilaksani, 2003) METODOLOGI Pengambilan Sampel Sampel daun Sirsak (Annona muricata L.) dikumpulkan pada pagi hari pukul dengan cara memetik daun dari cabang dan batang utamanya. Pengolahan Sampel Daun Sirsak yang telah diperoleh dicuci bersih dari kotoran yang melekat dengan menggunakan air setelah itu dianginanginkan. Kemudian di masukkan dalam lemari pengering, setelah kering dihaluskan untuk dimaserasi. Ekstraksi Sampel Daun Sirsak (Annona muricata L.) ditimbang sebanyak 200 gr, kemudian dimasukkan ke dalam wadah maserasi dan ditambahkan metanol sebanyak 2500 ml, Maserasi dilakukan selama 3 hari dalam bejana tertutup dan terlindung dari cahaya sambil diaduk secara periodik. Ekstrak hasil maserasi (maserat) dipisahkan dengan ampas, ampas dimaserasi kembali dengan pelarut Metanol sebanyak 2000 ml. Filtrat kemudian ditampung untuk diuapkan. 1. Filtrat hasil maserasi dikumpulkan dan diuapkan dengan menggunakan hairdryer hingga mendapatkan ekstrak kering. 2. Identifikasi dengan Kromatogramafi Lapis Tipis Ekstrak Metanolik kering daun Sirsak (Annona muricata L.) dilarutkan dengan pelarut Metanol, kemudian ditotol pada lempeng KLT berukuran 1 x 7 cm dengan menggunakan pipa kapiler. Lempeng yang sudah ditotol dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen n-heksan : etil asetat dengan berbagai perbandingan yakni 7:3, dan 6:4, Setelah itu di elusi dan diamati profil KLT pada beberapa penampak bercak yaitu pada sinar UV 254 nm dan 366 nm. Bercak yang diperoleh diamati dan dihitung nilai Rfnya. Setelah itu lempeng di uji antioksidan dengan menyemprotkan DPPH. Pemisahan dan Pemurnian Komponen Kimia a. Isolasi dengan metode kromatografi kolom cair vakum 1) Penyiapan kolom Kolom kromatografi berdiameter 6 cm dan panjang 30 cm dibersihkan dengan metanol kemudian sumbat bagian bawah kolom dengan kapas agar silika gel tidak mencemari tampungan fraksi. Sebanyak 30 gr adsorben silika gel 60 (0,2-0,5 mm) berbanding 10 gr dengan silika gel 60 GF 254 dicampurkan, kemudian dimasukkan kedalam kolom dan dimampatkan dengan menggunakan pompa vakum. 2) Isolasi sampel Ekstrak Metanolik daun Sirsak (Annona muricata L.) ditimbang sebanyak 5 gr. Kemudian diletakkan diatas permukaan adsorben yang sebelumnya telah dimasukkan dalam kolom, diatas ekstrak tersebut diletakkan kertas saring. Dimasukan eluen n- heksan : etil asetat (10:0), kemudian dielusi dengan dijalankan pompa vakum, fraksi yang keluar ditampung dalam botol coklat. Elusi juga dengan menggunakan variasi eluen n- heksan : etil asetat (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; 2:8; 1:9; 10:0) dan diakhiri dengan metanol 100 ml. 3) Identifikasi dengan kromatografi lapis tipis Hasil fraksi kolom dari ekstrak metanolik dilarutkan dengan 258

3 pelarut metanol, kemudian ditotol pada lempeng KLT silika gel 60 F 254 berukuran 1 x 7 cm menggunakan pipa kapiler. Setelah itu lempeng di uji antioksidan dengan menyemprotkan DPPH. b. Isolasi dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif Fraksi kemudian diisolasi lebih lanjut menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif dengan cara menotolkan fraksi pada lempeng dengan ukuran yang lebih besar yaitu 20 x 20 cm, Profil kromatogramnya dideteksi menggunakan sinar UV 254 nm dan sinar UV 366 nm. Setelah terbentuk pita, maka pita pita tersebut diberi tanda dan dikeruk. Hasil kerukan tersebut ditambahkan sedikit pelarut kemudian disentrifuge, filtrat ditampung kemudian diuapkan hingga didapatkan isolat. c. Uji pemurnian a) KLT 2 Dimensi Isolat aktif yang diperoleh, ditotol pada lempeng KLT dengan ukuran 5 x 5 cm, kemudian dielusi dengan menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat (6:4) untuk arah pertama dan n-heksan : etil asetat (4:6) untuk arah kedua. b) Kromatografi Lapis Tipis Multi Eluen Uji kemurnian isolat aktif juga dilakukan dengan menggunakan fase gerak Eeil asetat : aseton (1:1) dan etil asetat : kloroform (1:1). Kemudian diamati pada sinar tampak dan UV 254 dan 366 nm. Identifikasi Sampel A. Identifikasi secara kimia Isolat yang diperoleh diidentifikasi secara kimia yaitu dengan disemprotkan penampak bercak golongan komponen kimia. Penampak bercak yang digunakan adalah pereaksi FeCl 3 dan Sitroborat dan AlCl 3. B. Identifikasi spektroskopi UV-Vis Isolat yang diperoleh diidentifikasi dengan spektroskopi UV-Visible. Senyawa dilarutkan dalam metanol p.a kemudian cuplikan ditempatkan antara monokromator dan detektor. Spektrum yang dihasilkan direkam pada alat pencatat. HASIL DAN PEMBAHASAN Simplisia daun sirsak sebanyak 200 gr diekstraksi maserasi dengan pelarut metanol 4500 ml, menghasilkan ekstrak kering metanol sebanyak 24,667 gr. Hasil profil ekstrak metanolik secara kromatografi lapis tipis dengan menggunakan cairan pengelusi n-heksan : etil asetat (6:4), menunjukkan1 bercak pada sinar UV 254 nm, 4 bercak pada sinar UV 366 nm, hasilnya disemprot dengan menggunakan DPPH untuk melihat senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan. Senyawa yang aktif antioksidan adalah noda dengan nilai Rf 0,6 yang menunjukkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning (Sarker et al., 2006). A B C D Gambar 1. Profil KLT ekstrak Metanolik daun Sirsak Fase diam : Silika gel 60 F 254 Fase gerak : n-heksan-etil asetat (6:4) A. Sinar tampak B. UV 254 C. UV 366 D. Semprot DPPH 259 3

4 Tabel 1. Nilai R f dan Warna Bercak Pada Profil Kromatogram k = Kuning h = Hijau ht = Hitam mm = Merah muda klu = Kuning latar belakang ungu Ekstrak metanol daun sirsak sebanyak 5 gr diisolasi secara kromatografi kolom cair vakum menggunakan campuran adsorben silika gel 60 (0,2-0,5 mm) sebanyak 35 gr dan silika gel 60 GF 254 sebanyak 5 gr dengan menggunakan cairan pengelusi n-heksan : etil asetat (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, 0:10) dan methanol 100 ml menghasilkan 12 fraksi yaitu fraksi I XII. Gambar 2.Profil KLT setelah penyemprotan DPPH Keterangan: Fase diam : Silika gel 60 F 254 Fase gerak : n-heksan : etil asetat (6:4) Tabel 2. Nilai Rf dari masing-masing fraksi R f /warna Fraksi No Sinar UV UV lagi secara kromatografi lapis tipis preparatif DPPH Tampak menggunakan eluen n-heksan : etil asetat (6:4) menghasilkan 7 pita yaitu pita I VII. I Profil kromatografi hasil KLT-Preparatif 0,945 0,945 0,945 II 1 disemprot dengan menggunakan DPPH dan /mm menunjukkan aktivitas antioksidan pada pita 0,945 0,945 0,945 III 1 I, sehingga pita I yang kemudian dilanjutkan /mm untuk uji kemurnian. 0,872 0, R f /warna No Sinar Tampa UV 254 UV 366 DPPH k 1 0,98 0,98 0,98/mm 2 0,93t 0,93t 0,93 3 0,84 0,84 0,84 4 0,73 0,73 0,73 5 0,6 0,6,6/mm 0,6lu 4 0,781 0,781 IV- XII 1 0,945 0,945 0,945 /mm 2 0,872 0,872 0,872 t 3 t 4 0,781 0,781 0,781 t 5 0,709 0,709 0,709 t 6 /mm lu k = kuning mm = merah muda h = hijau klu = kuning latar belakang ungu ht = hitam Dari hasil fraksi diatas, yang menunjukkan aktivitas antioksidan paling intens terdapat pada fraksi VII yang ditunjukkan dengan perubahan warna dari ungu menjadi kuning (Sarker et al., 2006). Selanjutnya fraksi VII hasil dari kromatografi kolom cair vakum ini diisolasi 260

5 Uji kemurnian isolat juga dilakukan dengan menggunakan beberapa variasi eluen yaitu etil asetat : aseton (1:1), etil asetat dan kloroform (1:1). Hasil elusi tersebut menampakkan noda tunggal yang dapat dilihat dengan menggunakan UV 254 dan UV 366 nm. Gambar 3. Profil KLTP Fraksi VII Fase diam : Silika gel 60F 254 Fase gerak : n-heksan : etil asetat (6:4) Isolat yang diperoleh dilarutkan kemudian ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F 254 (Merck Germany) dengan ukuran 5 x 5 cm. Lalu dielusi dengan eluen n-heksan : etil asetat (6:4) untuk arah pertama, dan n- heksan : etil asetat (4:6) untuk proses elusi yang kedua, proses elusi dilakukan dua kali dengan cara memutar lempeng berlawanan dengan arah jarum jam sehingga hasil elusi yang pertama menjadi titik awal pengelusian yang kedua, dari proses elusi tersebut diperoleh satu bercak tunggal, maka dapat diduga bahwa isolat tersebut adalah komponen kimia yang tunggal. b Gambar 4. Gambar KLT 2 Dimensi isolat Fase diam : Silika gel 60 F 254 Ukuran Lempeng : 5 x 5 cm Fase gerak 1 : n-heksan : etil asetat (6:4) (a) Fase gerak 2 : n-heksan : htil asetat (4:6) (b) a A B A B A B Gambar 5. Foto Hasil Kromatogram Isolat Menggunakan Variasi Eluen Keterangan Fase Diam : Silika gel 60 F 254 Ukuran Lempeng : 1 x 7 cm A : Penampak Bercak Sinar UV 254 B : Penampak Bercak Sinar UV 366 Fase Gerak 1 : etil asetat : aseton (1:1) (a) Fase Gerak 2 : etil asetat : koroform (1:1) (b) Tabel 3. Nilai R f dan warna bercak hasil kromatografi isolat pita I pada penampak bercak sinar UV 254 dan 366 nm menggunakan variasi eluen (Multi Eluen). Fase Gerak Etil asetat : aseton (1:1) Etil asetat : kloroform (1:1) Rf/warna UV 254 UV 366 0,81 0,875 0,81/o 0,875/o Pegujian selanjutnya adalah identifikasi secara reaksi kimia yaitu dengan menggunakan FeCl 3 yang menandakan adanya fenolik terdapat warna biru sampai hitam serta sitroborat dan AlCl 3 untuk mendeteksi adanya flavonoid, berpendar jika dilihat pada UV 366 nm. 261

6 A B C Gambar 6. Hasil Kromatografi Penampak Bercak Isolat A = Pereaksi FeCl 3 (+) B = Pereaksi sitroborat (+) C = Pereaksi AlCl 3 (+) Data spektroskopi Ultra violet- Visibel isolat pita II menunjukkan serapan maksimum pada panjang gelombang 418,12 nm. Dapat dilihat pada gambar. Gambar 7. Hasil Spektrofotometer UV-Vis Isolat 1. Senyawa aktif antioksidan dapat diisolasi dari daun sirsak (Annona muricata L.) dengan menggunakan pelarut metanol. 2. Berdasarkan hasil profil KLT senyawa aktif antioksidan tersebut berada pada nilai Rf 0,6 serta hasil spektrofotometri UV-Vis panjang gelombang isolat aktif antioksidan tersebut adalah 418,12 nm dengan absorbansi sebesar 0,400 dan didukung dengan penggunaan pereaksi yang menandakan bahwa isolat yang diperoleh dari daun sirsak diperkirakan merupakan turunan dari senyawa flavonoid. DAFTAR PUSTAKA Rahmawati, Ermin, Setyawati Karyono, Hidayat suyuti Efek Ekstrak Etanolik Daun Sirsak pada Proliferasi dan Apoptosis Sel Hela yang Dimediasi oleh P53. Universitas Brawijaya. Malang. Rianes,R Karakterisasi Simplisia dan Skrining Fitokimia Serta Uji Aktivitas Antioksidan Jus Buah Sirsak dan Ekstrak Etanol Daun sirsak (Annona muricata L.). Skripsi Universitas Sumatra Utara. Sarker., Zahid Latif., Alexander Gray., 2006, Natural Product Isolation 2 nd.humana Press Inc, Totowa, NJ. Subeki, Antioksidan Alami Terhadap Tumbuhan. Kanisius : Yogyakarta. Trilaksani, W Antioksidan: Jenis, Sumber, Mekanisme Kerja dan Peran Terhadap Kesehatan. Institute Pertanian Bogor, Bogor. Youngson, Robert Antioksidan : Manfaat Vitamin C dan E bagi Kesehatan. Arcan, Jakarta. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa : 262