AKTIVITAS SENYAWA ANTI

Transkripsi

1 AKTIVITAS SENYAWA ANTI β-laktamase DARI Streptomyces lavendulae IVNF1-1 TERHADAP VIABILITAS Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1-1 RESISTEN AMPISILIN CHOTIMAHWATI SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang berjudul, Aktivitas Senyawa Anti β-laktamase dari Streptomyces lavendulae IVNF1-1 terhadap Viabilitas Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1-1 Resisten Ampisilin adalah hasil karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Juni 2009 Chotimahwati G

3 ABSTRACT CHOTIMAHWATI. Activity of Inhibitor β-lactamase Compounds from Streptomyces lavendulae IVNF1-1 for Viability of Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1-1 Ampicillin-Resistant. Under Direction of YULIN LESTARI and SRI BUDIARTI ABSTRACT β-lactam antibiotics are most widely used and β-lactamase is the main cause of bacterial resistance to this antibiotics. The β-lactamase is structurally related to PBPs and is capable of hydrolyzing the amide bond of the β-lactam ring and inactivate β- lactam antibiotics. Streptomyces lavendulae IVNF1-1 is known to produce β- lactamase inhibitory compounds like clavulanic acid and β-lactamase inhibitory protein (BLIP). Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), a leading cause of human infantile diarrhea, is the prototype for a family of intestinal bacterial pathogens that induce attaching and effacing (A/E) lesions on host cells. To produce β-lactamase inhibitory compounds, S. lavendulae IVNF1-1 was grown in ISP-4 medium and incubated in a shaker agitated at 100 rpm for 10 days at room temperature. BLIP was precipitated with acetone, while clavulanic acid was extracted by using United States Patent Protein content in BLIP was 1.05 mg/ml and clavulanic acid content in the aqueous phase was 1.5 mg/ml. The inhibition capability indicated by the MIC and MBC values of BLIP was stronger than that of clavulanic acid. The MIC value of BLIP and clavulanic acid was at 350 ppm and 750 ppm, respectively. The MBC value of BLIP was at 400 ppm. while for clavulanic acid was at 1000 ppm. The combination between BLIP and clavulanic acid gave FICI value which is between 0.76 and 1, so it is categorized as an additive effect. Time killed kinetics assay of BLIP was at 1 hour, while for clavulanic acid required much longer time (12 hours). The results indicate that inhibitor β-lactamase compounds produced by S lavendulae IVNF1-1 has the potency to control EPEC resistance to β-lactam antibiotic. Further research is required to examine the effect of MIC and MBC value of BLIP and clavulanic acid against EPEC K1-1 in an in vivo experiment. Keywords: Streptomyces lavendulae IVNF1-1, EPEC, β-lactamase inhibitor, BLIP, clavulanic acid, MIC, FICI.

4 RINGKASAN CHOTIMAHWATI. Aktivitas Senyawa Anti β-laktamase dari Streptomyces lavendulae IVNF1-1 terhadap Viabilitas Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1-1 Resisten Ampisilin. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan SRI BUDIARTI. Antibiotik yang banyak digunakan adalah antibiotik β-laktam, diantaranya adalah penisilin, sefalosporin, dan sefamisin. Penghambatan yang spesifik pada pembentukan lapisan peptidoglikan menjadikan antibiotik β-laktam bersifat selektif, yaitu hanya menghambat pertumbuhan bakteri target tanpa membahayakan sel inang sehingga pemakaian antibiotik ini aman bila dibandingkan antibiotik jenis lain. Resistensi bakteri terhadap antibiotik β-laktam merupakan masalah yang serius di bidang kesehatan. Bakteri menjadi resisten terhadap antibiotik ini karena dapat menghasilkan enzim β-laktamase yang bekerja memecah dan menghidrolisis ikatan amida pada cincin β-laktam sehingga antibiotik ini tidak efektif lagi untuk pengobatan. Enzim β-laktamase dapat diinaktifkan oleh senyawa anti β-laktamase. Aktivitas senyawa anti β-laktamase yang dihasilkan oleh Streptomyces isolat lokal seperti isolat IVNF1-1 diketahui melalui dihasilkannya asam klavulanat dan β-laktamase Inhibitory Protein (BLIP). Aktivitas asam klavulanat dan BLIP dari Streptomyces lavendulae IVNF1-1 dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen belum diketahui sehingga perlu dilakukan penelitian ini. Penelitian ini bertujuan mengkaji aktivitas senyawa anti β-laktamase dari Streptomyces lavendulae IVNF1-1 yaitu asam klavulanat dan BLIP terhadap viabilitas EPEC K1-1 resisten ampisilin. Metode untuk mengetahui aktivitas asam klavulanat dan BLIP adalah memproduksi kedua senyawa tersebut pada medium ISP-4. Setelah inkubasi selama 10 hari filtrat kultur disentrifugasi dan dari supernatannya diisolasi asam klavulanat dan BLIP. Asam klavulanat diisolasi dalam bentuk garam karboksilat dengan metode United States Patent , sedangkan BLIP diisolasi dengan pengendapan protein menggunakan aseton. Asam klavulanat dan BLIP yang dihasilkan digunakan untuk uji antagonis dengan EPEC K1-1 untuk mengetahui Kadar Hambat Minimal (KHM), Kadar Bakterisida Minimal (KBM), Indeks Kadar Hambat Fraksi (IKHF), kinetika waktu kematian sel EPEC K1-1 dan aktivitas penghambatannya terhadap enzim β-laktamase. Isolat EPEC K1-1 memiliki pertumbuhan yang sangat cepat. Pada jam ke-3 isolat ini sudah mencapai jumlah sekitar 10 8 sel/ml (OD 0.32, λ 620 nm) pada media NB yang mengandung ampisilin 100 μg/ml. Peremajaan S. lavendulae IVNF1-1 pada media YMA membutuhkan waktu 7 hari untuk berspora penuh membentuk koloni berwarna merah muda Jika dibandingkan besarnya zona bening yang dihasilkan, ekstrak kasar menghasilkan zona bening terbesar (8 mm), diikuti dengan BLIP (5 mm) dan asam klavulanat (4.75 mm). Zona bening terbesar yang dihasilkan melalui uji antagonis filtrat kultur S. lavendulae IVNF1-1 pada umur produksi yang berbeda adalah pada umur produksi 10 hari yaitu 8 mm. Pada umur 5 hari zona beningnya 6 mm dan pada umur 15 hari zona beningnya 5.2 mm. Berat kering sel terbanyak tercapai pada hari ke-5, sedangkan berat kering sel terendah tercapai pada hari ke-10. Pada hari ke 15 berat kering sel S. lavendulae IVNF1-1 lebih tinggi dari hari ke-10 mungkin disebabkan jumlah sel S. lavendulae IVNF1-1 yang dimasukkan sebagai inokulan

5 tidak sama. Produksi senyawa metabolit sekunder pada S. lavendulae IVNF1-1 terjadi pada fase stasioner karena pada fase itu sel mulai kekurangan nutrisi dan udara sehingga sel menghasilkan metabolit sekunder untuk mempertahankan hidupnya. Nilai KHM dari BLIP adalah 350 ppm karena pada konsentrasi itu koloni yang tumbuh rata-rata sebanyak 56 koloni atau sekitar 5.6 x 10 2 sel/ml dan merupakan jumlah koloni terendah setelah dicawankan, sedangkan KHM asam klavulanat adalah 750 ppm karena pada konsentrasi tersebut koloni yang tumbuh rata-rata sebanyak 11 koloni atau sekitar 1.1 x 10 2 sel/ml. Sedangkan nilai KBM dari BLIP adalah 400 ppm sedangkan KBM dari asam klavulanat adalah 1000 ppm karena pada konsentrasi itu tidak ada koloni sel EPEC K1-1 yang tumbuh setelah dicawankan. BLIP dan asam klavulanat bersifat bakterisida. Konsentrasi BLIP mematikan sel EPEC K1-1 lebih rendah daripada asam klavulanat, maka dapat dikatakan BLIP lebih kuat daya bakterisidanya daripada asam klavulanat. Asam klavulanat dan BLIP bekerja menghambat enzim β-laktamase dan menyebabkan enzim tersebut tidak menginaktifkan ampisilin sehingga ampisilin dapat mengganggu pembentukan lapisan peptidoglikan dinding sel EPEC K1-1. Akibatnya pada saat membelah sel EPEC akan lisis dan mati. Hasil foto mikroskop elektron payaran pada sel EPEC K1-1 yang diuji dengan BLIP dan asam klavulanat menunjukkan kerusakan dinding sel tersebut (Prakoso 2009) Rata-rata Indeks KHF dari asam klavulanat dan BLIP adalah 0.843, berkisar antara 0.76 dan 1 sehingga BLIP dan asam klavulanat bersifat efek aditif. Artinya pemakaian kombinasi BLIP dan asam klavulanat saling menguatkan meskipun hanya sedikit, namun dalam penelitian ini belum menunjukkan efek sinergistik. Jadi pemakaian kombinasi BLIP dan asam klavulanat dapat dilakukan karena tidak bersifat antagonistik. Hasil kinetika waktu kematian sel EPEC K1-1, menunjukkan bahwa BLIP dapat mematikan sel setelah waktu inkubasi 1 jam, sedangkan asam klavulanat mematikan sel tersebut setelah inkubasi 12 jam. Jika dilihat dari konsentrasi KBM dan waktu untuk mematikan sel EPEC K1-1, BLIP memiliki kemampuan penghambatan lebih kuat daripada asam klavulanat. Hal ini disebabkan asam klavulanat bekerja dengan menginaktifkan enzim β-laktamase sedangkan BLIP dapat menghambat enzim β-laktamase dan PBPs sehingga aktivitasnya menjadi lebih kuat. Kombinasi BLIP dan asam klavulanat 350:400 dapat mematikan sel EPEC K1-1 setelah inkubasi 2 jam sedangkan pada kombinasi 100 ppm BLIP:400 ppm asam klavulanat baru dapat mematikan bakteri tersebut setelah inkubasi 4 jam. Meskipun demikian pengaruh BLIP dan asam klavulanat perlu diuji kefektifannya secara klinis sehingga dapat diketahui kestabilan dari kedua senyawa anti β-laktamase tersebut. Jika dilihat dari motilitasnya, ternyata sampai konsentrasi KHM BLIP maupun KHM asam klavulanat sel EPEC K1-1 masih bersifat motil. BLIP dan asam klavulanat bekerja menghambat sintesis peptidoglikan dari dinding sel bakteri, sedangkan flagela E.coli disintesis dan terletak pada membran sitoplasma, sehingga penambahan BLIP dan asam klavulanat tidak mempengaruhi motilitas dari bakteri ini. Aktivitas β-laktamase EPEC K1-1 sebesar 3.31 x 10-4 U/ml. Hasil ini menunjukkan bahwa EPEC K1-1 memiliki mekanisme resistensi terhadap antibiotik β-laktam melalui pembentukan β-laktamase. Hasil uji anti β-laktamase menunjukkan bahwa aktivitas hambatan asam klavulanat lebih besar daripada BLIP maupun

6 kombinasi. BLIP adalah suatu protein sedangkan asam klavulanat adalah antibiotik β-laktam dalam bentuk garam karboksilat yang lebih stabil. Aktivitas spesifik dari asam klavulanat juga lebih besar bila dibandingkan dengan BLIP. Pada penelitian ini aktivitas spesifik dari BLIP sebesar %/ mg dengan kandungan protein sebesar 1.05 mg/ml. Aktivitas hambatan enzim β-laktamase pada kombinasi BLIP dan asam klavulanat lebih kecil daripada BLIP maupun asam klavulanat. BLIP dapat mematikan EPEC K1-1 pada konsentrasi yang lebih rendah dan dalam waktu yang lebih cepat daripada asam klavulanat maupun kombinasi BLIP dan asam klavulanat. Secara in vitro pemakaian BLIP saja lebih menguntungkan daripada asam klavulanat maupun kombinasi. Hasil uji anti β-laktamase menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan BLIP lebih rendah daripada asam klavulanat namun BLIP memiliki aktivitas bakterisida lebih kuat. Hal ini mengindikasikan bahwa BLIP bekerja tidak hanya menghambat enzim β-laktamase, tetapi juga menghambat enzim PBPs untuk mematikan EPEC K1-1. Dari hasil ini diperlukan penelitian lanjutan tentang pengaruh BLIP dan asam klavulanat terhadap EPEC K1-1 secara in vivo untuk mengetahui keamanan pemakaian kedua senyawa tersebut. Kata kunci: Streptomyces lavendulae IVNF1-1, EPEC, senyawa anti β-laktamase, BLIP, asam klavulanat, KHM, KBM, IKHF.

7 Hak Cipta milik IPB tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

8 AKTIVITAS SENYAWA ANTI β-laktamase DARI Streptomyces lavendulae IVNF1-1 TERHADAP VIABILITAS Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1-1 RESISTEN AMPISILIN CHOTIMAHWATI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Mayor Mikrobiologi SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

9 Judul Tesis : Aktivitas Senyawa Anti β-laktamase dari Streptomyces lavendulae IVNF1-1 Terhadap Viabilitas Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1-1 Resisten Ampisilin Nama : Chotimahwati NRP : G Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Yulin Lestari Ketua Dr. dr. Sri Budiarti Anggota Diketahui Ketua Mayor Mikrobiologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Gayuh Rahayu Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodipuro, M.S Tanggal Ujian: 25 Mei 2009 Tanggal lulus:

10 Penguji Luar Komisi Ujian Tesis: drh. Min Rahminiwati. M.S. PhD.

11 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juni 2008 sampai Februari 2009 adalah Senyawa Anti β-laktamase, dengan judul Aktivitas Senyawa Anti β-laktamase dari Streptomyces lavendulae IVNF1-1 terhadap Viabilitas Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1-1 Resisten Ampisilin. Penulis menyampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih yang sebesarbesarnya terutama kepada Pembimbing, yaitu Dr. Ir. Yulin Lestari dan Dr. dr. Sri Budiarti yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran selama penulis menempuh studi S2. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada drh. Min Rahminiwati, M.S. PhD. selaku Penguji Luar Komisi yang telah banyak memberikan koreksi dan arahan untuk perbaikan tesis. Terima kasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Departemen Agama Republik Indonesia yang telah mengadakan program beasiswa pascasarjana dengan IPB. Penulis juga mengucapkan banyak terima kasih kepada Kepala MAN Tuban, Bapak H. Drs. S. Sumari, MPdI yang telah memberi ijin penulis untuk tugas belajar di IPB, serta teman-teman guru MAN Tuban atas dukungannya. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada suami, anak-anak, Bapak, Ibu, Ibu Mertua, kakak, adik dan seluruh keluarga atas doa, kasih sayang dan keikhlasannya. Tidak lupa kepada rekan-rekan yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu, penulis mengucapkan banyak terima kasih atas bantuan dan kebersamaannya. Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu kritik dan saran sangat diharapkan. Penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi pembaca. Bogor, Juni 2009 Chotimahwati

12 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tuban pada tanggal 3 Maret 1969 dari bapak Katim dan ibu Suramlah. Penulis merupakan putri pertama dari empat bersaudara. Pendidikan Dasar sampai Menengah Atas diselesaikan di Tuban. Pada tahun 1988 penulis menempuh kuliah pada program D-3 di jurusan Pendidikan Biologi IKIP Malang dan lulus tahun Pada tahun tersebut penulis meneruskan program sarjana pada perguruan tinggi yang sama dan lulus tahun Pada tahun 2007, penulis mendapatkan beasiswa dari Departemen Agama Republik Indonesia untuk melanjutkan studi pada mayor Mikrobiologi, Sekolah Pascasarjana IPB. Penulis menikah dengan Rudi Hartoyo pada tahun 1997 dan dikaruniai 4 orang anak, Faris Alfathoni, Izza Elmila, Rafli Zainur Rohim dan Asyrul Yasjuda Rifqi. Penulis bekerja sebagai guru honorer di SMAN 3 Tuban pada tahun 1994 sampai Pada tahun 1996 penulis diterima sebagai PNS di Departemen Agama dan ditugaskan sebagai guru biologi MAN Tuban sampai sekarang.

13 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... vi DAFTAR GAMBAR... vii DAFTAR LAMPIRAN... viii PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan... 3 Manfaat... 3 TINJAUAN PUSTAKA Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)... 4 Streptomyces dan Antibiotik β-laktam... 5 Enzim β-laktamase... 6 Senyawa Anti β-laktamase... 7 Streptomyces... 9 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan Peremajaan Bakteri Produksi Senyawa Anti β-laktamase Produksi BLIP (pengendapan dengan aseton) Ekstraksi Asam Klavulanat Uji Antagonis Ekstrak Kasar, BLIP dan Asam Klavulanat terhadap... Pertumbuhan EPEC K1-1 dengan Metode Kirby-Bauer Pengujian Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bakterisida... Minimal (KBM) Pengujian Kinetika Waktu Kematian Sel EPEC K Pengukuran Aktivitas Enzim β-laktamase Pengukuran Aktivitas Senyawa Anti β-laktamase HASIL DAN PEMBAHASAN Peremajaan Bakteri Target Aktivitas Penghambatan Streptomyces lavendulae IVNF1-1 terhadap... Pertumbuhan EPEC K Kandungan Protein dan Asam Klavulanat dalam Filtrat Kultur S. lavendulae IVNF Uji Antagonis Ekstrak Kasar, BLIP, dan Asam Klavulanat Terhadap EPEC K Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bakterisida Minimal (KBM) 20 Kinetika Waktu Kematian Sel EPEC K

14 Aktivitas Enzim β-laktamase Aktivitas Asam Klavulanat dan BLIP dalam Menghambat β-laktamase.. 27 SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 36