AKTIVITAS ANTIOKSIDASI DAN ANTIKANKER EKSTRAK KULIT BATANG LANGSAT [Lansium Domesticum L.] MOKOSULI YERMIA SEMUEL

Transkripsi

1 AKTIVITAS ANTIOKSIDASI DAN ANTIKANKER EKSTRAK KULIT BATANG LANGSAT [Lansium Domesticum L.] MOKOSULI YERMIA SEMUEL SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang Langsat (Lansium domesticum L.) adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Februari 2008 Mokosuli Yermia Semuel NIM G

3 ABSTRACT MOKOSULI YERMIA SEMUEL. Antioxidation and anticancer activity of tree barks of Langsat (Lansium domesticum L.). Under direction of MARIA BINTANG and MEGA SAFITHRI. Oxidative stress by radical oxygen species (ROS) caused cell damaged and cancer. The objective of this research was to know the activity of etanol extract of tree barks from Langsat (Lansium domectisuml.) dried (KBLK) and wet (KBLB) as antioxidation and anticancer. This research consisted of four steps, the first step was extration and phytochemistry analysis using Harborne method. The second step was Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) to know the toxicity of the extract using Mc Laughlin method. The third step was examination of antioxidation activity using DPPH method and TBA method and the last step was examination of anticancer activity of the extract using murine leukimia P388 cell line. The result of this research showed that etanol extract of tree barks of L. domesticum L. had antioxidation and anticancer activity. The IC 50 of BSLT was µg/ml and 100,37 µg/ml respectively. The IC 50 of antioxidation activity using DPPH method was 174,19 µg/ml and 205,38 µg/ml respectively. Inhibition of linoleat oxidation by TBA method was 82,83% and 85,22%. The IC 50 of anticancer test was µg/ml and µg/ml. The result of phytochemistry analysis showed KBLK and KBLB have alkaloid, flavonoid, saponin and tanin compounds. The conclusion of this experiment ware etanol extract of KBLK and KBLB have a strong anticancer and antioxidation activity. Keywords : Lansium domesticum L, antioxidation, anticancer.

4 RINGKASAN MOKOSULI YERMIA SEMUEL. Aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang langsat (Lansium domesticum L.) dibimbing oleh MARIA BINTANG dan MEGA SAFITHRI. Kematian akibat kanker di Amerika Serikat menempati posisi kedua setelah penyakit jantung. Diperkirakan satu dari tiga orang di AS mengalami perkembangan kanker dalam tubuhnya (Cooper, 1993). Kanker menyebabkan lebih dari kematian tiap tahun di Amerika Serikat (Katzung, 1995). Insiden kanker di Indonesia diperkirakan 100 per penduduk per tahun atau sekitar penduduk per tahun (Puspitasari et al. 2003). Akhir-akhir ini upaya pengobatan kanker dengan kemoterapi banyak dilakukan. Bahan kemoterapi dari tumbuhan mempunyai prospek sebagai penghambat kanker yang lebih sedikit efek sampingnya. Distribusi senyawa fitokimia yang memiliki aktivitas antikanker sangat luas dalam tumbuhtumbuhan. National Cancer Institute melakukan skreening sekitar ekstrak tumbuhan dari tahun 1960 sampai 1982 dan menemukan sekitar sampel tumbuhan memiliki aktivitas antikanker. Tahun 1991 sekitar sampel tumbuhan dari seluruh dunia telah dikoleksi karena memiliki aktivitas antikanker. Sekitar 62 % dari 87 jenis obat antikanker berasal dari bahan alam (Cragg, 1993). Salah satu tanaman asli Indonesia yang diduga memiliki potensi anti kanker adalah langsat (L. domesticum L). Secara empiris tanaman ini telah digunakan masyarakat pedalaman Kalimantan dan Minahasa sebagai obat antimalaria, tumor dan kanker. Biji tanaman ini secara tradisional telah digunakan untuk mengobati penyakit parasit malaria. Namun belum ada laporan ilmiah pemanfaatan ekstrak bagian tanaman ini sebagai obat antikanker. Kearifan budaya etnomedikal masyarakat Indonesia yang diperoleh turun temurun perlu dilestarikan dan dikembangkan sehingga dapat bermanfaat bagi kesejahteraan manusia. Untuk membuktikan secara ilmiah dilakukan penelitian dengan tujuan mengetahui kandungan senyawa fitokimia yang memiliki aktivitas antioksidan dan antikanker dari ekstrak kulit pohon langsat [L. domesticum L] dan mengetahui aktivitas in vitro antioksidasi dan aktivitas antikanker ekstrak kulit pohon Langsat [L. domesticum L.] pada sel kanker murine leukimia P-388. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB dan Laboratorium Kimia Bahan Alam Institut Teknologi Bandung. Penelitian dimulai bulan September 2007 sampai dengan Januari Kulit batang langsat (L. domesticum L.) diperoleh dari perkebunan rakyat Minahasa Utara propinsi Sulawesi Utara. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pareaksi Dragendorff, pareaksi Mayers, pareaksi Wagner, etanol 95%, HCL, logam Mg, Na 2 CO 3, FeCl 3, H 2 SO 4 dan anhidrida asetat. 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), butil hidroksi toluena (BHT), NaOH 10 % asam asetat anhidrida, kertas saring, air bebas ion, etanol 75%, etanol absolut, asam linoleat, buffer fosfat 0.1 M ph 7, Fe CL 2.4H 2 O, HCL, amonium tiosianat, α-tokoferol, 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 6 M, asam tiobarbiturat (TBA), asam asetat 50 % dan asam trikloroasetat (TCA) 20 %. Sel kanker murine leukimia P-388, media RPMI, serum fetal bovine, kanamisin, reagen pewarna 3-(4,5-dimetil thiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolium bromida, larutan 10% SDS-0,01 N HCL. Alat yang digunakan antara lain tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas ukur, erlenmeyer, pengaduk, hot plate dan neraca

5 analitik, ph indikator, botol gelap berulir, inkubator, sentrifuse model 800, spektrofotometer UV-Vis U-2800 Hitatchi, perangkat sumur kultur, mikropipet dan microplate reader. Penelitian ini terdiri atas empat tahap yaitu : (1) Ekstraksi dan analisis fitokimia (2) Uji toksisitas metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (3) Analisis potensi antioksidasi in vitro menggunakan metode DPPH dan metode TBA dan (4) Analisis potensi antikanker secara in vitro menggunakan sel murine leukimia P388. Hasil analisa fitokimia pada ekstrak etanol 70% dan kloroform:air menunjukkan adanya senyawa fitokimia golongan alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin. Senyawa triterpenoid dan steroid hanya dalam intensitas yang sedikit. Berdasarkan nilai LC 50 dari hasil uji BSLT ekstrak KBLK EtOH (LC 50 93,48 ppm) dan KBLB (LC ,37 ppm) menunjukkan aktivitas toksisitas yang kuat. Suatu ekstrak tumbuhan berpotensi antikanker dengan uji BSLT menurut NCI jika nilai LC 50 <1000 ppm. Hasil analisis antioksidasi dengan metode DPPH ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH (IC ,19 ppm dan 205,38 ppm) menunjukkan aktivitas peredaman radikal bebas yang kuat dibandingkan dengan kontrol BHT (IC ,45). Dengan metode TBA ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH juga menunjukkan aktivitas penghambatan oksidasi asam linoleat yang kuat pada konsenterasi 200 ppm (82,83% dan 85,22%) dibandingkan dengan kontrol α- tokoferol pada konsenterasi yang sama (77,81%). Pengujian aktivitas antikanker menunjukkan bahwa ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH memiliki aktivitas sitotoksik yang kuat pada sel murine leukimia P388 yaitu masing-masing 12 ppm dan 15,48 ppm. Menurut NCI ekstrak kasar digolongkan berpotensi antikanker apabila nilai IC 50 < 20 ppm. Terdapat hubungan aktivitas antioksidasi, toksisitas BSLT, aktivitas antikanker dan kandungan fitokimia ekstrak. Aktivitas antioksidasi dan antikanker dari ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH disebabkan oleh kandungan alkaloid, flavonoid saponin dan tanin yang terdapat pada ekstrak tersebut. Ekstrak kulit batang langsat berpotensi dikembangkan sebagai sumber senyawa fitokimia antikanker. Dari hasil penelitian ini disarankan untuk dilakukan uji in vitro pada berbagai jenis sel kanker dan uji in vivo ekstrak pada hewan uji untuk mengetahui LD 50 dalam rangka penemuan sumber senyawa fitokimia obat antikanker dan sumber antioksidan yang baru.

6 Hak cipta milik IPB, tahun 2008 Hak cipta dilindungi undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu makalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

7 AKTIVITAS ANTIOKSIDASI DAN ANTIKANKER EKSTRAK KULIT BATANG LANGSAT [Lansium Domesticum L.] MOKOSULI YERMIA SEMUEL Tesis Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biokimia SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

8 Judul Nama NRP : Aktivitas Antioksidasi dan Antikanker Ekstrak Kulit Batang Langsat [Lansium domesticum L.] : Mokosuli Yermia Semuel : G Disetujui : Komisi Pembimbing Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Ketua Mega Safithri, S.Si, M.Si Anggota Diketahui : Ketua Program Studi Biokimia Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Prof.Dr.drh.Maria Bintang, MS Prof.Dr.Ir.Khairil Anwar Notodiputro, MS Tanggal Ujian : 17 Maret 2008 Tanggal lulus :

9 PRAKATA Saya sangat bersyukur kepada TUHAN karena tanpa anugerahnya saya tidak pernah mendapat kesempatan studi di Institut Pertanian Bogor dan dapat menyelesaikan tugas akhir program magister biokimia. Suatu kebanggaan bagi saya untuk dapat belajar biokimia di Institut Pertanian Bogor. Atas ketertarikan penulis dalam bidang pemanfaatan bahan tumbuhan sebagai sumber obat maka penulis melakukan penelitian tentang aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang Langsat [Lansium domesticum L.]. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan September 2007 sampai awal Februari Terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Ibu Prof Dr. drh. Maria Bintang, MS dan Ibu Mega Safithri, SSi, MSi selaku pembimbing atas segala arahan dan bimbingan selama penelitian serta kepercayaan dan kesabaran dalam membimbing sampai terselesaikannya penyusunan tesis ini. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Rektor Universitas Negeri Manado bapak Prof.Drs.J.L.L.Lombok,SH yang memberikan kesempatan belajar di IPB Bogor dengan biaya BPPS Direktorat Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional. Semasa studi ada banyak orang yang membantu saya namun tidak ada yang melebihi bantuan isteri tercinta Reinny S. Tuegeh, SSi yang dengan tekun dan sabar memberi semangat serta mendoakan keberhasilan studi juga orang tua yang turut menopang dalam doa. Kepada teman-teman Biokimia angkatan 2006 disampaikan terima kasih atas bantuan dan dukungan selama studi. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Februari 2008 Mokosuli Y. Semuel

10 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tambun Kabupaten Bolaang Mongondow pada tanggal 21 Maret 1980 dari Ayah Benyamin Gayus Mokosuli dan Ibu Mien Ritha Suoth. Penulis adalah putera pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2003 menyelesaikan pendidikan sarjana sains biologi di FMIPA Universitas Negeri Manado dengan predikat cum laude. Setelah lulus dipanggil sebagai asisten dosen di Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Manado disamping mengajar mata pelajaran Biologi di SMA Kristen Binaan khusus Tomohon. Tahun 2005 diangkat menjadi staf dosen pegawai negeri sipil di Universitas Negeri Manado pada FMIPA Jurusan Biologi. Tahun 2006 mendapatkan kesempatan tugas belajar di Institut Pertanian Bogor Program Magister Biokimia dengan biaya BPPS Dikti Depdiknas. Di tahun yang sama TUHAN memberikan pendamping hidup Reinny Silvana Tuegeh, S.Si.

11 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... xi DAFTAR GAMBAR... xii DAFTAR LAMPIRAN... xiii PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Langsat... Radikal Bebas... Antioksidan... Kanker... BAHAN DAN METODE Waktu dan tempat... Bahan dan alat... Diagram alir penelitian... Ekstraksi kulit batang Lansium domesticum L.... Analisisi fitokimia... Uji toksisitas metode BSLT... Uji aktivitas antioksidasi... Uji aktivitas antikanker pada sel murine leukimia P Analisis data... HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi... Analisis fitokimia... Aktivitas toksisitas metode BSLT... Aktivitas antioksidasi metode DPPH... Aktivitas antioksidasi metode TBA... Aktivitas antikanker pada sel murine leukimia P SIMPULAN DAN SARAN... DAFTAR PUSTAKA... LAMPIRAN

12 DAFTAR TABEL Halaman 1. Klasifikasi umum agen karsinogenesis Flavonoid antikanker Rendemen ekstrak KLBB dan KLBK Hasil analisis fitokimia KLBB dan KLBK Nilai LC 50 ekstrak etanol KBLK dan KBLB Nilai IC 50 aktivitas antioksidan ekstrak metode DPPH dibandingkan dengan kontrol BHT Aktivitas inhibisi ekstrak terhadap radikal DPPH Konsenterasi MDA oksidasi asam linoleat metode TBA Perbandingan aktivitas antioksidasi, toksisitas dan antikanker ekstrak etanol kulit batang langsat

13 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Batang, daun dan buah langsat (Lansium domesticul L.).. 2. Interaksi species oksigen reaktif (ROS) terhadap biomolekul di dalam sel Keseimbangan radikal bebas-antioksidan sangat diperlukan di dalam tubuh Mutasi dan proses perkembangan kanker hati Tipe progresi tumor Ceflatonin dan phenoxodiol, obat antikanker dari tumbuhan Diagram alir penelitian Histogram mortalitas A. Salina Leach pada berbagai konsenterasi ekstrak Reaksi antara DPPH dan antioksidan Struktur flavonoid dengan aktivitas antiradikal yang tinggi Reaksi Scavenging radikal bebas DPPH* oleh flavonoid Daya hambat oksidasi asam linoleat ekstrak. (a) KBLK EtOH (b) KBLB EtOH Peroksidasi lipid pada asam lemak tak jenuh rantai panjang Reaksi MDA dan TBA Perbandingan aktivitas antioksidasi metode DPPH dan TBA Perbandingan aktivitas toksisitas ekstrak metode BSLT dan sitotoksik in vitro pada sel murine leukimia P

14 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Diagram alir penelitian Ekstraksi kulit batang Lansium domesticum L. 3. Analisis antioksidasi metode TBA Pengambilan sampel dan eksraksi Hasil ekstraksi dan analisis fitokimia Analisis hasil uji toksisitas metode BSLT Analisis hasil uji antioksidasi metode DPPH Analisis hasil uji antioksidasi metode TBA Hasil uji sitotoksik in vitro pada sel murine leukimia P Formulasi media RPMI

15 PENDAHULUAN Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkendali dengan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan biologis lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan (invation) atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (metastasis). Pertumbuhan yang tidak terkendali tersebut disebabkan oleh kerusakan DNA yang mengakibatkan mutasi pada gen vital yang mengontrol pembelahan sel. Beberapa kejadian mutasi dapat mentransformasi materi genetik sel normal menjadi sel kanker. Mutasi-mutasi tersebut dapat diakibatkan oleh agen kimia, biologi maupun fisik yang disebut karsinogen. Mutasi dapat terjadi secara spontan (diperoleh) ataupun diwariskan (mutasi germline). Kanker telah menjadi penyakit yang sangat ditakuti saat ini. Kematian akibat kanker di Amerika Serikat menempati posisi kedua setelah penyakit jantung. Diperkirakan satu dari tiga orang di AS mengalami perkembangan kanker dalam tubuhnya (Cooper, 1993). Kanker menyebabkan lebih dari kematian tiap tahun di Amerika Serikat (Katzung, 1995). Laporan berbagai lembaga riset penelitian kanker di Indonesia menyatakan prevelensi penyakit kanker di Indonesia cenderung meningkat. Insiden kanker di Indonesia diperkirakan 100 per penduduk per tahun atau sekitar penduduk per tahun (Puspitasari et al. 2003). Kanker terjadi pada sel-sel normal melalui suatu kesalahan genetika, kemudian berubah menjadi sel-sel ganas yang berploriferasi dengan cepat. Kanker lebih mudah tejadi pada sel yang terus menerus membelah dan memperbanyak diri, misalnya sel-sel kulit, sel-sel epitel lambung, saluran pencernaan dan paruparu sebagai akibat hubungan yang sangat intensif dengan faktor lingkungan (udara dan makanan) sehingga lebih mudah dipengaruhi senyawa karsinogenik. Proses perubahan ini dikenal dengan istilah karsinogenesis. Karsinogenesis dibagi dalam beberapa tahap yaitu inisiasi, promosi dan progresi (Contran et al. 1994). Tumor (bahasa Latin = pembengkakan) menunjukan massa jaringan yang tidak normal, tetapi dapat berupa "ganas" (bersifat kanker) atau "jinak" (tidak bersifat

16 2 kanker). Tumor ganas yang mampu menyerang jaringan lainnya ataupun bermetastasis. Perubahan pola makan di negara-negara berkembang seperti Indonesia mulai meninggalkan makanan tradisional ke makanan cepat saji (fast food) memberikan efek yang tidak baik bagi kesehatan. Makanan yang disukai masyarakat Indonesia pada umumnya saat ini adalah makanan dengan kandungan lemak/minyak tinggi (gorengan), daging dan produk olahan daging, makanan dengan kandungan garam/penyedap tinggi serta makanan olahan dengan pengawet. Jenis-jenis makanan tersebut telah menjadi makanan idola jajanan anak-anak sekolah maupun masyarakat umum. Akibatnya muncul penyakit non infektif seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi dan kanker. Disamping hal tersebut di atas, Indonesia sebagai negara dengan wilayah laut yang luas sehingga masyarakat sangat menyukai mengkonsumsi ikan. Konsumsi ikan laut sangat baik bagi kesehatan karena mengandung protein tinggi dan asam lemak esensial yang dibutuhkan oleh tubuh. Namun bentuk olahan ikan yang mudah dan umum dilakukan dengan panggangan dan pengasapan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ikan atau daging yang hangus setelah dipanggang mengandung senyawa polisiklik aromatik hidrokarbon yang merupakan karsinogen kuat. Proses pengasapan daging atau ikan membentuk benzo(a)pirene yang bersifat karsinogen kuat. Penggunaan minyak goreng berulang kali dapat menyebabkan terjadinya oksidasi atau polimerisasi menghasilkan asam lemak trans atau bentuk-bentuk senyawa radikal bebas yang bila dikonsumsi dapat menimbulkan kerusakan seluler (Greenwald, 1996). Karsinogenesis berlangsung dalam waktu yang lama sekitar 10 sampai 20 tahun tetapi dapat juga terjadi lebih cepat tergantung pada intensitas paparan agenagen karsinogenik. Kanker dapat menyebabkan banyak gejala yang berbeda, bergantung pada lokasinya dan karakter dari keganasan dan apakah ada metastasis. Sebuah diagnosis yang menentukan biasanya membutuhkan pemeriksaan mikroskopik jaringan yang diperoleh dengan biopsi. Setelah didiagnosis, penderita kanker biasanya dirawat dengan operasi, kemoterapi atau radiasi. Bila tidak segera di obati, kebanyakan kanker menyebabkan kematian.

17 3 Akhir-akhir ini upaya pengobatan kanker dengan kemoterapi banyak dilakukan. Bahan kemoterapi dari tumbuhan mempunyai prospek sebagai penghambat kanker yang lebih sedikit efek sampingnya. Distribusi senyawa fitokimia yang memiliki aktivitas antikanker sangat luas dalam tumbuhtumbuhan. NCI (National Cancer Institute) melakukan skrining sekitar ekstrak tumbuhan dari tahun 1960 sampai 1982 dan menemukan sekitar sampel tumbuhan memiliki aktivitas antikanker. Tahun 1991 sekitar sampel tumbuhan dari seluruh dunia telah dikoleksi karena memiliki aktivitas antikanker. Sekitar 62% dari 87 jenis obat antikanker berasal dari bahan alam (Cragg, 1993). Hasil penelitian menunjukkan jenis buah-buahan dan sayuran segar berpotensi preventif dan antikanker. Konsumsi sayur dan buah yang mengandung flavonoid dapat menekan perkembangan kanker (Chatterjee, 1999). Apel kaya akan serat dan flavonoid. Flavonoid apel tertinggi dibandingkan dengan jenis buah-buahan lainnya. Flavonoid dilaporkan mampu menahan resiko terkena kanker paru-paru sampai 50%. Penelitian Cornell University membuktikan bahwa zat fitokimia yang terdapat dalam apel tersebut menghambat pertumbuhan sel kanker usus sebesar 43%. Apel juga memiliki komponen fitokimia antikanker seperti asam elegat, asam kafeat, asam klorogenat dan glutation. Asam elagat berperan sebagai "obat" antikanker generasi baru, dengan kerja utama melindungi kromosom dari kerusakan dan menghambat kerja dari banyak karsinogen, seperti asap rokok (dikenal secara kolektif sebagai polycylic aromatic hydrocarbons dan bahan-bahan kimia beracun seperti benzopyrene). Sementara glutation adalah bahan antikanker penting yang menangkal efek racun dari logam berat, seperti timah hitam. Zat tersebut juga dapat mengeliminasi pestisida dan bahan pelarut. Selain apel, jeruk juga dilaporkan mengandung glutation (senyawa antikanker dan antioksidan yang amat kuat) dengan kadar tinggi (Cooper, 1993). Beberapa tumbuhan memiliki komponen antitumor berupa senyawa fitokimia yang dikenal dengan pencegah kanker (cancer chemoprevention). Pencegahan kanker menggunakan senyawa fitokimia adalah salah satu upaya menggunakan bahan kimia alam yang diharapkan dapat mencegah tahap awal dari suatu karsinogenesis, sebelum terjadi penyebaran lebih jauh. Senyawa antitumor

18 4 dan antikanker pada tanaman diantaranya indol isothiosianat, dithiolthion dan organo sulfur yang banyak pada crucifera. Murakami et al, (1999) menyatakan bahwa dari 107 species tanaman yang diuji sebagai antitumor berasal dari famili Zingiberaceae dan Umbelliferae. Eksrak lengkuas mengandung ACA (1 asetoksi khavikol asetat). Kandungan tertinggi pada eksrak etil asetat dengan waktu maserasi 48 jam sekitar 1,62 ± 0,02 %. Memiliki potensi mengambat semua jenis alur sel kanker dan sel kanker primer manusia. Aktivitas antikanker ekstrak lengkuas disebabkan oleh kemampuan ekstrak ini meningkatkan interferon-y (INF-y) oleh alir sel kanker paru-paru, leukimia, melanoma primer, melanoma metastase dan kanker serviks (Rusmarilin, 2003). Kandungan isoflavon terdapat dalam tanaman sayuran, buah-buahan, padi-padian dan kacang-kacangan terutama banyak pada kedelai. Geneistein pada dosis 37 mm mampu menghambat aktivitas tirosin kinase, konsenterasi 20 mm menghambat proliferasi sel dan sel MCF-7 (sel kanker payudara). Daun, buah dan kulit batang tumbuhan mengandung senyawa golongan flavonoid dan polifenol (Sarjono, 2004; Harborne, 1996). Bioprospeksi dan eksplorasi tumbuhan yang berpotensi preventif kanker dan antikanker perlu terus dilakukan mengingat penyakit kanker diperkirakan prevelensinya akan terus meningkat di negara-negara berkembang termasuk Indonesia. Sebagian besar bahan bioaktif farmasi atau produk jadinya sebagai obat antioksidasi dan terapi kanker masih diimpor dan juga harganya sangat mahal. Salah satu tanaman asli Indonesia yang diduga memiliki potensi anti kanker adalah langsat (Lansium domesticum L.). Daun tanaman langsat mengandung alkaloida, saponin, flavonoida dan polifenol. Secara empiris tanaman ini telah digunakan masyarakat pedalaman Kalimantan dan Minahasa Utara sebagai obat antimalaria, tumor dan kanker. Biji tanaman ini secara tradisional telah digunakan untuk mengobati penyakit parasitologis malaria. Namun belum ada laporan ilmiah pemanfaatan ekstrak bagian tanaman ini sebagai obat antikanker. Kearifan budaya etnomedikal masyarakat Indonesia yang diperoleh turun temurun perlu dilestarikan dan dikembangkan sehingga dapat bermanfaat bagi kesejahteraan manusia. Adanya kandungan alkaloid, flavonoid dan polifenol lainnya pada tanaman langsat diduga berpotensi antikanker.

19 5 Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa fitokimia yang memiliki potensi antioksidasi dan antikanker dari ekstrak kulit batang langsat [L. domesticum L.] dan mengetahui aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang langsat [L. domesticum L.] in vitro pada sel kanker murine leukimia P388. Dalam penelitian ini dirumuskan hipotesis bahwa terdapat senyawa fitokimia yang bersifat antikanker dari ekstrak kulit batang langsat [L. domesticum L.]. Senyawa tersebut memiliki aktivitas antioksidasi dan aktivitas antikanker yang kuat. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang aktivitas antioksidasi dan aktivitas antikanker ekstrak kulit batang langsat [L. domesticum L.] dan juga diharapkan dapat meningkatkan nilai guna dan nilai ekonomis tanaman.

20 TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Langsat Tanaman langsat adalah tanaman buah yang cukup dikenal di Indonesia. Tanaman ini dibudidayakan masyarakat dengan tujuan utama memanen buahnya saja. Tanaman ini berhabitus pohon dengan tinggi sekitar meter. Berakar tunggang, batang berkayu, bulat, bercabang dan putih kotor. Daun majemuk, bulat telur, ujung meruncing, pangkal runcing, panjang sekitar 20 cm, lebar 10 cm, bertangkai dan berwarna hijau. Bunga majemuk, bentuk tandan pada batang dan cabang, menggantung dengan panjang sekitar cm. Buah buni, bulat, berdiameter 2-4 cm, beruang lima, kuning kecoklatan. Rasa buah muda asam dan bergetah dengan biji berwarna hijau dan berasa pahit. Kulit batang berasa lebih pahit dibandingkan dengan biji (Simbala et al. 2004). Dari segi kandungan fitokimia, belum banyak dilaporkan. Daun tumbuhan ini diduga mengandung alkaloida, saponin, flavonoida dan polifenol. Biji langsat telah dimanfaatkan masyarakat sebagai obat cacing, obat demam dan obat diare. Menurut Simbala et al. (2004) tanaman langsat diklasifikasikan sebagai berikut: Dunia : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Sapindales Famili : Meliaceae Genus : Lansium Species : Lansium domesticum L. Gambar 1 Batang, daun dan buah langsat (L. domesticum L.).

21 7 Radikal bebas Radikal bebas adalah substansi reaktif yang dibentuk dalam sel-sel tubuh sebagai hasil proses metabolisme. Pada tahun 1954 Gerschman dan timnya pertama mengemukakan teori pembentukan radikal bebas. Radikal bebas adalah molekul dengan satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbitalnya. Banyak dari molekul ini adalah spesies oksigen. Radikal bebas oksigen dan produk non radikalnya dikelompokkan dalam spesies oksigen reaktif (reactive oxygen species (ROS)). Radikal bebas sangat reaktif, merupakan molekul yang tidak stabil dan bereaksi dengan cepat pada biomolekul melalui banyak jenis reaksi antara lain penangkapan hidrogen, donasi elektron dan penggunaan elektron bersama. Radikal bebas akan melepaskan elektron pada molekul sekitarnya untuk menghasilkan pasangan elektron agar menjadi molekul yang stabil (Hosseinian, 2006 ; Maxwell & Lip, 1997). ROS dihasilkan baik melalui faktor eksogen maupun endogen yang secara langsung mempengaruhi kehidupan sel. Sumber penting radikal bebas dalam tubuh dihasilkan oleh sistem enzim prooksidatif seperti lipooksigenase, metabolisme obat, polutan, dan senyawa kimia asing bagi tubuh (xenobitotik). Di dalam sel manusia, mitokondria menggunakan oksigen lebih dari 90%, mitokondria menjadi sumber utama ROS dan radikal bebas. Sekitar 1 5% oksigen yang digunakan oleh mitokondria direduksi dan dikonversi menjadi ROS. Reduksi tetravalen oksigen dalam transpor elektron mitokondria sangat penting untuk menghasilkan energi seluler, akan tetapi reduksi ini tidak seratus persen efesien, sebagian membentuk radikal superoksida (O2 *- ). Radikal superoksida didismutasi oleh superoksida dismutase membentuk H 2 O 2. Substansi ini sangat oksidan, interaksi dengan ion logam seperti Fe 2+ dan Cu + menghasilkan radikal hidroksil yang sangat reaktif (OH*), akhirnya dapat menyebabkan banyak kerusakan jaringan biologis (Young et al. 2002; Hosseinian, 2006; Maxwell & Lip, 1997). Radikal bebas juga dapat menginisiasi reaksi berantai pembentukan ROS pada asam lemak tak jenuh rantai panjang yang dikenal dengan reaksi peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid adalah reaksi propagasi yang menghasilkan radikal lipid dan radikal peroksida. Asam lemak tak jenuh rantai panjang konstituen lipid kompleks membran sel seperti fosfolipid dan lipoprotein menjadi target utama

22 8 inisiasi oleh radikal bebas pada reaksi peroksidasi lipid. Selama oksidasi lipid akan terbentuk malondialdehid (MDA) yang dapat bereaksi dengan gugus amino bebas pada protein, fosfolipid dan asam nukleat sehingga merusak struktur dan fungsinya (Young et al. 2002; Maxwell & Lip, 1997). ROS dapat dikelompokkan menjadi radikal oksigen dan kelompok derivat non radikal oksigen. Kelompok radikal oksigen terdiri dari O 2 -(superoksid), HO 2 - (hidroperoksil), OH-(hidroksil), L(R)OO-(peroksil) serta NO-(nitrit oksid) sedangkan yang derivat non radikal oksigen antara lain ONOO- (peroksi nitrit), -OCl (hipoklorit), 1 -O 2 -(oksigen singlet), L(R)OOH (hidroperoksida) dan H 2 O 2 (hidrogen peroksida) (Abuja & Albertini, 2001; Hosseinian, 2006). Sasaran utama reaksi radikal bebas di dalam sel adalah ikatan-ikatan rangkap dari lipida yang terdapat di dalam membran sel. Akibatnya fluiditas membran akan berkurang dan sederetan reseptor selular akan berkurang. Serangan radikal bebas juga dapat menimbulkan penumpukan kalsium dan lipofusin. Radikal bebas dapat pula menjadikan enzim dan protein thiol (-SH) tidak aktif dengan cara pembentukan ikatan silang maupun denaturasi. Akibatnya sintesis dan degradasi protein terganggu. Jika radikal bebas menyerang asam-asam nukleat akan menimbulkan gangguan terhadap molekul DNA yang berakibat terbentuknya mutasi basa-basa nitrogen serta berakhir dengan pembentukan karsinogenesis. ROS juga dapat menginduksi apoptosis, menggangu jalur signal seluler, menggangu reaksi oksidasi reduksi sel dan meningkatkan kecepatan mutasi DNA (Harliansyah, 2001; Valko et al. 2006). Beberapa pembahasan mutahir tentang mekanisme terjadinya penyakit degeneratif, mensinyalir bahwa stres oksidatif dan radikal bebas sangat berpengaruh terhadap penyakit degeneratif dan kanker (Mc Cord, 2000). Interaksi ROS dengan biomolekul dalam sel dijelaskan oleh Mates & Gomez (gambar 2).

23 9 Regulasi * pertumbuhan sel * diferensiasi sel * kematian sel oleh apoptosis dan nekrosis Aktifasi dari : * transduksi sinyal * proliferasi sel Penurunan efesiensi dari : * DNA polimerase * Repair DNA Kerusakan oksidatif pada protein Menginduksi peroksidasi lipid Stres oskidatif menginduksi protein dan gen ROS Perubahan kimia pada basa nitrogen materi genetik Perubahan konformasi DNA Perluasan/peningkatan hot spot mutagenitas Perubahan ikatan -H Penghambatan dalam replikasi Replikasi tidak akurat MUTASI Gambar 2 Interaksi spesies oksigen reaktif (ROS) terhadap biomolekul di dalam sel (Mates & Gomez 1999). Antioksidan Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat dan mencegah proses oksidasi lipid walaupun dalam konsenterasi yang sedikit (Sampels, 2005). Antioksidan adalah substansi yang diperlukan tubuh untuk menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal, protein dan lemak. Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stres oksidatif. Antioksidan dapat berperan sebagai peredam radikal bebas (free radical scavenger), dekomposer peroksida, mereduksi singlet oksigen dan menghambat enzim (Dean, 2003; Simpson, 2006).

24 10 Tubuh manusia memiliki aktivitas antioksidan endogenus. Enzim-enzim antioksidan seperti superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT) dan glutation peroksidase (GPX) berperan dalam meredam oksidan dan mencegah sel dari kerusakan. Disamping enzim-enzim tersebut molekul non enzim dalam sel seperti thioredoksin, thiol dan ikatan disulfida berperan dalam sistem pertahanan antioksidan tubuh. Hasil studi epidemilogi mekanisme antioksidan endogenus ini tidak mampu mengimbangi jumlah radikal bebas yang dihasilkan tubuh dan pada kondisi tertentu aktivitasnya menjadi tidak efisien sehingga radikal bebas tersebut menyebabkan kerusakan oksidatif pada biomolekul (Yang et al. 2007; Aqil et al. 2006; Mosquiera et al. 2007). Ketidakseimbangan jumlah radikal bebas dan sistem antioksidan endogenus menyebabkan terjadinya stres oksidatif. Untuk mencegah stres oksidatif maka dibutuhkan antioksidan non enzimatis dari luar tubuh. Substansi yang terkandung dari sayuran dan buah seperti α-tokoferol, β-karoten asam askorbat, flavonoid dan senyawa fenolik, zink dan selenium termasuk dalam kelompok antioksidan eksogenus (Simpson, 2006). Sistem perlindungan dari dalam maupun dari luar tubuh sering tidak memadai karena terlalu banyaknya radikal bebas yang terbentuk sebagai akibat dari polusi udara, asap rokok, sinar ultra violet yang diproduksi sinar matahari, pestisida dan senyawa xenobiotik di dalam makanan, bahkan olah raga yang berlebihan. Zat pemicu yang diperlukan oleh tubuh untuk menghasilkan antioksidan tidak cukup dikonsumsi. Kombinasi antara antioksidan dari luar tubuh dan antioksidan dalam tubuh dapat menekan radikal bebas. Sebagai contoh, tubuh manusia dapat menghasilkan glutation, salah satu antioksidan yang sangat kuat, hanya saja tubuh memerlukan asupan vitamin C sebesar 1000 mg untuk memicu tubuh menghasilkan glutation ini. Keseimbangan antara antioksidan dan radikal bebas menjadi kunci utama pencegahan stres oksidatif dan penyakitpenyakit kronis yang dihasilkannya. Keseimbangan antara antioksidan dan radikal bebas diilustrasikan pada gambar 3.

25 11 Gambar 3 Keseimbangan radikal bebas-antioksidan mencegah stres oksidatif. Aktivitas antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal lipida. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Simpson, 2006; Harliansjah, 2007). Penambahan antioksidan primer (AH) dengan konsentrasi rendah pada lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak. Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi maupun propagasi. Radikal-radikal antioksidan (A*) yang terbentuk pada reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru (Harliansjah, 2007). Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipid adalah : Inisiasi : R* + AH > RH + A* radikal lipida antioksidan Propagasi : ROO* + AH > ROOH + A* Besarnya konsenterasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan golongan fenolik sering lenyap bahkan antioksidan tersebut menjadi prooksidan. Pengaruh jumlah konsentrasi pada laju oksidasi tergantung pada struktur antioksidan, kondisi dan sampel yang akan diuji. Reaksi berikut menunjukkan antioksidan yang bertindak

26 12 sebagai prooksidan pada konsenterasi yang tinggi (Sampels, 2005; Harliansjah, 2007). AH + O > A* + HOO* AH + ROOH > RO* + H 2 O + A* Telah diketahui mutasi gen dapat terjadi melalui mekanisme kesalahan replikasi dan kesalahan genetik yang berkisar antara %, atau faktor dari luar yang merubah struktur DNA seperti virus, polusi, radiasi, dan senyawa xenobiotik dari konsumsi pangan sebesar %. Jadi jelas bahwa radikal bebas dan reaksi oksidasi berantai yang dihasilkan besar pengaruhnya pada proses mutasi. Kerusakan oksidatif DNA merupakan bagian dari karsinogenesis yang memberi pengaruh sangat besar saat ini dengan banyaknya komponen xenobiotik pada makanan yang membentuk radikal bebas dalam tubuh. Konsumsi antioksidan alami dapat berperan sebagai biopreventif kanker (Silalahi, 2006; Harliansjah, 2007). Senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami umumnya berasal dari tumbuhan. Angiospermae memiliki kira-kira sampai spesies dan dari jumlah ini kurang lebih 400 spesies yang telah dikenal dapat menjadi bahan pangan manusia. Isolasi antioksidan alami telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian yang dapat dimakan. Antioksidan alami tersebar di beberapa bagian tanaman, seperti pada kayu, kulit kayu, akar, daun, buah, bunga, biji dan serbuk sari (Mosquiera et al. 2007; Harliansjah, 2007). Senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional. Sementara turunan asam sinamat meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat, dan lainlain. Jahe (Zingiber officinale Roscoe.) biasa digunakan sebagai bumbu atau obat tradisional. Komponen-komponen pedas dari jahe seperti 6 gingerol dan 6- shogaol dikenal memiliki aktivitas antioksidan yang cukup kuat. Dari ekstrak jahe yang telah dibuang komponen volatilnya dengan destilasi uap, maka dari fraksi non volatilnya setelah pemurnian, ditemukan adanya empat senyawa turunan

27 13 gingerol dan empat macam diarilheptanoid yang memiliki aktivitas antioksidan kuat (Harliansjah, 2007). Ada beberapa senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan telah berhasil diisolasi dari kedelai (Glycine max L.), salah satunya adalah flavonoid. Flavonoid kedelai unik dimana dari semua flavonoid yang terisolasi dan teridentifikasi adalah isoflavon. Pada dosis 2,24 mg/0,2 ml isolat flavonoid dari herba benalu mangga mampu menghambat pertumbuhan kanker pada hewan uji mencit. Senyawa flavonoid dari benalu adalah senyawa kuersetin yang bersifat inhibitor terhadap enzim DNA topoisomerase I sel kanker (Sukardiman et al. 1995). Flavonoid yang terdapat pada buah-buahan dan sayuran memberi pengaruh yang menguntungkan dan sebagai antioksidan. Antioksidan dari flavonoid tergantung pada struktur molekulnya. Flavonoid adalah substansi polifenolik yang banyak terdapat pada tumbuhan; berdasarkan struktur kimia yang termasuk dalam golongan flavonoid adalah flavonol, flavon, flavanon, isoflavon, katekin, antosianidin dan kalkon. Sekitar 4000 flavonoid telah diidentifikasi banyak yang berasal dari sayuran, buah, teh, kopi, bir, wine dan minuman sari buah. Secara epidemologi konsumsi sayur dan buah segar secara rutin menekan resiko kanker dan penyakit degeneratif akibat spesies radikal bebas. Konsumsi sayuran, buah dan ramuan obat herbal yang kaya kandungan flavonoid menekan resiko terserang penyakit jantung dan kanker (Buhler & Miranda, 2000; Okawa et al. 2001). Kanker Kanker dianggap suatu kelompok penyakit seluler dan genetik karena dimulai dari satu sel yang telah mengalami mutasi DNA sebagai komponen dasar gen. Sel-sel yang mengalami kerusakan genetik tidak peka lagi terhadap mekanisme regulasi siklus sel normal sehingga akan terus melakukan proliferasi tanpa kontrol (Silalahi, 2006). Kerusakan dalam struktur DNA dapat berakibat pertumbuhan sel yang tidak terkendali yang dikenal dengan penyakit kanker. Banyak faktor penyebab terjadinya kanker, faktor internal terutama keberadaan gen-gen yang berperan pada siklus sel telah menjadi pusat perhatian

28 14 dalam hubungan dengan proses terjadinya tumor. Mutasi yang terjadi pada DNA di dalam gen yang meregulasi siklus sel (pertumbuhan, kematian dan pemeliharaan sel) akan menyebabkan penyimpangan siklus sel, dan salah satu akibatnya adalah pembentukan kanker atau karsinogenesis. Ada tiga cara atau faktor penting dalam proses terjadinya mutasi gen yaitu: (1) faktor lingkungan yang meliputi nutrisi, agen infektor, gaya hidup; (2) faktor kebetulan, dan (3) faktor keturunan atau bawaan (Silalahi, 2006). Liver sehat Sel sehat Kerusakan pada sel Akumulasi kesalahan genetik Kanker Hati Sel yang tidak sehat mengalami pembelahan dengan cepat dan menjadi sel kan ker Gambar 4 Mutasi dan proses perkembangan kanker hati (Ren et al. 2003) Karsinogenesis atau proses perkembangan pembentukan kanker terdiri atas tiga tahapan yaitu inisiasi, promosi dan progresi. Tahap inisiasi ditandai dengan perubahan permanen pada sel. Inisiasi ini disebabkan oleh agen karsinogen baik endogen maupun eksogen yang menyebabkan perubahan sel-sel di jaringan, penghambatan metabolisme DNA yang menyebabkan terjadinya perubahan susunan DNA sel awal atau disebut mutasi (Pitot & Dragan, 1991). Agen-agen karsinogen ditunjukan pada tabel 1.

29 15 Tabel 1 Klasifikasi umum agen Karsinogenik (Pitot & Dragan, 1991). Kelas Contoh Massa relatif molekuler (dalton) I. Kimia Hidrokarbon polisiklik, amina dan halida 5 x 10 5 x 10 4 aromatik, hormon, logam dan polimer permukaan II. Radiasi Ionisasi ( sinar x, gama, partikel radiasi) <<< 1-1 dan radiasi ultraviolet III. Biologis Virus (papova, herpes, retrovirus dan 3 x x10 6 (genom viral) hepadna virus) IV. Genetik Transgenik melalui (enhancer promotoroncogene constructs; selective breeding) ~ Tahap promosi, ditandai dengan karakter tahap inisasi yang bersifat reversibel. Pada tahap ini sel-sel yang telah termutasi dipapar lagi oleh agen-agen lain dari lingkungan. Frekuensi agen-agen mutagenik mempengaruhi sel-sel inisiasi, perubahan susunan genetik sel melalui mekanisme reseptor. Pada tahap ini agen-agen promosi (agen karsinogenik) meningkatkan resiko perkembangan kanker dengan kecepatan proliferasi sel-sel yang terinisiasi. Pada tahap ini sel-sel akan bertumbuh menjadi tumor (Pitot & Dragan, 1991). Tumor dapat mengalami perubahan genetik multipel (Yokota & Sugimura, 1991). Kanker akan terjadi dengan cepat apabila agen promosi meningkat dan pada konsenterasi yang tinggi dalam sel. Agen-agen karsinogenik yang menginduksi langsung perubahan struktur DNA antara lain polipeptida dan hormon steroid, minuman beralkohol, defisiensi metil dan galaktosamin. Tahap progresi, tahap ini dicirikan dengan perubahan kariotipe, perkembangan sel yang telah bersifat irreversibel, aneuploid malignan neoplasma, perubahan mekanisme biokimia sel yang disebabkan oleh perubahan kariotipe. Pada tahap ini radikal bebas memacu progresi kanker (Pitot & Dragan, 1991). Analisis molekuler dari tahap-tahap perkembangan kanker pada manusia mulai dari lesi prakanker sampai tumor metastatik lanjut menunjukkan bahwa akumulasi dari perubahan genetik berkorelasi dengan fenotip malignan dari sel-sel tumor. Inaktivasi dari multiple tumor supressor gen memegang peranan utama dalam kejadian dan progresi kanker pada manusia. Dua gen tumor supresor inaktif pada pembentukan kanker. Lesi premalignan termasuk deplesia, hiperplasia, leukoplokia, adenoma (Yakota & Sugimura, 1993). Untuk jelasnya model progresi tumor disajikan pada gambar 3.

30 16 A Sel normal Lesi prakanker Karsinoma Metastasis B Sel normal Fenotipe normal Karsinoma Metastasis Gambar 5 Tipe progresi tumor (Pitot & Dragan, 1991) Gambar A, model genetik dari progresi kanker manusia. Tumor dapat dibagi menjadi 3 kelompok yaitu lesi prakanker, karsinoma dam metastasis. Lesi prakanker tidak dapat dideteksi secara klinis. Pada gambar A progresi tumor dengan lesi prakanker. Pada gambar B progresi tumor tanpa lesi prakanker. Kejadian genetik ditunjukkan dengan nomor 1-3. Walaupun jumlah kejadian genetik minimum terjadi pada konversi sel normal menjadi karsinoma belum banyak diketahui, beberapa bukti menyatakan bahwa dua gen yaitu RB dan p53 berperan dalam represi sel kanker (Yakota & Sugimura, 1993). Ada tiga kelompok utama gen yang terlibat dalam regulasi pertumbuhan sel yaitu proto-onkogen, gen penekan tumor (tumor suppresor gene (TSG)) dan gen penjaga (gatekeeper gene). Proto-onkogen menstimulasi dan meregulasi pertumbuhan dan pembelahan sel. Gen penekan tumor biasanya menghambat pertumbuhan sel atau menginduksi apoptosis. Kelompok gen ini dikenal sebagai anti-onkogen, karena berfungsi melakukan kontrol negatif (penekanan) pada pertumbuhan sel. Gen p53 merupakan salah satu dari TSG yang menyandi protein penekan tumor dengan berat molekul 53 kda. Gen p53 juga berfungsi mendeteksi kerusakan DNA, menginduksi reparasi DNA. Gen penjaga berfungsi mempertahankan integritas genomik dengan mendeteksi kesalahan pada genom dan memperbaikinya. Mutasi pada gen-gen ini karena berbagai faktor membuka peluang terbentuknya kanker (Mc Kelvery, et al. 2003; Gondhowiarjo, 2004). Pada keadaan normal, pertumbuhan sel akan terjadi sesuai dengan kebutuhan melalui siklus sel normal yang dikendalikan secara terpadu oleh fungsi ketiga gen yaitu proto-onkogen, gen penekan tumor dan gen penjaga secara seimbang. Jika terjadi ketidakseimbangan fungsi ketiga gen ini, atau salah satu tidak berfungsi dengan baik karena mutasi, maka keadaan ini akan menyebabkan

31 17 penyimpangan siklus sel. Pertumbuhan sel tidak normal pada proses terbentuknya kanker dapat terjadi melalui tiga mekanisme yaitu perpendekan waktu siklus sel, sehingga akan menghasilkan lebih banyak sel dalam satuan waktu tertentu, penurunan jumlah kematian sel akibat gangguan proses apoptosis, dan masuknya kembali populasi sel yang tidak aktif berproliferasi ke dalam siklus proliferasi. Sebagai contoh pada kondisi TSG kurang aktif atau proto-onkogen terlalu aktif. Gabungan mutasi dari ketiga kelompok gen ini akan menyebabkan kelainan siklus sel, yang sering terjadi adalah mutasi gen yang berperan dalam mekanisme kontrol sehingga tidak berfungsi baik, akibatnya sel akan berkembang tanpa kontrol (yang sering terjadi pada manusia adalah mutasi gen p53). Akhirnya akan terjadi pertumbuhan sel yang tidak diperlukan, tanpa kendali dan karsinogenesis dimulai (McKelvery, et al. 2003; Gondhowiarjo, 2004, Walker & Blackburn, 2004). RB dan dan gen p53 adalah dua dari banyak target perubahan genetik pada kanker manusia. Hasil kajian beberapa tahun terakhir ini menunjukkan bahwa mekanisme biokimia dari gen-gen ini berperan sebagai tumor supressor. Gen p53 adalah monitor signal biokimia dalam sel yang dapat mengindikasikan kerusakan DNA atau mutasi. Produk gen p53 adalah hasil dari transkripsi multifaktor yang meregulasi induksi apoptosis dalam sel dalam perusakan DNA, dengan demikian mencegah propagasi kerusakan DNA sel lain. Lebih dari 50% tumor pada manusia, termasuk jenis-jenis sarkoma mengalami mutasi pada gen p53 (Nambiar, et al. 2001). Pada deteksi perkembangan kanker, protein p53 membangun diri dalam nukleus sel, mengarahkan sel pada penghentian pertumbuhan atau penghancuran diri. Tetapi pada kondisi normal, sel tidak membutuhkan ekspresi gen p53. Kenyataannya adanya protein p53 dalam nukleus akan menghambat pertumbuhan sel normal. Gen p53 akan dikirim dari nukleus ke sitoplasma untuk degradasi. Pada saat kerusakan DNA terjadi, fosfat melekat pada protein p53, mencegah p53 meninggalkan nukleus sehingga terakumulasi di nukleus. Setengah dari sel-sel tumor tidak ditemukan aktivitas p53, hal ini dapat disebabkan oleh gen kinase yang bertanggung jawab untuk fosforilasi termutasi. Ketika gen ini rusak, kerusakan DNA tidak dapat diperbaiki karena p53 terus dikirim ke sitoplasma dan didegradasi di sana (Franzen, 2001).

32 18 Gen p53 dapat mengalami modifikasi jika diserang oleh gugus kimia tertentu. Pada kondisi tertentu, protein p53 sangat tidak stabil dan ditemukan dalam jumlah sangat sedikit dalam sel. Tetapi pada saat sel mengarah pada kerusakan DNA, dengan perlahan di degradasi p53, sehingga protein p53 akan meningkat dan berperan melindungi. Pada saat kandungan p53 lebih tinggi dari normal berperan sebagai supresor tumor, berikatan dengan banyak sisi regulasi dalam sel genom untuk mengaktifasi produksi protein lain yang dapat menghentikan pembelahan sel jika DNA yang rusak dapat diperbaiki. Apabila kerusakan terlampau besar sehingga tidak dapat direpair, protein ini akan mengarahkan pada program kematian sel (apoptosis) (SIBS, 2005). Faktor lingkungan seperti gaya hidup dan pola makan berkorelasi dengan insiden kanker misalnya paparan sinar ultraviolet dengan kanker kulit, merokok dengan kanker paru-paru. Tetapi tidak semua perokok akan mengidap kanker paru-paru atau berjemur akan selalu menderita kanker kulit; berarti ada faktor lain di luar faktor lingkungan yakni kesalahan replikasi DNA dan bawaan (McKelvery, et al. 2003; Go, et al. 2003; Milner, 2004, dan Nowell, et al. 2004). Adanya faktor kebetulan dapat diterangkan sebagai berikut. Tubuh mengadakan replikasi DNA secara akurat, tetapi masih terjadi kesalahan satu kali dari 10 juta pasangan basa. Kemudian 99,9% dari yang salah dalam replikasi, dikoreksi dan diperbaiki, berarti replikasi DNA yang salah masih ada tersisa. Di samping itu, proses metabolisme normal dalam tubuh menghasilkan radikal bebas yang reaktif dan menimbulkan kerusakan oksidatif terhadap DNA secara terusmenerus. Kanker dapat terjadi akibat akumulasi DNA termutasi dalam gen terutama yang mengatur proses siklus dan pertumbuhan sel. Mekanisme ke tiga cara terjadinya mutasi DNA adalah melalui faktor keturunan atau bawaan, yang menyebabkan 5-10% kanker. Mutasi yang terjadi pada DNA di dalam gen yang meregulasi siklus sel akan mengakibatkan penyimpangan, dan salah satu dampak negatifnya adalah pembentukan kanker atau karsinogenesis (McKelvery, et al. 2003; Silalahi, 2006). Seperti telah dijelaskan sebelumnya karsinogenesis berlangsung lama dan dibagi tiga tahap yakni inisiasi, promosi dan progresi. Pada tahap inisiasi sudah terjadi perubahan permanen di dalam genom sel akibat kerusakan DNA yang

33 19 berakhir pada mutagenesis. Sel yang telah berubah ini tumbuh lebih cepat dibandingkan dengan sel normal di sekitarnya. Pada tahap ini proses mutasi akan mengaktivasi atau menghambat proto-onkogen. Faktor yang mengubah fungsi proto-onkogen dan TSG antara lain adalah karsinogen yang mengubah struktur DNA, radiasi yang memicu pembentukan spesies kimia reaktif dan radikal bebas, dan virus. Tahap inisiasi berlangsung dalam satu sampai beberapa hari. Tahap promosi berlangsung lama bisa lebih dari sepuluh tahun. Suatu proses panjang yang disebabkan oleh kerusakan yang melekat dalam materi genetik di dalam sel. Melalui mekanisme epigenetik akan terjadi ekspansi sel-sel rusak membentuk premalignansi dari populasi multiseluler tumor yang melakukan proliferasi (Lee, et al. 2004). Senyawa-senyawa yang merangsang pembelahan sel disebut promotor atau epigenetik karsinogen. Pada tahap perkembangan (progression), terjadi instabilitas genetik yang menyebabkan perubahan-perubahan mutagenik dan epigenetik. Proses ini akan menghasilkan klon baru sel-sel tumor yang memiliki aktivitas proliferasi, bersifat invasif (menyerang) dan potensi metastatiknya meningkat. Selama tahapan ini, sel-sel malignan berkembang biak menyerbu jaringan sekitar, menyebar ke tempat lain. Jika tidak ada yang menghalangi pertumbuhannya, akan terbentuk dalam jumlah yang cukup besar untuk mempengaruhi fungsi tubuh, dan gejala-gejala kanker muncul. Tahap terakhir ini berlangsung selama lebih dari satu tahun, sehingga seluruh karsinogenesis dapat berlangsung selama dua puluh tahun (Silalahi, 2003). Insiden kanker pada orang yang lebih tua lebih tinggi daripada orang muda karena perubahan DNA akibat paparan lingkungan berisiko dan kesempatan akumulasi yang lebih besar seiring dengan bertambahnya usia, oleh karena itu jika timbul kanker pada usia muda patut diselidiki adanya faktor keturunan. Pengenalan lebih dini risiko kanker pada satu keluarga sangat penting untuk manajemen pencegahan dan terapi (McKelvery, et al. 2003; Silalahi, 2006). Kemajuan di bidang genetik tidak hanya meningkatkan pemahaman tentang keterkaitan gen dengan penyakit tetapi juga membuka kesempatan yang lebih luas untuk meneliti kerentanan genetik. Tes genetik meliputi analisis DNA, RNA, kromosom, protein, dan metabolit dapat meramalkan atau mendeteksi

34 20 penyakit. Tes ini biasanya dilakukan terhadap DNA dan kromosom yang diisolasi dari sampel darah atau sel tumor (Keku et al, 2003). Kanker dapat menyebabkan banyak gejala yang berbeda, bergantung pada lokasinya dan karakter dari keganasan dan apakah ada metastasis. Sebuah diagnosis yang menentukan biasanya membutuhkan pemeriksaan mikroskopik jaringan yang diperoleh dengan biopsi. Setelah didiagnosis, penderita kanker biasanya dirawat dengan operasi, kemoterapi dan atau radiasi. Pengobatan kanker yang umum dilakukan saat ini adalah dengan cara kemoterapi. Kemoterapi adalah terapi kimia dengan menggunakan zat-zat kemoterapi untuk menekan pertumbuhan kanker. Zat-zat kimia yang digunakan dapat dari hasil sintesis kimia, semisintetik, fitokimia, bioaktif hewan dan dari mikroorganisme. Metode kemoterapi dilakukan dengan cara memberikan obat dalam bentuk senyawa kimia untuk membunuh sel-sel kanker dalam tubuh pasien. Kemoterapi dapat diberikan melalui mulut atau injeksi, kadang-kadang dapat juga langsung pada bagian tubuh yang terkena kanker. Kebanyakan kemoterapi diberikan secara infus melalui pembuluh darah vena. Namun, teknik kemoterapi di samping membunuh sel-sel kanker juga dapat mengakibatkan rusaknya sel-sel normal yang kebetulan menyerap obat tersebut. Efek samping pengobatan ini cukup berat, misalnya mual, muntah, rambut rontok, dan lain-lain. Operasi bedah merupakan pilihan efektif untuk tipe kanker yang tidak terikat erat pada jaringan tubuh lainnya, serta sel-sel kankernya terbungkus dalam satu kesatuan. Namun, teknik pembedahan ini menjadi kurang menguntungkan pada jenis kanker terbuka, karena dapat meninggalkan sisa-sisa sel kanker yang dapat tumbuh kembali di kemudian hari. Teknik operasi bedah juga tidak dapat digunakan untuk jenis kanker yang sudah bermetastasis. Saat ini dengan mahalnya obat kemoterapi sintetik dan meningkatnya kasus penyakit kanker maka pengobatan kanker difokuskan pada komponen fitokimia dan bioaktif dari mikroba dan hewan yang berpotensi menekan pertumbuhan sel normal atau reaksi metabolik. Sekitar 400 spesies tanaman dalam 315 genus dan 97 famili mempunyai aktivitas sebagai penghambat tumor (Farnsworth, 1996). Berbagai zat fitokimia

35 yang berkhasiat sebagai antikanker dari beberapa tanaman telah berhasil diisolasi oleh Mc Laughlin dkk, dimana pencarian senyawa bioaktif tersebut dilakukan setelah dalam praskrining aktivitas terhadap ekstrak tanaman menunjukkan hasil positif atau aktif (Mc Laughlin, 1991). Saat ini teridentifikasi ada sekitar 400 ribu tumbuhan obat, 60% diantaranya berpotensi sebagai antikanker; 75% berpotensi antiinfeksi. Sekitar 107 spesies tanaman yang diuji sebagai antitumor berasal dari famili zingiberaceae dan umbelliferae (Murakami et al. 1999). Tumbuhan memiliki komponen pencegah tumor berupa senyawa fitokimia atau dikenal dengan cancer chemoprevention. Pencegahan kanker menggunakan senyawa fitokimia adalah salah satu upaya menggunakan bahan kimia alam yang diharapkan dapat mencegah tahap awal dari suatu karsinogenesis, sebelum terjadi penyebaran lebih jauh. Senyawa kanker pada tanaman diantaranya indol isothiosianat, dithiolthion dan organo sulfur yang banyak pada crucifera (Rusmarilin, 2003). Tabel 2 Flavonoid Antikanker Jenis Kanker Sel Jenis Flavonoid Kanker mulut HSC-2, HSG, SCC-25 Flavanon, isoflavon, EGC, chalcones, EGCG, curcumin, genistein, ECG, quercetin, cisplatin. Kanker payudara MCF-7 Flavanon, daidzein, genistein, quercetin, luteolin. Kanker tiroid ARO, NPA, WRO Genistein, apigenin, kaempfrol, chrysin, luteolin, biochanin A Kanker Paru-paru SK-LU1, SW900, H441, H661, hago-k- Flavon, quercetin. Kanker Prostat Kanker Usus Leukimia 1, A549 LNCaP, PC3, DU145 Caco-2, HT-29, IEC-6, HCT-15 HL-60, K562, Melanoma Mencit B16 4A5 Chalcones Sumber: Ren et al Catechin, epicatechin, quercetin, kaempferol, luteolin, genistein, apigenin, myricetin, ilymarin. Flavon, quercetin, genistein, anthocyanin. Jurkat Apigenin, quercetin, myricetin, chalcones. 21 Indonesia adalah negara dengan biodiversitas flora dan fauna terbesar kedua setelah Brasil. Tidak heran banyak peneliti datang mengkaji flora dan fauna tumbuhan di Indonesia yang berpotensi obat: antibakteri, antidiabetes, antihiperlipidemia dll, baik secara legal maupun ilegal. Banyak prekursor obat antikanker berasal dari tumbuhan antara lain Podophyllootoxin dari Podophyllum

36 22 hexandrum sebagai prekursor obat kanker etoposide, teniposide dan etopophose (Farkya, et al. 2007). Homoharringtonine (Ceflatonin) alkaloid yang diisolasi dari Cephalotaxus harringtonia sebagai obat antikanker yang telah memiliki merek dagang. Aktivitas Ceflatonin sebagai inhibitor sintesis protein. Phenoxodiol adalah derivat dari isoflavon dan daidzein diisolasi dari kacang-kacangan berperan sebagai inhibitor NADH oksidase (Williams, 2005). Ceflatonin Phenoxodiol Gambar 6 Obat antikanker yang berasal dari tumbuhan dan telah memiliki merek dagang. Beberapa penelitian yang melaporkan potensi fitokimia tumbuhan sebagai obat antikanker adalah : 1. Kunyit dapat mencegah kanker usus dengan cara menginhibisi enzim-enzim lipid peroksidase dan siklooksigenase-2 yang merupakan implikasi perkembangan kanker dan menginduksi enzim glutation-s-transferase. Induksi siklooksigenase-2 dihubungkan dengan produksi prostaglandin (hormon pengatur gerakan otot). Kunyit juga menunjukkan aktivitas sebagai antioksidan yang dihubungkan dengan mekanisme pemadaman singlet O 2 yang dapat merusak DNA, namun sifat antioksidan ini bukan sebagai penghambatan superoksida anion atau radikal bebas hidroxil (Didinkaem, 2007). 2. Daun Eupatorium triplinerve Vahl. Ekstrak heksana daun E. triplinerve Vahl. mempunyai aktivitas hambatan pertumbuhan terhadap kultur sel mieloma dengan metode viabilitas sel dengan nilai ED50 = 5,85 μg/ml (Hidayat, 2002). 3. Kulit batang sesoot (Garcinia picrorrhiza Miq.) Ekstrak aseton dan n-heksana dari kulit batang sesoot, mempunyai efek anti-mutagenik terhadap mutagen standar sehingga sangat potensial untuk dikembangkan sebagai antikanker.

37 23 4. Katekin dan polifenol dari ekstrak teh hijau menunjukkan aktivitas antikanker yang kuat (Colic & Pavelic, 2004). 5. Eksrak lengkuas mengandung ACA= 1 asetoksi khavikol asetat. Kandungan tertinggi pada eksrak etil asetat dengan waktu maserasi 48 jam sekitar 1, ,02%. Memiliki potensi menghambat semua jenis alur sel kanker dan sel kanker primer manusia. Aktivitas antikanker ekstrak lengkuas disebabkan oleh kemampuan ekstrak ini meningkatkan INF-y oleh alir sel kanker paru-paru, leukimia, melanoma primer, melanoma matastase dan kanker serviks (Rusmarilin, 2003). Dalam pencarian bahan bioaktif yang mempunyai aktivitas antikanker digunakan beberapa metode skrining aktivitas biologis sebagai berikut: (i) Uji kematian larva udang laut (Brine shrimp lethality test (BSLT)), (ii) Uji hambatan tumor pada lempeng kentang (Potato disc crow gall tumor inhibition assay), (iii) Uji proliferasi kuncup lemna (Lemna frond proliferation assay), (iv) Uji sitotoksik in vitro dan in vivo (Hidayat, 2002). Dalam kajian penemuan obat antikanker, banyak sistem bioassay yang telah diketahui. Secara in vitro dapat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu pengujian seluler (cellular assays) dan pengujian mekanisme (molecular assays). Pengujian seluler juga dapat dibagi menjadi pengujian sitotoksisitas dan pengujian morfologi sel. Contoh dari pengujian sitotoksisitas adalah mengukur konsenterasi sampel yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan sel sebanyak 50% dalam kultur sel tunggal (single cell line). Pada tahun 1956 NCI menseleksi L1210 (leukimia tikus) sebagai screen utama dan kemudian pada tahun 1971 digantikan oleh P388 (lymphocystic leukimia) untuk pengujian in vitro antikanker. Kultur sel ini lebih sensitif dibandingkan L1210 tetapi memiliki karakteristik yang mirip. Pertama kali digunakan untuk skrining pada tahun Karena sitotoksisitas konsisten maka sitotoksisitas menjadi bioassay yang memiliki keuntungan utama yaitu semua mekanisme potensial pada proliferasi seluler dapat dimonitoring secara simultan (Suffness, 1987). Beberapa penelitian in vivo aktivitas antikanker senyawa fitokimia tumbuhan antara lain dilakukan oleh Mun im, et al. (2001) melakukan uji tumorigenesis pada sari buah merah (Pandanus conoideus Lam.) dengan

38 24 menggunakan tikus putih (Ratus novergicus) galur Sprague-Dawley yang berumur lima minggu dengan berat gram yang diinduksi dengan DMBA (7,12 dimetilbenz(a)antrasen). Tikus dibagi dalam beberapa kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok perlakuan dengan berbagai konsenterasi sari buah merah dan kontrol normal yang hanya diberi 1 ml minyak wijen. Pengamatan aktivitas dilakukan dengan melihat kerusakan histologi paru-paru. Sukardiman et al. 1995, melakukan penelitian efek antikanker isolat flavonoid dari herba benalu Mangga (Dendrophtoe petandra). Bioassay yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih betina galur BALB-C, berusia sekitar dua bulan. Kanker dibuat dengan menyuntikkan larutan benzopirena dalam oleum olivarum secara subkutan pada daerah interskapuler (tengkuk) dengan dosis 0,3 mg/0,l ml selama 10 kali dengan interval 2 hari sekali. Benjolan kanker pada mencit akan mulai tumbuh dua bulan setelah penyuntikan benzopirena. Hewan coba dibagi dalam 4 kelompok yang masing-masing terdiri dari lima ekor mencit: (1). Kelompok kontrol (tanpa pemberian isolat flavonoid) (2). Kelompok yang diberi flavonoid dengan dosis 0,56 mg/0,2 ml (3). Kelompok yang diberi flavonoid dengan dosis 1,12 mg/ 0,2 ml (4). Kelompok yang diberi flavonoid dengan dosis 2,24 mg/ 0,2 ml. Pada dosis 2,44 mg/0,2 ml, isolat flavonoid herba benalu mangga (D. petandra) mampu menghambat pertumbuhan kanker pada mencit (p < 0,05).

39 25 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2007 sampai dengan Januari Ekstraksi kulit batang langsat, analisis fitokimia, uji toksisitas metode BSLT dan uji antioksidasi dilaksanakan di Pusat Studi Biofarmaka IPB Bogor. Uji in vitro antikanker pada sel murine leukimia P388 dilaksanakan di Laboratorium Kimia Bahan Alam ITB Bandung. Bahan dan Alat Sampel kulit batang pohon langsat (Lansium domesticum L.) diperoleh dari perkebunan rakyat di Minahasa Utara dan Arboretum Jurusan Biologi FMIPA UNIMA yang telah dideterminasi. Sampel kulit batang basah adalah sampel kulit batang langsat tanpa perlakuan pengeringan sedangkan sampel kulit batang kering adalah kulit batang langsat dengan kadar air 10%. Ekstraksi. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 70%, kloroform, air bebas ion. Alat yang digunakan adalah oven, penggiling, blender, neraca analitik, labu ukur, corong pisah, labu bulat, rotavapor dan erlenmeyer. Analisis fitokimia. Bahan kimia yang digunakan pareaksi Dragendorff, pareaksi Mayer s, pareaksi Wagner, etanol 95%, HCL, logam Mg, Na 2 CO 3, FeCl 3, H 2 SO 4 dan anhidrida asetat. Alat yang digunakan adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas ukur, erlenmeyer, pengaduk, hot plate dan neraca analitik. Uji toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Bahan dan alat yang digunakan antara lain larva udang (Artemia salina Leach.), aerator, wadah penetasan, erlenmenyer, timbangan analitik, lup, lampu, perangkat vial uji dan mikropipet. Uji aktivitas antioksidasi. Bahan yang digunakan antara lain ekstrak kulit batang langsat, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), butil hidroksi toluena (BHT), NaOH 10%, asam asetat anhidrida, kertas saring, air bebas ion, etanol 75%, etanol absolut, asam linoleat (sigma aldrich), buffer fosfat 0.1 M ph 7, Fe CL 2.4H 2 O, HCL, amonium tiosianat, α-tokoferol (sigma aldrich), 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 6 M, asam tiobarbiturat (TBA), asam asetat 50% dan asam trikloroasetat

40 26 (TCA) 20%. Alat yang digunakan adalah botol gelap berulir berpenutup, tabung reaksi, gelas ukur, inkubator, ph indikator, sentrifuse model 800 dan spektrofotometer UV-Vis U-2800 Hitachi. Uji aktivitas antikanker. Bahan yang digunakan adalah sel kanker murine leukimia P388 dari Laboratorium Kimia Bahan Alam ITB, media Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, serum fetal bovine, kanamisin, reagen pewarna [3-(4,5-dimetil thiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolium bromida], larutan 10% SDS- 0,01 N HCL. Alat yang digunakan adalah microplate 550 nm, inkubator CO 2 perangkat sumur kultur, mikropipet, microplate reader dan alat-alat gelas. Diagram Alir Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dalam lima tahap yaitu pertama ekstraksi kulit batang langsat, kedua analisis fitokimia, ketiga uji toksisitas ekstrak etanol dengan metode BSLT, keempat uji aktivitas antioksidasi ekstrak kasar dengan dua metode yaitu metode DPPH dan metode TBA dan terakhir uji aktivitas antikanker in vitro metode sitotoksik pada sel murine leukimia P388 (gambar 7). Ekstraksi Kulit Batang L. domesticum L. Analisis fitokimia Uji toksisitas metode BSLT Uji aktivitas antioksidasi Uji aktivitas antikanker Gambar 7 Diagram alir penelitian Ekstraksi kulit batang L. domesticum L. (Harborne, 1996) Bahan tanaman yang digunakan yaitu kulit batang langsat [L. domesticum L.] basah (KBLB) dan kering (KBLK) yang dibersihkan. Kulit batang langsat

41 27 basah diblender sampai halus sedangkan untuk kulit batang kering dihaluskan dengan mesin penggiling dan diayak dengan saringan berukuran 100 mesh. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Dimasukkan sebanyak 40 g serbuk kulit batang kering ke dalam erlenmeyer, tuangi pelarut etanol 70% sebanyak 250 ml kemudian ditutup rapat sambil sesekali digoyang selama 24 jam. Saring dengan kertas saring Buchner. Diperoleh filtrat (F1) dan residu. Residu diekstraksi kembali dengan kloroform:air 1:1 diperoleh filtrat (F2) dan residu. Dengan cara yang sama dilakukan pada kulit batang basah sehingga hasil akhirnya diperoleh F1, F2, F3 dan F4. Masing-masing filtrat di rotapavor atau dibeku keringkan dengan alat freeze dryer sehingga diperoleh ekstrak kasar (lampiran 3). Analisis fitokimia (Harborne 1996) Uji alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 3 ml kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H 2 SO 4 2 M. Fraksi asam diambil, kemudian ditambahkan pareaksi Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih oleh pareaksi Meyer dan endapan coklat oleh pareaksi Wegner. Sebagai pembanding gunakan tapak darah. Uji Saponin dan Flavonoid. Sebanyak 1 gram ekstrak dimasukkan dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100 ml air panas dan didihkan selama 5 menit, setelah itu disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Uji saponin dilakukan dengan pengocokkan 10 ml filtrat dalam tabung reaksi tertutup selama 10 detik kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih/busa yang stabil. Sebanyak 10 ml filtrat yang lain ditambahkan 0.5 gram serbuk magnesium, 2ml alkohol karbohidrat (campuran HCL 37% dan etanol 95% dengan perbandingan 1:1) dan 20 ml amil alkohol kemudian dikocok kuat. Terbentuknya warna merah, kuning dan jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 2 ml air kemudian dididihkan selama beberapa menit. Lalu disaring dan filtratnya ditambah 1 tetes FeCl 3 1 % (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin.

42 28 Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambah 2 ml etanol 30 % lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambah eter 1:1. Lapisan eter ditambah pareaksi Lieberman Burchard ( 3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat). Warna merah dan warna hijau menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid. Uji toksisitas ekstrak terhadap A. salina Leach (Mc Laughlin et al, 1998) Penetasan kista A. salina Leach. Kista A. salina Leach ditimbang sebanyak 20 mg kemudian dimasukkan ke dalam wadah khusus yang berisi air laut yang sudah disaring, setelah diaerasi kista dibiarkan selama 48 jam dibawah pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Larva yang sudah menetas diambil untuk digunakan dalam uji toksisitas. Uji toksisitas terhadap A. salina Leach. Sebanyak 10 ekor larva A. Salina Leach yang sehat (berdasarkan motilitas dan kemampuan larva mencari cahaya) dimasukkan ke dalam vial uji yang berisi air laut. Tambahkan larutan ekstrak etanol KBLB dan KBLK pada masing-masing vial uji dengan konsenterasi larutan uji terdiri atas 10, 100, 500 dan 1000 ppm sedangkan untuk kontrol tidak ditambahkan larutan ekstrak. Masing-masing dibuat tiga ulangan. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva yang mati dari total larva yang dimasukkan dalam vial uji. Penghitungan memakai bantuan kaca pembesar. Pengolahan data persen mortalitas kumulatif digunakan analisis probit LC 50 dengan selang kepercayaan 95% pada program Minitab 14. Uji aktivitas antioksidasi Pengujian aktivitas antioksidasi dilakukan dengan 2 cara, yaitu metode DPPH dan metode asam tiobutirat (TBA). 1. Metode DPPH Ekstrak etanol sampel dibuat dalam berbagai konsentrasi ( 10, 50, 100, 200 dan 250 ppm). Masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ke dalam tiap tabung reaksi ditambahkan 500 µl larutan DPPH 1mM dalam metanol. Volume dihimpitkan sampai 5,0 ml, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit, selanjutnya serapannya diukur pada panjang gelombang 515 nm.

43 Sebagai kontrol positif digunakan BHT dengan konsenterasi disesuaikan. Nilai IC 50 dihitung masing-masing dengan menggunakan rumus persamaan regresi. 29 [ Absorbansi kontrol Absrobansi sampel ] % inhibisi = x 100 % [ Absrobansi kontrol ] 2. Metode asam tiobutirat (TBA) Ekstrak etanol sampel dibuat dalam konsenterasi 50, 100, 200 dan 500 ppm. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 ml lalu dilarutkan dalam 2 ml buffer fosfat 0,1 M ph 7,0 dan 2 ml asam linolenat 50 mm dalam etanol 98,8%. Larutan kontrol positif (kontrol antioksidan) digunakan 1 ml α-tokoferol, 2 ml buffer fosfat 0,1 M ph 7,0 dan 2 ml asam linolenat 50 mm dalam etanol 99,8%. Larutan kontrol negatif terdiri atas 1 ml air bebas ion, 2 ml buffer fosfat 0,1 M ph 7,0 dan 2 ml asam linolenat 50 mm dalam etanol 98.8%. Semua campuran diletakkan dalam botol gelap berulir berpenutup dan diinkubasi pada suhu 40 0 C. Satu hari setelah waktu inkubasi maksimum dari metode Ferric Thiocyanate (FTC) dilakukan pengukuran Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) melalui metode TBA (Kikuzaki & Nakatani, 1993) dengan mengambil sebanyak 1 ml setiap larutan uji. Kemudian ditambahkan 2 ml larutan TCA 20% dan 2 ml larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi dikocok dan diletakkan pada penanggas air C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Kemudian absorbansinya diukur pada panjang gelombang 532 nm dengan 3 kali ulangan. Pembuatan kurva standar menggunakan larutan 1,1,3,3- tetrametoksipropana (TMP) dengan konsenterasi 0.15, 0.30, 0.60, , dan 3.0 µm. Tiap larutan dari berbagai konsenterasi tersebut masing-masing dipipet 1 ml dan ditambah 2 ml larutan TCA 20% dan 2 ml larutan TBA 1% dalam pelarut asam asetat 50%. Campuran reaksi dikocok dan diletakkan pada penanggas air C selama 10 menit. Setelah dingin, larutan disentrufuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Kemudian absrobansinya diukur pada panjang gelombang 532 nm dengan dua kali ulangan.

44 30 Uji aktivitas antikanker Uji aktivitas antikanker in vitro pada sel murine leukimia P388 menggunakan metode yang dikembangkan oleh Tokyo University of Pharmacy & Life Science Hachioji Japan dan ITB. Sel P388 dibiakkan dalam media RPMI 1640 (lampiran 10) dilengkapi dengan 5% FBS (Fetal Bovin Serum) dan kanamisin (100 µg/ml). Sel (3 x 10 3 sel per sumur) di kultur dalam mikroplate berisi 100 µl media pertumbuhan per sumur dan diinkubasikan pada suhu 37 0 C selama 24 jam dalam kelembaban air 95% dan atmosfir 5% CO 2. Kultur sel yang digunakan untuk uji aktivitas antikanker memiliki viabilitas ± 95%. Ekstrak uji sebanyak 10µL dengan berbagai konsenterasi ditambahkan ke dalam kultur sel sehari setelah transplantasi. Pada hari ketiga ditambahkan 20 µl larutan pewarna 3-(4,5-dimetil thiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida) sebanyak 5 mg/ml per sumur. Setelah 4 jam inkubasi ditambahkan 100 µl larutan 10% SDS-0,01N HCl ke dalam tiap sumur. Selanjutnya ditambahkan kristal formazan dalam tiap sumur, larutkan dengan pengadukan menggunakan mikropipet. Pengukuran optikal densiti dilakukan menggunakan microplate reader pada dua daerah panjang gelombang (550 dan 700 nm). Semua tahapan dilakukan triplo. Analisis Data Data hasil penelitian dianalisis : 1. Toksisitas ekstrak metode BSLT. Nilai LC 50 adalah konsenterasi (ppm) yang diperlukan untuk membunuh 50% larva udang Artemia salina Leach. Nilai LC 50 ditentukan dengan Analisis Probit menggunakan Minitib Aktivitas antioksidan. Nilai IC 50 adalah konsenterasi ekstrak yang diperlukan melakukan peredaman (scavenging) radikal bebas terhadap radikal DPPH sebesar 50%. Data dianalisis dengan persamaan regresi linear. Persen daya hambat oksidasi asam linoleat didapat dari rata-rata MDA linoleat yang terbentuk dibagi dengan rata-rata MDA tiap perlakuan yang terbentuk dikalikan 100%.

45 31 3. Aktivitas antikanker. Nilai IC 50 adalah konsenterasi ekstrak yang diperlukan untuk penghambatan pertumbuhan sel kanker murine leukimia P388 sebesar 50 %. Data dianalisis dengan persamaan regresi linear.

46 32 HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Ekstraksi bahan tumbuhan adalah tahap yang sangat penting dalam memperoleh metabolit sekunder tumbuhan untuk dimanfaatkan sebagai obat. Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi yaitu merendam simplisia tumbuhan pada suhu kamar selama 24 jam. Faktor yang paling penting mempengaruhi hasil ekstraksi yaitu pelarut, waktu dan suhu dalam melakukan ekstraksi (Yang et al. 2007). Terdapat banyak metode dalam mengeksrak bahan tumbuhan diantaranya adalah metode perkolasi, sokletasi dan destilasi uap. Metode perkolasi hanya baik digunakan pada senyawa organik yang mudah larut sedangkan sokletasi dan destilasi uap hanya baik pada senyawa yang tahan panas (Faraouq, 2003; Lenny, 2006). Oleh karena itu metode maserasi dipilih agar isolasi senyawa metabolit sekunder dari ekstrak kulit batang langsat maksimal. Tabel 3 Rendemen ekstrak Kulit Batang Langsat Basah (KBLB) dan Kulit Batang Langat Kering (KBLK) Simplisia Pelarut % Rendemen KBLK Etanol 70% 5,92 Kloroform:Air 4,36 KBLB Etanol 70% 3,67 Kloroform:Air 2,16 Dari hasil ekstraksi diperoleh ekstrak etanol berwarna cokelat kehitaman dan ekstrak kloform:air (1:1) bewarna hijau muda. Semua ekstrak beraroma khas kulit langsat. Rendemen adalah persentasi antara ekstrak yang diperoleh terhadap jumlah simplisia yang diekstraksi (Depkes, 1987). KBLK dimaserasi dengan etanol 70% (1:5) selama 24 jam menghasilkan rendemen 5,92%. Residu KBLK EtOH dimaserasi lagi dengan pelarut kloroform:air menghasilkan rendemen 4,36%. Dengan cara yang sama dilakukan pada KBLB EtOH. KBLB EtOH menghasilkan rendemen sebesar 3,67%. Residu KBLB dimaserasi dengan kloroform:air menghasilkan rendemen sebesar 2,16 % (tabel 3). Trusheva et al. (2007) melakukan ekstraksi pada propolis menggunakan pelarut etanol dengan membandingkan beberapa metode ekstraksi yaitu maserasi, UE (Ultrasound

47 33 Extraction) dan MAE (Microwave Assisted Extraction) ternyata metode maserasi menghasilkan persen rendemen total 55,58% lebih besar dibandingkan metode UE dan MAE dengan masing-masing rendemen yang diperoleh 41% dan 53%. Hal ini menguatkan bahwa ekstraksi dengan pelarut etanol menggunakan metode maserasi menghasilkan persen rendemen yang lebih besar dibandingkan dengan metode ekstraksi lain. Oleh karena ekstrak etanol KBLK dan KBLB yang memiliki persen rendemen tertinggi maka kedua ekstrak tersebut dilanjutkan dalam bioassay aktivitas antioksidasi dan antikanker. Menurut Faraouq (2003) ekstraksi simplisia tumbuhan untuk tujuan obat herbal terbaik digunakan pelarut etanol. Etanol dapat bercampur dengan air dalam berbagai perbandingan dan mudah dalam penguapan residu yang ada dalam ekstrak. Pelarut metanol, etilasetat atau heksana tidak diperbolehkan karena residu toksik yang dihasilkan. Selanjutnya ampas ekstrak etanol 70% dilanjutkan dengan ekstraksi dan maserasi dengan kloroform:air yang bersifat semi polar. Diharapkan metabolit sekunder yang belum tertarik oleh pelarut etanol dapat ditarik oleh pelarut ini. Secara empiris kulit batang langsat basah yang digunakan masyarakat Dimembe Kecamatan Minahasa Utara sebagai bahan obat direbus dengan air dan diambil sarinya. Analisis Fitokimia Analisis fitokimia adalah satu cara mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu sampel tumbuhan. Dalam penelitian ini analisis fitokimia menggunakan prosedur Harborne (1996). Senyawa-senyawa yang dianalisis meliputi alkaloid, saponin, flavonoid, tanin, steroid dan triterpenoid. Tabel 4 Hasil Analisis Fitokimia Kulit batang langsat basah (KBLB) dan Kulit Langat Batang Kering (KBLK) Golongan Hasil uji Senyawa KBLK EtOH KBLK ka KBLB EtOH KBLB ka Alkaloid Flavonoid Saponin Tanin Triterpenoid Steroid Keterangan : tanda ( + ) menunjukkan tingkat intensitas warna. EtOH (etanol) dan ka (kloform : air).

48 34 Ekstrak KBLK EtOH mengandung hampir seluruh golongan senyawa fitokimia yang diidentifikasi kecuali steroid. Pada KBLB tidak mengandung golongan senyawa triterpenoid dan steroid akan tetapi memiliki kandungan saponin dengan intensitas yang lebih tinggi. KBLK kloroform:air hanya teridentifikasi mengandung alkaloid berbeda dengan KBLB yang justru tidak mengandung golongan senyawa alkaloid tetapi mengandung senyawa fenolik yaitu flavonoid, saponin dan tanin dengan intensitas yang tinggi. Hal ini disebabkan KBLB ketika diekstraksi dengan etanol masih memiliki kadar air yang tinggi, pada saat ampasnya diekstraksi dengan kloform:air yang bersifat semi polar golongan senyawa yang belum tertarik pada pelarut etanol tertarik dengan baik pada pelarut kloroform:air. Triterpenoid dan steroid hanya terbentuk sedikit endapan ketika diberikan pareaksi Wagner. Triterpenoid dan steroid adalah metabolit sekunder derivat lipid yang bersifat nonpolar sehingga membutuhkan pelarut nonpolar untuk dapat mengekstraksinya dengan baik. Ekstraksi kulit batang langsat baik kering (kadar air 10%) maupun basah dengan etanol menarik hampir semua golongan metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, tanin, saponin dan triterpenoid. Hal ini dikarenakan etanol adalah pelarut yang memiliki dua gugus yang berbeda kepolarannya yaitu gugus hidroksil yang bersifat polar dan gugus alkil yang bersifat nonpolar. Adanya gugus ini sehingga senyawa-senyawa dengan tingkat kepolaran yang berbeda akan terekstrak dalam etanol. Dari hasil analisis fitokimia ini maka KBLK EtOH dan KBLB EtOH yang dilanjutkan dengan uji bioassay antikanker dan antioksidasi. Aktivitas Toksisitas Metode BSLT BSLT adalah metode skrining farmakologi awal yang relatif murah dan telah teruji hasilnya dengan tingkat kepercayaan 95%. Penggunaan larva udang (A. salina Leach.) dalam bioassay toksisitas ekstrak kasar tanaman memenuhi validitas karena individu yang digunakan memenuhi syarat untuk analisis statistik. BSLT telah digunakan sebagai bioassay pendahuluan dalam rangka menilai toksisitas ekstrak fungi, tumbuhan, logam berat, substansi toksin dari sianobakteria dan pestisida (Carballo et al. (2002). Sekitar 300 bioaktif antitumor

49 35 baru dari tumbuhan awalnya diskrining dengan metode BSLT (Mc Laughlin et al. 1998). Tabel 5 Nilai LC 50 Ekstrak Etanol KBLK dan KBLB Simplisia LC 50 (ppm) KBLK 93,48 KBLB 100,37 Larva udang memiliki kulit yang tipis dan peka terhadap lingkungannya. Zat atau senyawa asing yang ada di lingkungannya akan terserap ke dalam tubuh dengan cara difusi dan langsung mempengaruhi kehidupan larva. Larva udang yang sensitif ini akan mati apabila zat atau senyawa asing dalam larutan bersifat toksik. Gambar 8 Histogram mortalitas A. salina Leach pada berbagai konsenterasi ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH masing-masing memiliki LC ppm dan ppm (tabel 5 ). Beberapa penelitian tentang uji toksisitas awal dengan BSLT dalam rangka penemuan obat antikanker antara lain ekstrak metanol dan ekstrak eter Marchantia cf. planiloba Steph. memiliki nilai LC 50 masing-masing ppm dan 453,16 ppm (Sukardiman, 2004). Ekstrak metanol Fagonia cretica L. menunjukkan nilai LC ppm pada uji BSLT (Hussain, 2006). Mc Laughlin et al. (1998) menyatakan adanya korelasi positif antara LC 50 uji BSLT dengan uji sitotoksik 9KB (karsinoma nasofaring manusia). Harga ED 50

50 36 9KB sama dengan sepersepuluh LC 50 BSLT. Suatu ekstrak bahan alam berpotensi antikanker dengan uji BSLT apabila nilai LC 50 < 1000 ppm (Carballo et al. 2002). Dibandingkan dengan beberapa hasil penelitian tersebut ekstrak etanol kulit batang langsat (L. domesticum L.) memiliki toksisitas (LC 50 ) yang kuat terhadap A. Salina Leach. Dengan nilai LC 50 < 150 ppm menunjukkan dalam konsenterasi yang kecil telah menyebabkan toksisitas pada larva artemia sehingga berpotensi sitotoksik pada sel kanker. Senyawa alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin yang terkandung dalam ekstrak berperan dalam toksisitas pada larva A. salina Leach. Aktivitas Antioksidasi Metode DPPH Dari larutan induk ekstrak 800 ppm dibuat konsenterasi uji 10, 50, 100, 200 dan 250 ppm masing-masing 25 ml. Sebanyak g DPPH dilarutkan dalam 50 ml metanol. BHT digunakan sebagai kontrol positif dalam konsenterasi sama dengan konsenterasi larutan uji. Nilai IC 50 KBLK EtOH mencapai setengah dari nilai IC 50 BHT (tabel 6). BHT digunakan dalam industri bahan pangan sebagai antioksidan. Dengan kata lain kedua jenis ekstrak tersebut memiliki kemampuan mendekati 2 kali dari peredaman radikal DPPH dibandingkan dengan BHT. Tabel 6 Nilai IC 50 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metode DPPH dibandingkan dengan kontrol BHT Simplisia IC 50 (ppm) BHT (kontrol) 398,45 KBLK 174,19 KBLB 205,38 Dari hasil percobaan diperoleh persen inhibisi pada berbagai konsenterasi uji. KBLB EtOH dan KBLK EtOH konsenterasi 250 ppm mampu memberikan nilai inhibisi 57,72% dan 55,78%. Dibandingkan dengan persen inhibisi dari BHT sebagai kontrol pada konsenterasi yang sama sebesar 43,38%. Dengan demikian ekstrak etanol KBLK EtOH dan KBLB EtOH lebih baik dalam meredam radikal bebas DPPH.

51 37 Tabel 7 Aktivitas inhibisi ekstrak terhadap radikal DPPH Simplisia Konsenterasi (ppm) KBLK EtOH 11,29 32,47 44,68 47,55 57,72 KBLB EtOH 11,47 32,56 37,28 48,38 55,78 BHT 7,68 17,48 38,67 42,65 43,39 Untuk mengetahui aktivitas antioksidan suatu ekstrak tumbuhan, metode DPPH adalah metode yang mudah, cepat dan sensitif. Reaksi peredaman (scavenging) antara radikal DPPH* dan antioksidan (RH) dapat ditulis sebagai berikut : Gambar 9 Reaksi antara DPPH dan antioksidan Antioksidan bereaksi dengan DPPH*, yang menstabilkan radikal bebas dan mereduksi DPPH dan sebagai konsekuensinya penyerapan radikal DPPH* menurun ke bentuk DPPH-H. Derajat diskolorisasi menunjukkan potensi peredaman radikal bebas dari substansi antioksidan atau ekstrak dengan memberikan hidrogen. DPPH yang bereaksi dengan antioksidan akan mengalami perubahan warna dari jingga ke kuning, intensitas warna tergantung kemampuan dari antioksidan (Benabadji et al. 2004). Dalam penelitian ini KBLK EtOH menunjukkan aktivitas peredaman radikal DPPH terbaik dengan nilai IC 50 sebesar 174,19 µg/ml diikuti oleh KBLB EtOH IC 50 sebesar 205,38 µg/ml. Jika dibandingkan dengan BHT yang adalah antioksidan sintetik kimia dengan nilai IC 50 sebesar 398,44 µg/ml maka ekstrak etanol memiliki kemampuan scavenging radikal DPPH yang lebih kuat. Adanya kandungan metabolit sekunder kelompok polifenol yaitu flavonoid, saponin dan tanin baik pada KBLB EtOH maupun KBLK EtOH berpotensi antioksidasi. Hanani et al. (2005) melaporkan bahwa alkaloid pada ekstrak metanol dari Callyspongia sp. memiliki aktivitas peredaman radikal

52 38 DPPH (IC 50 41,21 ppm) yang berarti memiliki aktivitas antioksidan. Aqil et al. (2006) melaporkan bahwa alkaloid, flavonoid dan tanin dari beberapa tanaman obat di India menunjukkan aktivitas antioksidasi baik dengan metode DPPH maupun dengan metode TBA. Polifenol memiliki struktur kimia yang sangat baik dalam aktivitas scavenging radikal dan menunjukkan aktivitas antioksidasi yang lebih efektif secara in vitro dibandingkan dengan α-tokoferol dan asam askorbat. Aktivitas antioksidasi dari polifenol ini ditandai dengan aktivitas reaktif yang tinggi sebagai donor hidrogen atau elektron dan kemampuan dari turunan radikal polifenol untuk menstabilkan dan memindahkan elektron yang tidak berpasangan (fungsi pemutusan rantai) juga kemampuan untuk mengkhelat transisi logam. Mekanisme lain dari aktivitas antioksidasi substansi fenolik adalah kemampuan dari flavonoid untuk mencegah peroksidasi dengan memodifikasi pengemasan lipid dan penurunan fluiditas membran. Perubahan ini dapat menghambat difusi radikal bebas dan memutuskan reaksi peroksidasi. Penelitian akhir-akhir ini menunjukkan bahwa substansi fenolik terlibat dalam scavenging hidrogen peroksida di dalam sel tumbuhan (Blokhina, et al. 2003). Flavonoid telah dikenal sebagai obat antihepatotoksik, antiinflamasi, antialergi, antiosteoporosis dan antikanker. Pengaruh flavonoid ini berhubungan dengan interaksinya dengan banyak enzim dalam tubuh dan aktivitas antioksidasinya yaitu kemampuan untuk menangkap radikal bebas, mengkhelat ion logam dan pengaruh sinergisnya dengan antioksidan lain (Silva et al. 2002). Fungsi antioksidan flavonoid sebagai scavenger radikal bebas dengan memberikan atom hidrogen pada radikal. Banyak penelitian telah membuktikan aktivitas antioksidan dari flavonoid. Aktivitas antioksidan dari flavonoid berhubungan dengan struktur flavonoid. Secara umum, aktivitas scavenging radikal flavonoid tergantung pada struktur molekuler dan bentuk substitusi dari gugus hidroksil misalnya kemampuan hidrogen fenolik dan kemungkinan stabilisasi oleh radikal fenoksil melalui ikatan hidrogen atau delokalisasi elektron. Aktivitas struktur (structur-activity relationship (SAR)) dari flavonoid penting diketahui yaitu jumlah dan lokasi gugus fenolik OH yang berperan dalam menetralkan radikal bebas. Struktur yang memungkinkan aktivitas scavenging

53 39 radikal dari flavonoid adalah adanya 3,4-dihidroksil misalnya 0-dihidroksil (struktur katekhol) pada cincin B, berperan sebagai donor elektron dan menjadi target radikal. Struktur 3-OH dari cincin C juga menguntungkan untuk aktivitas antioksidan flavonoid. Konjugasi ikatan rangkap pada C2-C3 dengan gugus 4- keto, berperan untuk delokalisasi elektron dari cincin B, meningkatkan kapasitas scavenging radikal. Juga adanya gugus 3-OH dan 5-OH dalam kombinasi dengan fungsi 4-karbonil dan ikatan rangkap C2-C3 menaikkan aktivitas scavenging radikal. Dengan tidak adanya struktur o-dihidroksi pada cincin B, subtituen hidroksil pada katekol pada cincin A dapat dikompensasi dan menaikkan kemampuan aktivitas antiradikal dari flavonoid (gambar 10) (Amic et al. 2002). Gambar 10 Struktur Flavonoid dengan aktivitas antiradikal yang tinggi. Gambar yang dibundari memiliki aktivitas antiradikal bebas Gambar 11 Reaksi Scavenging DPPH* (radikal bebas) oleh flavonoid. Dalam tubuh manusia, radikal bebas adalah produk reaksi biologis atau juga dapat disebabkan faktor dari luar tubuh. Radikal bebas dalam tubuh dapat menyebabkan gejala patogenitas dalam jaringan. Beberapa penyakit yang disebabkan oleh banyaknya radikal bebas dalam tubuh adalah neurodegeneratif, kanker dan aterosklerosis. Sebenarnya manusia memiliki mekanisme peredaman radikal bebas enzimatis dalam tubuh, akan tetapi banyaknya radikal bebas yang

54 40 masuk dalam tubuh dan radikal bebas hasil autooksidasi menyebabkan mekanisme antioksidasi dalam tubuh tidak dapat mengimbangi jumlah radikal bebas. Untuk itulah dibutuhkan antioksidasi nonenzimatis yang dapat berasal dari bahan tumbuhan. Antioksidasi dari luar tubuh yang berasal dari bahan makanan atau ekstrak tumbuhan yang mengandung komponen flavonoid dan fenolik sangat berpotensi sebagai antioksidasi alami dalam menstabilkan kelebihan radikal bebas dalam tubuh (Pourmorad et al. 2006). Hasil penelitian ini memperkuat beberapa laporan penelitian aktivitas antioksidan senyawa polifenol dari ekstrak tumbuhan antara lain aktivitas peredaman radikal DPPH dari fraksi metanol batang Fagraea ceilanica (EC 50 = 48,89) lebih baik dibandingkan fraksi metanol akar dan daun (Hafid, 2003). Fenolik dari ekstrak M. crystallinum dapat menghambat radikal DPPH sebesar 98% (Bouftira et al. 2007). Tanin (katekin) yang berperan dalam aktivitas antioksidasi dari Oolong tea (Su et al. 2007). Isolat flavonol glukosida yaitu isokuartin dan hiperin dari ekstrak etanol daun Cryptocarya ashersoniana menunjukkan aktivitas scavenging radikal DPPH dengan IC µm dan 32.7 µm (Ricardo et al. 2004). Adanya senyawa golongan polifenol terutama flavonoid pada ekstrak etanol KBLK dan KBLB yang menyebabkan aktivitas antioksidasi terhadap radikal DPPH. Mekanisme antioksidasi terhadap radikal DPPH dengan memberikan elektron pada radikal DPPH sehingga menjadi molekul yang lebih stabil. Aktivitas Antioksidasi Metode TBA Oksidasi asam linoleat dengan metode FTC bertujuan untuk menentukan waktu inkubasi maksimum konsenterasi malondiadelhida (MDA). Dalam penelitian ini asam linoleat ditempatkan pada botol gelap berulir berpenutup kemudian diinkubasi selama 7 hari pada inkubator bersuhu 40 0 C; dimana analisis hidroperoksida yang terbentuk dilakukan setiap hari sampai tercapai absorbansi maksimum. Selama inkubasi asam linoleat akan dioksidasi oleh udara. Pada tahap awal oksidasi asam linoleat (fase lag) akan terbentuk hidroperoksida. Selanjutnya diikuti tahap propagasi. Pada tahap ini kadar hidroperoksida akan meningkat hingga mencapai kadar maksimum, ditunjukkan oleh puncak absorbansi

55 41 maksimum yang terjadi pada hari ke 5 setelah itu hidroperoksida akan mengalami tahap dekomposisi membentuk MDA. Pengukuran konsenterasi MDA Berdasarkan hasil analisis hidroperoksida dengan metode FTC, pengukuran konsenterasi MDA dilakukan pada hari ke-7 dengan harapan semua hidroperoksida yang terbentuk sebagai hasil oksidasi asam linoleat sudah mengalami dekomposisi menjadi MDA. Intensitas warna yang terbentuk pada sampel menunjukkan potensi antioksidasi. Semakin pudar warna merah yang terbentuk berarti semakin baik potensi antioksidasi yang dimiliki (Kikuzaki dan Nakatani, 1993). Asam linoleat tanpa penambahan ekstrak (kontrol) memiliki intensitas warna yang lebih pekat dibandingkan dengan perlakuan ekstrak pada berbagai konsenterasi (lampiran 8). Konsenterasi MDA yang tertinggi yaitu μm dihasilkan oleh asam linoleat tanpa perlakuan ekstrak KBLK dan KBLB. Konsenterasi MDA yang terbentuk pada hari ke 7 (tabel 8). Tabel 8 Konsenterasi MDA oksidasi linoleat metode TBA Perlakuan Rata-rata MDA (µm) Asam linoleat 24,60 α tokoferol 200 ppm 5,46 KBLK EtOH 50 ppm 14,84 KBLK EtOH 100 ppm 8,02 KBLK EtOH 200 ppm 4,22 KBLK EtOH 500 ppm 5,91 KBLK EtOH 1000 ppm 6,64 KBLB EtOH 50 ppm 6,51 KBLB EtOH 100 ppm 5,09 KBLB EtOH 200 ppm 3,63 KBLB EtOH 500 ppm 5.31 KBLB EtOH 1000 ppm 5,15 Daya hambat oksidasi Pada KBLK konsenterasi yang memiliki daya hambat oksidasi terbaik adalah 200 ppm sebesar 82,83 % sedangkan untuk KBLB daya hambat oksidasi terbaik juga pada konsenterasi 200 ppm yaitu 85,22 % (gambar 12). α-tokoferol atau vitamin E sebagai kontrol positif telah diketahui memiliki aktivitas

56 42 antioksidan dan digunakan secara umum. Dengan demikian dibandingkan dengan daya hambat kontrol positif α-tokoferol pada konsenterasi 200 ppm yaitu 78,8% maka ekstrak KBLK dan KBLB pada konsenterasi yang sama memiliki aktivitas daya hambat oksidasi asam linoleat yang lebih baik. (a) Gambar 12 Daya hambat oksidasi asam linoleat ekstrak. (a) KBLK EtOH (b) KBLB EtOH (b) Hasil penelitian ini membuktikan bahwa ekstrak etanol kulit batang langsat baik KBLK maupun KBLB memiliki aktivitas penghambatan pembentukan MDA pada asam linoleat. Khusus pada KBLB konsenterasi 500

57 43 ppm dan 1000 ppm juga menunjukkan aktivitas daya hambat oksidasi asam linoleat yang lebih baik dibandingkan dengan α-tokoferol. Aktivitas antioksidasi ini diakibatkan oleh kandungan komponen fenolik seperti flavonoid, saponin dan tanin yang teridentifikasi terdapat pada ekstrak KBLB EtOH dan KBLK EtOH. Salah satu produk peroksidasi lipid adalah MDA. Peroksidasi lipid mudah terjadi pada asam lemak berantai panjang dengan lebih dari satu ikatan rangkap seperti linoleat, linolenat dan arakidonat. Asam-asam lemak tersebut adalah konstituen membran sel yang terikat pada fosfolipid, glikolipid dan kolesterol (Murray et al. 2003). Pada sel hewan peroksidasi membran menyebabkan membran kehilangan permiabilitas, menjadi reaktif dan nonfungsional. Peroksidasi lipid dapat menghasilkan oksigen tunggal, hidroperoksida dan epoksida lipid. Aldaheida yang dapat terbentuk pada peroksidasi lipid adalah malondialdehida (MDA) dan 4-hidroksinonenal (4-HNE). MDA adalah metabolit utama pada asam lemak arakidonat (20:4). Uji MDA (TBARS) digunakan untuk mengukur peroksidasi yang terjadi pada membran lipid. 4-HNE dihasilkan oleh arakidonat melalui autooksidasi. 4-HNE bereaksi dengan komponen seluler lebih kuat dibandingkan dengan MDA. Oleh karena itu 4-HNE lebih toksik dibandingkan MDA akan tetapi tidak reaktif dengan TBA (Best, 2007). Gambar 13 Peroksidasi lipid pada asam lemak tak jenuh rantai panjang (Murray et al. 2003) Spesies radikal oksigen menyerang basa nitrogen pada asam nukleat, asam amino pada protein, ikatan rangkap pada asam lemak rantai panjang dimana gugus hidroksil adalah penyerang yang paling kuat. Serangan ROS ini menyebabkan stres oksidatif. Selain peroksidasi lipid, radikal bebas juga dihasilkan oleh

58 44 sejumlah reaksi seluler yang berasosiasi dengan kerja sistem enzim lipooksigenase, NADPH oksidase dan xantin oksidase. MDA TBA Produk Gambar 14 Reaksi MDA dan TBA Salah satu cara yang digunakan untuk mengetahui terjadinya peroksidasi lipid adalah dengan mengukur produk sekundernya yaitu malondialdehid. MDA adalah molekul berkarbon tiga dengan berat molekul yang rendah yang hasil aktivitas peroksidase pada asam lemak tak jenuh rantai panjang. Analisis MDA dengan metode TBA telah banyak dilakukan dalam mengetahui peroksidasi lipid pada sistem biologis. Prinsipnya adalah dengan mereaksikan MDA dan TBA dalam kondisi asam setelah dipanaskan (Tukozkan et al. 2006). MDA berikatan dengan TBA membentuk larutan berwarna merah yang dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm (Behbahani, et al. 2007). Aktivitas radikal bebas hasil peroksidasi lipid dan sistem enzim oksigenase lain apabila terus menerus menyerang asam lemak membran sel akan menyebabkan banyak kerusakan patologis. Akumulasi kerusakan akibat radikal bebas pada jaringan in vivo antara lain menyebabkan kanker, inflamasi dan aterosklerosis. Banyak penelitian melaporkan bahwa aktivitas antioksidasi enzimatis yang ada dalam tubuh tidak mencukupi untuk menetralkan radikal bebas yang ada dalam tubuh. Daya hambat oksidasi asam linoleat yang ditunjukkan oleh ekstrak etanol KBLK dan KBLB lebih baik dibandingkan dengan α-tokoferol. Kedua ekstrak tersebut mengandung senyawa golongan polifenol. Flavonoid dengan gugus o- hidroksil (visinal trihidroksil) pada konsenterasi fisiologis dapat menghambat peroksidasi lipid pada sel caco-2 usus dengan menghambat pembentukan MDA (Peng & Kuo, 2003). Flavonoid yang bersifat lebih hidrofilik berinteraksi dengan

59 45 bagian kepala yang bersifat polar dari lipid membran melalui ikatan hidrogen. Interaksi ini menyebabkan perlindungan membran bilayer dari serangan dari luar ataupun dari dalam misalnya oksidan (Oteiza et al, 2005). Hal ini menguatkan bahwa kandungan fitokimia yang ada pada ekstrak KBLK dan KBLB berpotensi sebagai antioksidasi. Aktivitas daya hambat oksidasi KBLK dan KBLB terbaik pada konsenterasi 200 ppm memperkuat kesimpulan penelitian dari Eridani (2006) yang menyatakan beberapa ekstrak tumbuhan obat yaitu mahkota dewa, daun dewa, sambung nyawa dan temu putih menunjukkan aktivitas menghambat proses oksidasi dengan menekan produksi MDA rata-rata hingga seperlima pada konsenterasi 200 ppm. Gambar 15 Perbandingan Aktivitas Antioksidan Metode DPPH dan TBA Dengan menggunakan dua metode pengujian antioksidasi diharapkan diperoleh perbandingan aktivitas antioksidasi ekstrak KBLK dan KBLB. Aktivitas antioksidasi metode DPPH ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH menunjukkan peredaman radikal yang kuat. Nilai IC 50 kedua ekstrak etanol tersebut yang lebih kecil dari kontrol BHT menunjukkan kemampuan meredam radikal bebas DPPH* oleh senyawa fitokimia yang terkandung dalam ekstrak yaitu alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin sangat kuat. Demikian pula kedua ekstrak tersebut menunjukkan aktivitas penghambatan proses oksidasi dengan menghambat pembentukan MDA (gambar 15). Flavonoid, tanin, saponin dan alkaloid dapat

60 46 menetralkan radikal bebas dengan memberikan elektronnya bagi radikal bebas penginisiasi terjadinya reaksi peroksidasi lipid. Baik dengan metode DPPH maupun metode TBA memiliki aktivitas antioksidasi yang lebih kuat dibandingkan dengan kontrol positif yaitu BHT untuk DPPH dan α-tokoferol untuk TBA. Hal ini membuktikan bahwa kedua ekstrak ini berpotensi antioksidasi dan dapat dikembangkan lebih lanjut sebagai sumber senyawa fitokimia antioksidasi. Aktivitas Antikanker Pada Sel Murine Leukimia P-388 Aktivitas sitotoksik ekstrak kulit batang langsat (L. domesticum L.) pada berbagai jenis ekstrak diketahui melalui nilai IC 50 yaitu konsenterasi dimana lima puluh persen sel murine leukimia P388 mati atau tidak viabel setelah diberikan perlakuan ekstrak. Ekstrak KBLK EtOH menunjukkan nilai IC 50 12,00 ppm sedangkan ekstrak KBLB EtOH IC ppm (gambar 16). Menurut National Cancer Institute suatu ekstrak kasar tumbuhan memiliki efektivitas sitotoksik dan berpotensi antikanker apabila memiliki nilai IC ppm. Dengan demikian kedua ekstrak tersebut memiliki aktivitas sitotoksik pada sel murine leukimia P388 yang kuat. Oleh karena itu potensial dikembangkan dalam rangka penelusuran sumber bioaktif baru antikanker dari bahan tumbuhan. Penelitian akhir-akhir ini telah banyak membuktikan bahwa substansi fitokimia dari tumbuhan berperan penting dalam melindungi membran sel melawan kondisi patologis seperti karsinogenesis, aterosklerosis dan mutagenesis. Beberapa penelitian ekstrak tumbuhan yang berpotensi antikanker antara lain dilaporkan oleh Hakim et al. (2003) bahwa Artocarpus champeden mengandung senyawa golongan flavonoid yaitu prenilflavonoid yang menunjukkan aktivitas sitotoksisitas yang kuat (IC 50 <20 ppm) terhadap sel kanker murine leukimia P388. Senyawa UK-3A yang diisolasi dari miselium Streptomyces sp memiliki aktivitas pertumbuhan sel kanker pada sel murine leukimia P388 dengan aktivitas sebesar IC ppm. Senyawa 2 4 -dihidroksi-3,5,6 -trimetoksi calkon suatu senyawa dari kulit batang Cryptocarya costata memiliki aktivitas sitotoksik yang tinggi terhadap sel murine leukemia P388 dengan IC 50 sebesar 3,65 ppm (Usman et al. 2005)

61 47 Gambar 16 Perbandingan Aktivitas toksisitas ekstrak metode BSLT dan Sitotoksik in vitro pada sel murine leukimia P388. Ekstrak akar, umbi, batang dan daun Tyohonium flagelliforme (araceae) menunjukkan aktivitas sitotoksik pada sel murine leukimia p388. Ekstrak kloform dan heksan dari akar memiliki nilai IC 50 masing-masing 6.0 ppm dan 15 ppm. Ekstrak heksan batang dan daun menunjukkan aktvitas sitotoksik yang lebih lemah (IC ppm) dibandingkan dengan ekstrak kloroform (IC ppm) (Choo et al. 2000). Tanshinone I dan Tansinone IIA (diterpen) yang diisolasi dari Salia miltiorrhiza Bunge. menunjukkan aktivitas sitotoksik pada sel murine leukimia p388 dimana menghambat pertumbuhan sel 56,05% sampai 86.76% pada konsenterasi 25 ppm (Mosaddik, 2004). Alkaloid dan lignan yang diisolasi dari Hernandia nymphaeifolia diujikan pada beberapa jenis sel kanker yaitu P388 leukimia, sel epidermoid manusia KB16, sel kanker paru A549, sel kanker usus HT-29 menunjukkan aktivitas sitotoksisitas dengan nilai IC 50 < 4 µm. Aktivitasnya dengan menghambat sintesis DNA, RNA dan protein sel kanker. Alkaloid dari Polyalthia longifolia (Annonaceae), Annona montana, dan Artabotrys uncinatus menunjukkan aktivitas sitotoksik pada sel KB dengan IC µm (Stevigny et al. 2005). Ekstrak etanol KBLK dan KBLB mengandung senyawa fitokimia golongan alkaloid, flavonoid dan saponin. Mekanisme sitotoksik yang kuat dari ekstrak etanol KBLK dan KBLB (IC 50 masing-masing 12 dan 15,48 ppm) pada sel murine leukimia P388 disebabkan oleh kandungan senyawa fitokimia tersebut.

62 48 Dari hasil penelitian ini ternyata terdapat hubungan antara aktivitas antioksidasi (metode DPPH dan TBA), toksisitas ekstrak dengan metode BSLT, sitotoksik in vitro pada sel kanker murine leukimia P388 dan kandungan fitokimia ekstrak. Ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH dengan nilai toksisitas IC 50 pada A. salina Leach terbaik, menunjukkan aktivitas antioksidasi yang kuat baik dengan metode DPPH maupun TBA. Senada dengan hal tersebut uji in vitro antikanker juga menunjukkan nilai IC 50 yang kuat (tabel 9). Dengan demikian dapat disimpulkan ekstrak etanol kulit batang langsat (L. domesticum L.) berpotensi sebagai sumber senyawa fitokimia dalam rangka pengembangan obat bahan alam antioksidasi dan antikanker. Tabel 9 Perbandingan aktivitas antioksidasi, toksisitas, antikanker dan kandungan fitokimia ekstrak etanol kulit batang Langsat. Ekstrak Metode Antioksidasi IC IC 50 BSLT 50 IC Antikanker sel (ppm) 50 DPPH TBA* (ppm) P388 (ppm) Fitokimia KBLK EtOH A, F, S, T** KBLB EtOH A, F, S, T** *) Persen daya hambat oksidasi pada konsenterasi 200 ppm (mg/l) **) A=alkaloid, F=flavonoid, S=saponin, T=tanin Mekanisme Sitotoksik pada Sel kanker dari Flavonoid, Saponin dan Alkaloid Mekanisme antikanker dari senyawa fitokimia golongan flavonoid, saponin dan alkaloid telah banyak dilaporkan. Berikut ini adalah beberapa mekanisme sitotoksik yang paling banyak diterima yang disebabkan oleh senyawa fitokimia tersebut. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) menginduksi apoptosis pada banyak jenis sel tumor melalui interaksi dengan death domain containing receptor, death receptor 5 (DR5) yang juga disebut TRAIL-R2. Studi in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa TRAIL tidak bersifat toksik pada sel normal. Oleh karena itu TRAIL merupakan subjek yang menjanjikan untuk terapi kanker. Walaupun beberapa tumor resisten dengan induksi TRAIL untuk apoptosis. DR5 diregulasi oleh gen p53 (tumor suppressor gene). Inaktivasi DR5 dengan signifikan meningkatkan pertumbuhan tumor secara in vitro dan in vivo. Ekspresi DR5 memberikan kontribusi signifikan induksi

63 49 apoptosis pada sel tumor oleh TRAIL. Oleh karena itu DR5 menjadi target terapi molekuler. Apigenin (flavonoid) meregulasi ekspresi DR5 dan secara sinergis meningkatkan induksi apoptosis oleh TRAIL pada banyak tipe sel tumor tetapi tidak pada sel normal. Apigenin mencegah degradasi protein DR5 dan secara signifikan meningkatkan protein DR5 pada fraksi membran, dimana apigenin sangat meningkatkan mrna DR5. Apigenin menghambat aktivitas proteosom yang dapat mendegradasi DR5. Secara singkat dapat dikatakan flavonoid apigenin menginduksi ekspresi DR5 melalui regulasi bebas dari p53 dan apigenin secara sinergis dengan TRAIL menginduksi apoptosis pada sel tumor (Horinaka et al. 2006). Pada penelitian yang lain Frigo et al. (2002) melaporkan bahwa flavonoid seperti apigenin, flavon dan kalkon dapat menghambat aktivasi AP-1 yaitu suatu aktivator protein pada protoonkogen. Flavonoid dan senyawa polifenol lain dapat menghambat toposiomerase IB (topo I) pada manusia. Beberapa flavonoid juga menunjukkan kemampuan menginterkalat DNA (Webb, 2004). Ekstrak etanol KBLK dan KBLB mengandung flavonoid. Kuatnya sitotoksik ekstrak pada sel murine leukimia P388 dapat disebabkan oleh flavonoid yang mencegah degradasi DR5, menginduksi ekspresi protein DR5 yang menyebabkan induksi apoptosis pada sel murine leukimia P388. Flavonoid pada ekstrak juga dapat menghambat kerja topoisomerase IB (topo I) sehingga proses replikasi DNA tidak terjadi yang berarti sel tidak membelah pada akhirnya akan mati. Permasalahan utama dalam kemoterapi kanker saat ini adalah reaksi resistensi obat kanker yang terjadi pada membran sel kanker. Mekanisme resistensi obat yang menyebabkan penurunan akumulasi obat pada sel kanker adalah overekspresi P-glycoprotein (Pgp) pada plasma membran. Pgp memompa obat keluar dari sel. Khantamat et al. (2004) melaporkan bahwa flavonoid kaempferol dapat dikombinasi dengan obat antikanker seperti vinblastine untuk mencegah ekspresi gen resisten obat pada membran sel kanker. Kaempferol berperan sebagai modulator intraseluler kandungan obat dengan menghambat Pgp pada sel KB-V1 (sel kanker serviks manusia). OSW-1 derivat cholestane termasuk pada golongan saponin yang diisolasi dari Ornithogalum saudersiae bersifat sitotoksik pada beberapa sel kanker. Pada

64 50 konsenterasi nanomolar menunjukkan aktivitas sitotoksik yang lebih kuat 10 sampai 100 kali dari obat antikanker klinis mitomycin dan doxorubicin. Mekanisme sitotoksik OSW-1 dengan menginduksi apoptosis pada mitokondria pada sel mamalia oleh karena itu dikelompokkan agen induksi apoptosis mitokondria (Kubo et al. 1992; Mimaki et al. 1997; Zhu, 2005). Ekstrak KBLK dan KBLB mengandung saponin yang juga dapat memberikan pengaruh sitotoksik melalui mekanisme induksi apoptosis pada mitokondria dari sel murine leukimia P388. Alkaloid dari daun pepaya (Carica papaya L.) dapat menghambat enzim topoisomerase II pada kultur sel kanker mieloma. Dengan dihambatnya aktivitas enzim DNA topoisomerase, maka proses terjadinya ikatan antara enzim dengan DNA sel kanker semakin lama. Akibatnya akan terbentuk Protein Linked DNA Breaks (PDLB) sehingga terjadi fragmentasi atau kerusakan DNA sel kanker dan selanjutnya berpengaruh terhadap proses replikasi sel kanker (Sukardiman et al. 2006). Alkaloid dapat menghambat proses mitosis, menyebabkan gangguan struktur dan fisiologis membran sel yang berarti terjadi gangguan signaling seluler menyebabkan sel tidak memiliki kemampuan membelah (Gill et al. 2001; Jujena et al. 2001). Kedua jenis ekstrak etanol dalam penelitian ini baik KBLK maupun KBLB memiliki kandungan metabolit sekunder golongan alkaloid. Alkaloid tersebut dapat menghambat kerja enzim topoisomerase II, menghambat mitosis, dan menyebabkan gangguan struktur dan fisiologis pada membran sel murine leukimia P388 sehingga sel tersebut tidak dapat membelah kemudian mati. Golongan senyawa fitokimia yang terdapat pada ekstrak etanol kulit batang L. domesticum L. memiliki kemungkinan berperan sitotoksik pada sel kanker, menghambat aktivasi aktivator protein protoonkogen AP-1 sehingga tidak terjadi perkembangan sel kanker juga dapat dikombinasi dengan obat antikanker untuk menekan overekspresi P-glycoprotein (Pgp) yang menyebabkan resistensi obat antikanker. Dengan demikian dapat disimpulkan aktivitas antikanker dari ekstrak etanol KBLK dan KBLB disebabkan oleh kandungan golongan senyawa alkaloid, flavonoid dan saponin yang terkandung pada kedua jenis ekstrak tersebut.

65 51 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Analisa fitokimia pada ekstrak etanol 70% dan kloroform:air menunjukkan adanya senyawa fitokimia golongan alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin. Senyawa triterpenoid dan steroid hanya dalam intensitas yang sedikit. Berdasarkan nilai LC 50 dari hasil uji BSLT ekstrak KBLK EtOH (LC 50 93,48 ppm) dan KBLB (LC ,37 ppm) menunjukkan aktivitas toksisitas yang kuat. Suatu ekstrak tumbuhan berpotensi antikanker dengan uji BSLT menurut NCI jika nilai LC 50 <1000 ppm. Hasil analisis antioksidasi dengan metode DPPH ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH (IC ,19 ppm dan 205,38 ppm) menunjukkan aktivitas peredaman radikal bebas yang kuat dibandingkan dengan kontrol BHT (IC ,45). Dengan metode TBA ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH juga menunjukkan aktivitas penghambatan oksidasi asam linoleat yang kuat pada konsenterasi 200 ppm (82,83% dan 85,22%) dibandingkan dengan kontrol α- tokoferol pada konsenterasi yang sama (77,81%). Pengujian aktivitas antikanker menunjukkan bahwa ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH memiliki aktivitas sitotoksik yang kuat pada sel murine leukimia P388 yaitu masing-masing 12 ppm dan 15,48 ppm. Menurut NCI ekstrak kasar digolongkan berpotensi antikanker apabila nilai IC 50 < 20 ppm. Terdapat hubungan aktivitas antioksidasi, toksisitas BSLT, aktivitas antikanker dan kandungan fitokimia ekstrak. Aktivitas antioksidasi dan antikanker dari ekstrak KBLK EtOH dan KBLB EtOH disebabkan oleh kandungan alkaloid, flavonoid saponin dan tanin yang terdapat pada ekstrak tersebut. Ekstrak kulit batang langsat berpotensi dikembangkan sebagai sumber senyawa fitokimia antikanker. Saran Perlu dilakukan uji in vitro pada berbagai jenis sel kanker dan uji in vivo ekstrak pada hewan uji untuk mengetahui LD 50 dalam rangka penemuan sumber senyawa fitokimia obat antikanker dan antioksidan yang baru. Perlu diisolasi senyawa fitokimia murni dan dilakukan karakterisasi dengan spektroskopi (UV, IR, NMR, HPLC) untuk menentukan struktur molekul terhadap senyawa yang

66 52 terkandung dalam ekstrak kulit batang L. domesticum L. yang menunjukkan aktivitas antioksidasi dan aktivitas antikanker. Dengan ditemukan struktur molekulnya maka senyawa tersebut dapat diketahui apakah memiliki struktur yang mirip dengan obat yang telah ditemukan dan digunakan secara klinis atau memiliki bioaktif baru sehingga dapat disintesis sebagai obat antioksidasi dan antikanker. Perlu dilakukan analisa jenis flavonoid dengan menggunakan HPLC untuk lebih mengetahui aktivitas antioksidasi berdasarkan struktur kimianya dan dilakukan uji aktivitas pada tingkat molekuler sel kanker untuk mengetahui mekanisme kerjanya. Dalam penggunaannya sebagai obat tradisional dapat dilakukan penelitian efektifitas ekstrak air terhadap aktivitas antioksidasi dan antikanker.

67 53 DAFTAR PUSTAKA Abuja PM, Albertini, R Methods for monitoring oxidative stress, lipid peroxidation and oxidation resistance of lipoproteins. Clin Chim Acta 306:1-17. Amic D, Davidovic-Amic D, Beslo D, Trinajstic N Structure-Radical Scavenging Activity Relationships of Flavonoids.Croat. Chem. Acta. 76 (1): Aqil F, Ahmad I, Mehmood Z Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medicinal Plants. Turk J Biol 30: Behbahani M, Ali AM, Muse R, Mohd NB Anti-oxidant and antiinflamatory activities of leaves of Barringtonia racemosa. J Med Plant Res Best B, Mechanisms of aging. [ 15 April 2007] Blokhina O, Virolainen E, Fagrstedt KV Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress : a review. Annals of Botany 91: Buhler DR, Miranda C Antioxidant activities of flavonoids. Department of Environmental and molecule toxicology. Oregon University. [ 15 April 2007] Carballo et al A comparison between two brine shrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnology (2): Chatterjee ML, Katiyar SK, Mohan RR, Agarwal R A flavonoid antioxidant, silymarin, affords exceptionally high protection against tumor promotion in the SENCAR mouse skin tumorigenesis model. Cancer Research 59: Choo CY, Chan KT, Takeya K, Itokawa H Cytotoxic activity of Typhonium flagelliforme (Araceae) [Abstract] Contran RS, Kumar, Robbins SL Pathologic basis of desease. WB. Sunders Company, Philadelfia USA.

68 54 Colic M, Pavelic K Molecular mechanisms of anticancer activity of natural Dietetic products.[abstract]. Cooper GM The Cancer Book. JB Publishers, Boston USA. Cragg GM, Suffness M Cancer in Human Medicinal Agents from Plants. Di dalam: Kinghorn AD, Balandrin MF, editor. ACS Symposium Series 534, pp Dean JD Flavone: The Molecular and Mechanistic Study of How a Simple Flavonoid Protects DNA from Oxidative Damage. [Thesis]. Department of Biochemistry and Molecular Biology, East Tennessee State University. [Depkes] Departemen Kesehatan Analisis Obat Tradisional. Jilid I. Jakarta Eridani SN Potensi antioksidasi beberapa ekstrak senyawa bahan alam yang berkhasiat sebagai antikanker. [Skripsi]. Institut Pertanian Bogor. Faraouq Ekstrak sebagai salah satu pengembangan bentuk obat tradisional. Prosiding Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXIII, Jakarta Farnsworth NR Biological and Phytochemical Screening of Plant. Journal of Pharmaceutical Sciences, 5: Farkya S, Bisaria V, Srivastava AK. Biotechnological aspects of the production of the anticancer drug podophyllotoxin. [Abstract] [ 12 april 2007]. Franzen H How tumor-suppressor gene p53 keeps cancer at bay. Scientifc American.com. [19 april 2007]. Frigo DE, et al Flavonoid phytochemichals regulate activator protein-1 signal transduction pathways in endemetrial and kidney stable cell lines. J. Nutr. 132: Gill SMK, Balasioner N, Parte P Intermitent Treatment With Taxmoxiven on Reproduction in Male Rat. Asian. J. Andri 3(2)-P Gondhowiarjo S Proliferasi Sel dan Keganasan. Maj Kedokt Ind 54(7): Go VW, Butrum RR, Wong DA Diet, Nutrition, and Cancer Prevention: The Postgenomic Era. J Nutr 133 (11S-I):3830S-3836S. Greenwald Chemopevention of Cancer. J Scientific American 9:96-99.

69 55 Hafid AF Aktivitas Anti-Radikal Bebas DPPH Fraksi Metanol Fagraea auriculata dan Fagraea ceilanica. Majalah Farmasi Airlangga, III (1): Hanani E, Mun im A, Sekarini R Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callyspongia sp dari kepulauan seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian II (3): Hakim EH, Rudiyansyah, Musthapa I, Takeya K Bergenin suatu Dihidroksikumarin dari kayu dan kulit batang Shorea stenopthera Burk. Proc ITB Sains and Tek 35A: Harborne JB Metode Fitokimia, penuntun dan cara modern menganalisis Tumbuhan. Penerjemah : Padmawinata K dan Soediro I. Penerbit ITB Bandung. Harliansyah Mengunyah halia menyah penyakit. Paksi Jurnal pp Hidayat MA Uji Aktivitas Antikanker Ekstrak Heksana Daun Eupatorium triplinerve Vahl. terhadap Kultur Sel Mieloma. J Ilmu Dasar 3 (2):92-97 p Horinaka M et al The dietary flavonoid apigenin sensitizes malignant tumor cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. Mol Cancer Ther 5(4): ). Hosseinian F Antioxidant properties of flaxseed lignans using in vitro model systems. [Thesis]. College of Pharmacy and Nutrition. University of Saskatchewan Saskatoon, Canada. Hussain A, Zia M, Mirza B Cytotoxic and antitumor potential of Fagonia cretica L. Turk J Biol 31: Jujena P, et al Anti Fertility Effect Estradiol in Adult Female Rat. J Endokrinol Invest 249(8): Katzung BG Basic & Clinical Pharmacology, 7th edition. Prentice Hall International, pp Keku TO, Burris TR, Millikan R Gene Testing: What the Health Professional Needs to Know. J Nutr 133 (11S-I):3754S-3757S. Khantamat O, Chaiwangyen W, Limtrakul P Screening of flavonoids for Their potential inhibitory effect on P-glycoprotein activity in human Cervical carcinoma KB-cells. Chiang Mai Med Bull 43(2):45-56 Kikuzaki H, Nakatani N Antioxidant effects of some ginger constituents. J Food Sci 58:

70 56 Kubo S, Mimaki Y, Terao M, Sashida Y, Nikaido T, Ohmoto T Acylated cholestane glycosides from the bulbs of Ornithogalum saundersiae. Phytochemistry 31: Lee KW, Lee HJ, Lee CY Vitamins, Phytochemicals, Diets and Their Implementation in Cancer Chemoprevention. Crit Rev Food Sci Nutr 44: Lenny S Isolasi dan uji bioaktifitas kandungan kimia utama puding merah dengan metoda uji brine shrimp. USU Repository Online. Mates JM, Gomez CP, De Castro IN Antioxidant enzymes and human diseases. Clin Biochem 32(8) : Maxwell SRJ, Lip GYH Free radicals and antioxidants in cardiovascular desease. Br J Clin Pharmacol 44: Mc Cord JM The evolution of free radicals and oxidative stress. The American J of Medicine 108 (8): Mc Laughlin JL Crown Gall Tumours on Potato Disc and Brine Shrimp Lethality: Two Simple Bioassay for Higher Plant Screening and Fractination, Di dalam: Hostettman K, editor, Methods in Plants Biochemistry, Academic Press, 6, p Mc Laughlin JL et al, The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug information journal, vol 32, pp McKelvery KD, Evans JP Cancer Genetics in Primary Care. J Nutr 133 (11S-I): 3767S-3772S. Milner JA Molecular Targets for Bioactive Food Components. J Nutr 134(9): 2492S-2498S. Mimaki Y et al Cholestane glycosides with potent cytostatic activities on various tumor cells from Ornithogalum saundersiae bulbs. Bioorg Med Chem Lett 7: Mosaddik MA In vitro cytotoxicity of tanshinones isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge against P388 lymphoctic leukimia cells. [abstract] Mosquera OM, Correa YM, Buitrago DC, Nino J Antioxidant activity of twenty five plants from Colombian biodiversity. Mem Inst Oswaldo Cruz 102(5):

71 57 Mun im A, Andrajati R, Susilowati H Uji hambatan tumorigenesis sari Buah merah (Pandanus conoideus Lam.) terhadap tikus putih betina yang diinduksi 7,12 Dimetilbenz(a)antrasen (DMBA). Majalah Ilmu Kefarmasian III (3): Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW Harper s illustrated Biochemistry 21 st edition. Lange Medical Books/McGraw-Hill. Nambiar Pr, Jackson JA. Chelack BJ, Kidney BA, Jaines, DM Immunohistochemical Detection of Tumor Suppressor Gene p53 Protein in Feline Injection Site-associated Sarcomas. Vet Pathol 38: Nowell SA, Ahn J, Ambrosone CB Gene-Nutrient Interaction in Cancer Etiology. Nutr Rev 62 (11): Okawa M, Kinjo J, Nohara T, Ono M DPPH (1,1-Diphenyl-2- Picrylhydrazyl) Radical Scavenging Activity of Flavonoids Obtained from Some Medicinal Plants. Biol Pharm Bull 24(10): Oteiza PI, Erlejman AG, Verstraeten SV, Keen CL, Franga CG Flavonoidmembrane interactions : a protective role of flavonoid at the membrane surface? Clinical & Development Immunology 12(1): Peng IW dan Kuo SM Flavonoid structure affects the inhibition of lipid peroxidation in Caco-2 intestinal cells at physiological concenterations. American Society for Nutrional Sciences Pitot H, Dragan Y Facts and theories concerning the mechanism of carcinogenesis. J. Faseb. 4(10): Pourmorad F, Hosseinimehr SJ, Shahabimajd N Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants. African Journal of Biotech 5(11): Puspitasari HP, Sukardiman, Widyawayuranti Uji Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Metanol Herba Ageratum conyzoides L. Pada Kultur Sel Mieloma Mencit. Majalah Farmasi Airlangga 3: Ren et al Medicinal Research. Reviews Medical. 23 (4): Ricardo MAG et al Bioactive pyrones and flavonoids from Cryptocarya ashersoniana seedlings. Issue in honor of Prof. Otto Gottlieb.ISSN Arkat USA. Rusmarilin H Aktivitas Anti-Kanker Ekstrak Rimpang Lengkuas Lokal (Alpinia galanga (L) Sw ) Pada Galur Sel Kanker Manusia Serta Mencit Yang Ditransplantasi Dengan Sel Tumor Primer. [Disertasi]. Bogor : Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

72 58 Sampels S Fatty Acids and Antioxidants in Reindeer and Red Deer. [Dissertation]. Swedish University of Agricultural Sciences. Sarjono PAR Potensi Isoflavon Asal Limbah Tahu Sebagai Antikanker Dalam Penghambatannya Terhadap Enzim Tirosin Kinase. [Tesis]. Bogor : Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Silalahi J, Tambunan ML Zat Bersifat Antikanker di Dalam Makanan. Medika; 39 (7): Silalahi J Antioksidan dalam Diet dan Karsinogenesis. Cermin Dunia Kedokteran 153: [SIBS] Salk Institute For Biological Studies Cancer related gene p53 not regulated as indicated by previous tissue culture research; results may be relevant to drug development. [ 19 April 2007]. Simbala EI. Rondonuwu SJ. Achmad AS. De Queljoe E Pemberdayaan Keragaman Hayati Tumbuhan Obat di Sulawesi Utara : Kajian Botani, Etnobotani, Fitokimia dan Konservasi. Laporan Penelitian RISTEK, Kementerian Riset dan Teknologi Simpson JA Antioxidant properties of peanut plant leaves and roots and contribution of specific phenolic compounds to antioxidant capacity. [Thesis]. Food Science. North Carolina State University. Silva et al Structure antioxidant activity relationship of flavonoid : a reexamination. Free Radical Research, 36 (11): Su X, Duan J, Jiang Y, Duan X, Chen F Polyphenolic profile and antioxidant activities of Oolong tea infusion under various steeping conditions. Int J Mol Sci 8: Suffness M Biologically Active Natural Products. Di dalam : Hostettmann K, Lea PJ, editor. Oxford University Press, Oxford, pp Sukardiman, Santa IGP, Rahmaday Efek antikanker isolat flavonoid dari herba benalu mangga (Dendeophytoe petandra). Cermin Dunia Kedokteran 122:5-8 Sukardiman, Rahman A, Pratiwi NF Uji praskrining aktivitas antikanker ekstrak eter dan ekstrak metanol Marchantia cf. planiloba Steph.Dengan Metode Uji Kematian Larva Udang dan Profil Densitometri Ekstrak Aktif. Majalah Farmasi Airlangga 4(3):

73 59 Sukardiman, Ekasari W, Hapsari PP Aktivitas antikanker dan indukasi apoptosis fraksi kloroform daun pepaya (Carica papaya L.) terhadap kultur sel kanker mieloma. Media Kedokteran Hewan 22: Trusheva B, Trunkova D, Bankova V Different extraction methods of biologically active components from propolis : a preliminary study. Chemistry Central Journal. 1 (13):1186/1752. Tukozkan N, Erdamar H, Seven I Measurement of total malondialdehyde in plasma and tissues by High-Performance Liquid Chromatography and Thiobarbituric acid assay. Fırat Tıp Dergisi. 11(2): Usman H, Hakim EH, Achmad SA, Harlim T ,4 -Dihidroksi-3,5,6 - Trimetoksi Calkon suatu Senyawa Antitumor dari Kulit Batang Tumbuhan Cryptocarya costata (Lauraceae). J Matematika dan Sains. 10(3): Valko M et al Free radical, metals and antioxidants in oxidative stressinduced cancer. Chem Biol Interact. 160(1):1-40. Yang D, Wang Q, Ke L, Jiang J, Ying T Antioxidant activities of various extracts of lotus (Nelumbo nucifera Gaertn) rhizome. Asia Pac J Clin Nutr. 16(Suppl 1): Yokota, Sugimura T Multiple steps in carcinogenesis involving alterations of multiple tumor suppressor genes. The FASEB Journal 7: Young HY, Chiang, CT, Huang, YL, Pan FP, Chen GL Analytical and stability studies of ginger preparations. J Food and Drug Anal 10(3): f. Walker WA, Blackburn G Symposium Introduction: Nutrition and Gene Regulaton. J. Nutr. 134(9): 2434S-2436S. Webb MR, Ebeler SE Comparative analysis of topoisomerase IB inhibition and DNA intercalation by flavonoids and similar compounds : structural determinates of activity. Biochem J 384: Williams RB Searching For Anticancer Natural Products From The Rainforest Plants Of Suriname And Madagascar. [Dissertation] Virginia Polytechnic Institute and State University. Zhu J, Xiong L, Yu B, Wu J Apoptosis induced by a new member of saponin family mediated through caspase-8-dependent cleavage of Bcl-2. Mol Pharmacol (68):

74 Lampiran 1 Diagram Alir Penelitian Ekstraksi Filtrat Freeze dryer Ekstrak Kasar KLBBetoh KLBBka KLBKetoh KLBBka Analisa Fitokimia (Harborne 1996) Uji antioksidan dengan Metode DPPH dan Metode TBA - Uji toksisitas Metode BSLT - Uji in vitro antikanker pada sel Murine Leukimia P-388 Keterangan : KLBBetoh (kulit batang basah ekstraksi dengan etanol 70%), KLBBka (kulit batang basah ekstraksi dengan kloroform:air), KLBKetoh (kulit batang kering ekstraksi dengan etanol 70 %), dan KLBKka (kulit batang kering ekstraksi dengan kloroform:air) 60

75 Lampiran 2 Ekstraksi Kulit Batang Lansium domesticum L. (Harborne, 1996) Kulit Batang L. domesticum L Kulit Langsat Batang Basah Kulit Langsat Batang Kering Dihaluskan Dikeringanginkan & Haluskan Di meserasi dengan etanol 70 %, selama 24 jam pada suhu 25 0 C 1:5 ( 40 gr : 200 ml etanol ) Di meserasi dengan etanol 70 %, selama 24 jam pada suhu 25 0 C Filtrat Residu Filtrat Residu Kloroform : air (1 : 1) Filtrat Filtrat Filtrat Filtrat Freeze dryer/rotapavor Freeze dryer/rotapavor Ekstrak Kasar : KLBB EtOH dan KLBB kloroform:air Ekstrak Kasar : KLBK EtOH dan KLBK kloroform:air 61

76 Lampiran 3 Analisis antioksidasi metode TBA Buffer fosfat, asam linoleat dan air bebas ion Buffer fosfat, asam linoleat dan ekstrak kasar 200 ppm terdiri : Buffer fosfat, asam linoleat dengan vit. E 200 ppm, air bebas ion KLBK etoh KLBB etoh Oksidasi dengan udara selama 6-7 hari pada suhu 40 0 C Pengukuran Kadar MDA dengan uji TBA 62

77 Analisis Konsenterasi MDA menggunakan Metode TBA Vit. E Botol gelap berulir Tiap larutan diambil 1 ml KLBKetoh Inkubasi 40 0 C selama 8 hari Tabung reaksi KLBBetoh Asam Linoleat + TCA 20 % + TBA 1 % dalam asam asetat 50 % Inkubasi pada C selama 10 menit, dinginkan Sentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit Ukur absorbansi pada λ 522 nm 63

78 64 Pembuatan Kurva Standar TMP TMP 6 M 0.15 µm 0.15 µm 0.15 µm 0.15 µm 0.15 µm Tiap larutan dipipet 0.5 ml Tabung reaksi Inkubasi C, 10 menit, dinginkan Sentrifugasi 3000 rpm 15 menit Diukur absorbansi pada λ 532 nm

79 65 Analisis hidroperoksida dari asam linoleat menggunakan metode FTC yang dimodifikasi (Aqil et. al. 2006) 2 ml buffer fosfat 0.1 M ph 7.2 asam linoleat 50 mm dalam etanol % 1 ml air bebas Botol gelap berulir Diambil 50 µl setiap hari Tabung Reaksi Diamkan 3 menit tepat + 6 ml etanol 75 % + 50 µl amonium tiosianat 30% + 50 µl FeCl 2 20 mm dalam HCL 3,5 % Diukur absorbansi pada λ 532 nm

80 66 Lampiran 4 Pengambilan sampel dan ekstraksi Pegambilan sampel kulit batang di perkebunan rakyat Kabupaten Minahasa Utara, Propinsi Sulawesi Utara Simplisia kulit batang langsat basah (KBLB) dan kulit langsat batang kering (KBLK) Penyaringan hasil maserasi dan penguapan residu pelarut dengan Rotapavor Ekstrak kasar KBLK dan KBLB

81 67 Lampiran 5 Hasil ekstraksi dan analisis fitokimia Hasil ekstraksi Simplisia Pelarut Bobot sampel (g) Bobot ekstrak (g) % Rendemen KBLK Etanol 70% 40,03 2,3722 5,9205 Kloroform:air 40,33 1,7210 4,2625 KBLB Etanol 70% 40,17 1,4665 3,6603 Kloroform:air 40,24 0,8628 2,1410 n-heksan 50,12 1,7602 3,5104 % Rendemen = Berat ekstrak / berat sampel x 100 % Foto hasil analisis fitokimia Flavonoid : KBLK EtOH (+), KBLK klor:air (-), KBLB EtOH (+),KBLB klor:air (++) (Indikasi : warna kuning, merah dan jingga pada lapisan amil alkohol) Saponin : KBLK EtOH (+),KBLK klor:air (-), KBLB EtOH (++),KBLB klor:air (+++) (Indikasi : adanya busa yang stabil selama ± 10 menit) Tanin : KBLK EtOH (-),KBLK klor:air (-), KBLB EtOH (-),KBLB klor:air (-) (Indikasi : Warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin)

82 68 Alkaloid : Dari kiri ke kanan : Pareaksi Meyer, Pareaksi Wagner dan Pareaksi Dragendorff Dari atas ke bawah KBLK EtOH (-/+), KBLK klor:air (+), KBLB EtOH (+) KBLB klor:air (-) (Indikasi : Pareaksi Meyer (enndapan putih); pareaksi Wagner (endapan cokelat); pareaksi Dragendorff (endapan merah jingga) Berturut-turut kiri atas ke kanan : Triterpenoid : KBLK EtOH (+),KBLK klor:air (-), KBLB EtOH (-),KBLB klor:air (-) (Indikasi : warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid) Berturut-turut kiri atas ke kanan : Steroid : KBLK EtOH (+),KBLK klor:air (-), KBLB EtOH (-),KBLB klor:air (-) (Indikasi : warna hijau atau biru menunjukkan adanya Steroid)

83 69 Lampiran 6 Analisis hasil uji toksisitas metode BSLT Jenis Ekstrak Konsenterasi Jumlah Larva yang mati Persen Ulangan Ulangan Ulangan mortalitas Kontrol Tween KBLK etoh KBLB etoh Penentuan Nilai IC 50 dengan Analisis Probit menggunakan Minitab 14 6/12/ :01:28 Welcome to Minitab, press F1 for help. Retrieving project from file: 'C:\Documents and Settings\MOKOSULI TUEGEH\My Documents\BSLT\BSLT_1.MPJ' Results for: Worksheet 3 Probit Analysis: MATI, LARVA versus KONSENTERASI, EKSTRAK Distribution: Weibull Response Information Variable Value Count MATI Success 361 Failure 239 LARVA Total 600 Factor Information Factor Levels Values EKSTRAK 5 KBK etoh, KBK ka, KLB etoh, KLB ka, KLB nh Estimation Method: Maximum Likelihood Regression Table Standard Variable Coef Error Z P Constant KONSENTERASI EKSTRAK KBLK ka KBLB etoh KBLB ka KBLB nh Natural Response 0 Test for equal slopes: Chi-Square = DF = 4 P-Value = 0.004

84 70 Log-Likelihood = Multiple degree of freedom test Term Chi-Square DF P EKSTRAK Goodness-of-Fit Tests Method Chi-Square DF P Pearson Deviance EKSTRAK = KBLK etoh Tolerance Distribution Parameter Estimates Standard 95.0% Normal CI Parameter Estimate Error Lower Upper Shape Scale Table of Percentiles Standard 95.0% Fiducial CI Percent Percentile Error Lower Upper Table of Survival Probabilities 95.0% Fiducial CI Stress Probability Lower Upper EKSTRAK = KBLB etoh Tolerance Distribution Parameter Estimates Standard 95.0% Normal CI Parameter Estimate Error Lower Upper Shape Scale

85 71 Table of Percentiles Standard 95.0% Fiducial CI Percent Percentile Error Lower Upper Table of Survival Probabilities 95.0% Fiducial CI Stress Probability Lower Upper Table of Relative Potency Factor: EKSTRAK Relative 95.0% Fiducial CI Comparison Potency Lower Upper KBK etoh VS KBK ka KBK etoh VS KLB etoh KBK etoh VS KLB ka KBK etoh VS KLB nh KBK ka VS KLB etoh KBK ka VS KLB ka KBK ka VS KLB nh KLB etoh VS KLB ka KLB etoh VS KLB nh KLB ka VS KLB nh Nilai IC 50 Uji Toksisitas BSLT Ekstrak LC 50 (ppm) KBK Etoh KBB EtoH

86 72 Lampiran 7 Analisis hasi uji antioksidasi metode DPPH inhibisi abs. blanko abs pada konsenterasi x % Inhibisi = x 100 % abs. blanko Misalnya : % inhibisi KBLK EtOH 10 ppm = x 100% = 11, KBLKetoh No Sampel Kons Abs % Inhibisi 1 Blanko 0 1,081 2 KBLK etoh 10 0,959 11, ,73 32, ,598 44, ,567 47, ,457 57, KBLBetoh No Sampel Kons Abs % Inhibisi 3 KLBB etoh 10 0,957 11, ,729 32, ,678 37, ,558 48, ,478 55,78168

87 73 3. Kontrol BHT No Sampel Kons Abs % Inhibisi 4 BHT Pengitungan Nilai IC 50 No Sampel y a b lnx x KBLK etoh 50 13,55 19,92 5, ,19 KLBB etoh 50 12,96 19,01 5, ,38 BHT 50 12,067 22,252 5, ,44

88 74 Nilai IC 50 diperoleh dari persamaan regresi 1. KBLK EtOH : y = 13,55ln(x) - 19,22 ; R² = 0, KBLB EtOH : y = 12,96ln(x) - 19,01 ; R² = 0, BHT : y = 12,06ln(x) - 22,25 ; R² = 0,978 Nilai x adalah nilai IC 50 apabila y=50. Misalnya : Hasil persamaan regresi KBLK y = 15,36ln(x) - 26,99. Maka nilai IC 50 KBLK adalah nilai x dari ln (x) ,22 lnx = ,55 ln x = 5,160 x = 174,19 = IC 50 KBLK Nilai IC 50 KODE SAMPEL IC50 KBLK etoh 174,19 KBLK etoh 205,38 BHT

89 75 Lampiran 8 Analisis hasil uji antioksidan metode TBA Tabel Analisis Hidroperoksida Hari ke Absorbansi Aborbansi rata-rata

90 76 Absorbansi Standar TMP Konsenterasi Absorbansi Absorbansi 1 2 rata-rata

91 Tabel Konsenterasi MDA yang terbentuk dan % daya hambat oksidasi Konsentrasi A hari ke-0 A hari ke-7 [MDA] hari ke- 0 (M) [MDA] hari ke-7 (M) [MDA] (M) Ratarata [MDA] (M) Daya hambat oksidasi (%) Asam linoleat Asam linoleat Asam linoleat Vitamin E 200 ppm Vitamin E 200 ppm Vitamin E 200 ppm KLBK etoh 50 ppm KLBK etoh 50 ppm KLBK etoh 50 ppm KLBK etoh 100 ppm KLBK etoh 100 ppm KLBK etoh 100 ppm KLBK etoh 200 ppm KLBK etoh 200 ppm KLBK etoh 200 ppm KLBK etoh 500 ppm KLBK etoh 500 ppm KLBK etoh 500 ppm KLBK etoh 1000 ppm KLBK etoh 1000 ppm KLBK etoh 1000 ppm KLBB etoh 50 ppm KLBB etoh 50 ppm KLBB etoh 50 ppm

92 KLBB etoh 100 ppm KLBB etoh 100 ppm KLBB etoh 100 ppm KLBB etoh 200 ppm KLBB etoh 200 ppm KLBB etoh 200 ppm KLBB etoh 500 ppm KLBB etoh 500 ppm KLBB etoh 500 ppm KLBB etoh 1000 ppm KLBB etoh 1000 ppm KLBB etoh 1000 ppm Rata-rata MDA linoleat yang terbentuk Daya hambat oksidasi = x 100 % Rata-rata MDA tiap perlakuan yang terbentuk 78

93 Gambar 16 Pembentukan warna pada uji TBA KLBK dari kanan ke kiri : Asam linoleat, KLBK50 ppm, KLBK 100 ppm, KLBK 200 ppm, KLBK 500 ppm, KLBK 1000 ppm dan α-tokoferol. Gambar 17 Pembentukan warna pada uji TBA KLBB dari kiri kekanan : Asam linoleat, KLBB50 ppm, KLBB 100 ppm, KLBB 200 ppm, KLBB 500 ppm, KLBB 1000 ppm dan α-tokoferol. 79