ISOLASI, PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148. Yandri*, Putri Amalia, Tati Suhartati, dan Sutopo Hadi

Transkripsi

1 ISOLASI, PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148 Yandri*, Putri Amalia, Tati Suhartati, dan Sutopo Hadi Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Lampung, Jalan Soemantri Brojonegoro No. 1, Bandar Lampung * ABSTRACT Cellulase enzyme from the bacteria Bacillus subtilis local ITBCCB148 have been isolated, and purified. Isolation of the enzyme was done using cold centrifuge to separate the enzyme from the cell mixture. The purification of enzyme was done by the use ammonium sulfate fractionation and dialysis. The purified enzyme was characterization include: the determination of the optimum temperature, optimum ph, substrate concentration and thermal stability. The cellulase enzyme activity was determined by the Mandels method and protein content was determined by Lorwy method. The results showed that the purified enzyme has specific activity of 16.2 U mg -1, this was an increase of 3.6 times than the raw enzyme extract. The temperature optimum of the purified enzyme was 55 C, the optimum ph was 6, the K M and V max values were 3.82 mg ml -1 substrate, and ml mol -1 min -1. Thermal stability of the purified enzyme for 60 minutes at 55 o C showed a half-life of 19.5 min. Keywords: cellulase, Bacillus subtilis ITBCCB148 ABSTRAK Enzim selulase dari bakteri lokal Bacillus subtilis ITBCCB148 telah berhasil diisolasi, dan dimurnikan. Isolasi enzim dilakukan menggunakan sentrifuga dingin untuk memisahkan enzim dari campuran sel. Pemurnian enzim dilakukan dengan fraksinasi menggunakan ammonium sulfat dan dialisis. Terhadap enzim selulase hasil pemurnian telah dilakukan karakterisasi meliputi: penentuan suhu optimum, ph optimum, konsentrasi substrat dan stabilitas termal. Aktivitas enzim selulase ditentukan dengan metode Mandels sedangkan penentuan kadar protein dengan metode Lorwy. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian 16,2 U/mg, meningkat 3,6 kali dibandingkan dengan ekstrak kasar enzim. Enzim hasil pemurnian memiliki suhu optimum 55 o C, ph optimum 6, harga K M = 3,82 mg ml -1 substrat, dan harga V maks = 204,08 µmol ml -1 menit -1. Uji stabilitas termal enzim hasil pemurnian selama 60 menit pada suhu 55 o C menunjukkan waktu paruh sebesar 19,5 menit. Kata kunci: Selulase, Bacillus subtilis ITBCCB

2 1. PENDAHULUAN Seiring dengan perkembangan bioteknologi enzim telah banyak digunakan dalam industri pangan dan non pangan [1]. Enzim selulase adalah salah satu enzim yang banyak dimanfaatkan untuk mengolah limbah industri berselulosa menjadi glukosa [2], dan enzim ini banyak menarik minat dunia untuk memproduksi bioetanol, jika terjadi kekurangan bahan bakar minyak bumi [3], [4], [5]. Penggunaan enzim dalam industri menuntut persyaratan tertentu antara lain enzim harus stabil pada suhu tinggi dan tahan ph ekstrim [6]. Untuk mendapatkan enzim yang mempunyai stabilitas dan aktivitas yang tinggi pada kondisi ekstrim, dapat dilakukan isolasi langsung dari organisme yang ada di alam dan hidup pada kondisi tersebut (ekstrimofilik) atau dengan modifikasi kimia terhadap enzim yang berasal dari organisme yang hidup pada kondisi tidak ekstrim (mesofilik) [7]. Menurut Mozhaev dan Martinek 1984 modifikasi kimia merupakan metode yang dapat dipilih untuk mendapatkan enzim yang stabil [8]. Pada penelitian ini telah dilakukan karakterisasi pada enzim hasil pemurnian dengan variasi suhu, ph, substrat dan stabilitas termal untuk mengetahui suhu optimum, ph optimum, data kinetika dan stabilitas termalnya. Selanjutnya untuk meningkatkan kestabilan enzim akan dilakukan modifikasi kimia terhadap enzim selulase hasil pemurnian, sehingga enzim selulase hasil pemurnian dapat memenuhi persyaratan dalam dunia industri dan dapat dimanfaatkan. 2. BAHAN DAN METODE PENELITIAN 2.1 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah yang mempunyai derajat proanalisis. Bacillus subtilis ITBCCB148 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Teknologi Bioproses Jurusan Teknik Kimia Institut Teknologi Bandung. 2.2 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, mikropipet Eppendroff, autoklaf model S-90N, laminar air flow CRUMA model 9005-FL, sentrifuga WIFUG LABOR-50M, shaker watebath incubator GFL1092, Magnetic Stirrer STUART CB 161, incubator PRECISTERM, penangas PRECISTERM, waterbath incubator HAAKE dan spektrofotometer UV-VIS Cary Win UV

3 2.3 Prosedur Penelitian Pembuatan media inokulum dan fermentasi Media inokulum dan fermentasi yang digunakan (gl -1 ) terdiri dari Urea 3; (NH 4 ) 2 SO 4 1,4; KH 2 PO 4 0,5; CaCl 2 0,1; MgSO 4 0,2; pepton 5; Yeast extract 5 dan CMC 5 dilarutkan dalam buffer fosfat ph 6, 0,1M (Yandri et al., 2010). Media ini disterilisasi pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm, selama kurang lebih 15 menit dalam autoclave Produksi enzim selulase Sebanyak 3 ose biakan Bacillus subtilis ITBCCB148 dari media agar miring diinokulasi dalam media inokulum secara aseptis, lalu dikocok dalam shaker watebath incubator dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 40 o C selama 24 jam. Selanjutnya media inokulum (5% dari volume media fermentasi) dipindahkan ke dalam media fermentasi dan dikocok dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 40 0 C selama 72 jam [9] Isolasi enzim selulase Biakan disentrifugasi pada 4500 rpm dan suhu 4 o C selama 20 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim selulase Pemurnian enzim selulase Pemurnian dilakukan dengan cara fraksinasi menggunakan garam ammonium pada derajat kejenuhan yaitu 0-90% dan didialisis selama 24 jam. sulfat Uji aktivitas dan penentuan kadar protein enzim Uji aktivitas selulase menggunakan pereaksi asam dinitrosalisilat[10]. Kadar protein enzim ditentukan dengan metode [11] Penentuan suhu optimum Penentuan suhu optimum enzim dilakukan dengan memvariasikan suhu yaitu 40, 45, 55, 60, 65, 70, 75 dan 80 o C Penentuan ph optimum Penentuan ph optimum enzim dilakukan dengan memvariasikan ph yaitu 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5;

4 2.3.8 Penentuan K M dan V maks Nilai Michaelis-Menten (K M) dan laju reaksi maksimum (V maks ) enzim dilakukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat (larutan pati) yaitu 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; dan 1,25% Uji stabilitas termal enzim Stabilitas termal enzim dilakukan dengan cara mengukur aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama 0, 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 menit Penentuan waktu paruh (t 1/2 ), konstanta laju inaktivasi (k i ), dan perubahan energi akibat denaturasi ( G i ) Penentuan nilai k i (konstanta laju inaktivasi termal) enzim menggunakan persamaan kinetika inaktivasi orde 1 [12] dengan persamaan: ln (E i /E 0 ) = - k i t Untuk perubahan energi akibat denaturasi ( G i ) enzim menggunakan persamaan: G i = - RT ln (k i h/k B T) 3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Pemurnian Enzim Selulase Skema pemurnian enzim selulase dari bakteri lokal Bacillus subtilis ITBCCB148 dapat dilihat pada Tabel 1. Tahap Tabel 1. Skema pemurnian enzim selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB148 Volume enzim (ml) Aktivitas unit (U/mL) Aktivitas Total (U) Kadar protein (mg/ml) Aktivitas spesifik (U/mg) Perolehan (%) Kemurnian (kali) Ekstrak kasar 870 0, ,09 0,2015 4, Fraksinasi ammonium sulfat hasil dialisis 103 2, ,7 0, ,2 36,33 3,6 Dari tabel diatas, dapat dilihat bahwa aktivitas unit ekstrak kasar enzim selulase sebesar 0,907 U/mL dengan kadar protein 0,2015 mg/ml. Enzim selulase fraksinasi ammonium sulfat hasil dialisis mempunyai aktivitas unit sebesar 2,7835 U/mL dengan kadar protein 0,1719 mg/ml. Enzim fraksinasi ammonium sulfat hasil dialisis mempunyai kemurnian 3,6 kali dari enzim hasil ekstrak kasar dengan perolehan 36,33%. Pemurnian enzim yang dilakukan adalah dua tahap yaitu fraksinasi dengan ammonium sulfat dan 333

5 dialisis. Pada Tabel 1 tidak ditampilkan data-data enzim hasil fraksinasi menggunakan ammonium sulfat karena ammonium sulfat menganggu pada penentuan aktivitas enzim berdasarkan terbentuknya gula pereduksi, yaitu metode Mandels yang menggunakan salah satu campuran reaksinya adalah NaOH, yang akan bereaksi dengan ammonium sulfat membentuk garam, sehingga aktivitas enzim tidak teramati. 3.2 Penentuan Suhu Optimum Pada Gambar 1 dapat dilihat bahwa suhu optimum enzim hasil pemurnian yaitu 55ºC. Terjadi penurunan aktivitas enzim hasil pemurnian yang tinggi terutama pada suhu di atas 60 0 C dan enzim ini belum memenuhi syarat untuk digunakan dalam industri yang memerlukan enzim yang dapat bekerja pada suhu antara C [13]. Perlu dilakukan peningkatan kestabilan enzim terhadap suhu. Gambar 1. Suhu optimum enzim hasil pemurnian 3.3 Penentuan ph Optimum ph optimum enzim hasil pemurnian dapat dilihat pada Gambar 2 yaitu pada ph 6. Gambar 2 menunjukkan enzim hasil pemurnian cukup stabil pada ph asam dengan aktivitas sisa di atas 90% pada ph 5,0. Sedangkan pada ph basa enzim menunjukkan penurunan aktivitas sisa yang cukup besar yaitu pada ph 8,0 enzim mempunyai aktivitas sisa di bawah 60%. Perlu peningkatan rentang ph kerja enzim agar dapat digunakan dalam industry [13]. 334

6 Gambar 2. ph optimum enzim hasil pemurnian 3.4 Penentuan K M dan V maks Dari persamaan Lineweaver-Burk dapat ditentukan nilai V maks enzim hasil pemurnian sebesar 204,08 μmol ml -1 menit -1 dan harga K M sebesar 3,82 mg/ml substrat. Gambar 3. Grafik Lineweaver-Burk enzim hasil pemurnian 3.5 Penentuan Stabilitas Termal Enzim Pada Gambar 4 dapat dilihat bahwa enzim hasil pemurnian mempunyai aktivitas sisa (%) setelah diinkubasi pada suhu 55 o C selama 60 menit yaitu 8,0707%. Gambar 4 menunjukkan terjadi penurunan aktivitas sisa enzim yang besar setelah penyimpanan selama 40 menit. Penurunan yang besar ini terjadi karena pusat aktif dan sisi aktif enzim tidak ada yang melindungi dan mudah mengalami perubahan konformasi, sehingga bentuk pusat aktif enzim tidak sesuai lagi untuk substrat dan enzim mengalami kehilangan aktivitas yang tinggi. Usaha yang dapat dilakukan untuk melindungi pusat aktif enzim dari pengaruh panas adalah dengan penambahan zat aditif atau dengan modifikasi kimia. 335

7 Gambar 4. Enzim hasil pemurnian pada suhu 55ºC terhadap waktu 3.6 Waktu paruh (t 1/2 ), Konstanta Inaktivasi Termal (k i ), dan Perubahan Energi Akibat Denaturasi (ΔG i ) Konstanta laju inaktivasi termal (k i ), waktu paruh (t 1/2 ), dan perubahan energi akibat denaturasi (ΔG i ) enzim hasil pemurnian dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Perubahan konstanta laju inaktivasi (k i ), waktu paruh (t 1/2 ), dan energi akibat denaturasi (ΔG i ) enzim hasil pemurnian Enzim k i (menit -1 ) t 1/2 (menit ) ΔG i (kj/mol) Enzim hasil pemurnian 0, ,5 102,449 Data pada Tabel 2 menunjukkan waktu paruh (t 1/2 ) enzim hasil pemurnian yaitu 19,5 menit dengan nilai k i sebesar 0,0355 menit -1 dan energi akibat denaturasi (ΔG i ) sebesar 102,449. Hasil ini menunjukkan enzim hasil pemurnian cukup stabil dengan memperlihatkan waktu paruh 19,5 menit [14]. Untuk penggunaan dalam industri perlu untuk meningkatkan waktu paruh enzim, yang dapat dilakukan dengan modifikasi kimia terhadap enzim hasil pemurnian. 4. KESIMPULAN DAN PROSPEK KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa enzim hasil pemurnian mempunyai suhu optimum 55 o C dan ph optimum 6. Nilai V maks = 204,08 μmol ml -1 menit -1 K M = 3,82 mg/ml substrat dan uji stabilitas termal selama 60 menit pada suhu 50 o C mempunyai k i = 0,0355 menit -1, t 1/2 = 19,5 menit, dan ΔG i = 102,449 kj/mol. 336

8 PROSPEK Kestabilan enzim hasil pemurnian masih kurang mendukung untuk digunakan dalam industri. Untuk itu perlu dilakukan peninggkatan kestabilan enzim, dengan modifikasi kimia atau proses amobilisai UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan, atas dukungan dana dalam bentuk Penelitian Hibah Kompetensi dengan Nomor kontrak: 300/UN26/8/PL/2014 Tanggal 2 Juni 2014 DAFTAR PUSTAKA [1] Maarel, M., Van der Veen, B., Uitdeehag, H., Lee, H.H. and Dijkhvizen, L. Properties and application of starch converting enzymes α- amylase familly. J. Biotechnol. 2002; [2] Chalal, D. S. Growth characteristic of microorganism in solid state fermentation for upgrading of protein values of lignocelluloses and cellulose production. American Chemical Society. 1983; p [3] Coughlan, M. Cellulose degradation by fungi. Microbiol Enzymes and Biotechnology. 1990; [4] Beguin, P. And Aubert, J.P. The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiology Reviews. 1994; 13: [5] Zaldivar, J., Nielsen, J., and Olsson, L. Fuel ethanol production from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integration. Applied Microbiology and Biotechnology. 2001; 56: [6] Goddete, D.W., C. Terri, F.L Beth, L. Maria, R.M. Jonathan, P. Christian, B.R. Robert, S.Y. Shiow, and C.R. Wilson. Strategy and implementation of a system for protein engineering. J.Biotechnology. 1993; 28: p [7] Wagen ES. Strategies for Increasing The Stability of Enzymes, in Enzyme Engineering. The New York Academy of Sciences, New York. 1984; 7: [8] Mozhaev, V.V., K. Martinek Structure Stability Relationship in Proteins: New Approaches to Stabilizing Enzymes. Enzym Microb. Technol., 6 : [9] Yandri, Tati S., Sutopo H. Purification and Characterization of Extracellular - Amilase Enzyme from Locale Bacteria Isolate Bacillus subtilis ITBCCB148 EJSR, 2010; 39(1),

9 [10] Mandels, M., A. Raymond, and R. Charles. Measurement of saccharifying cellulose. Biotech. & Bioeng. Symp, 6. John Wiley & Sons Inc [11] Lowry, O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., and Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: p [12] Kazan, D., H. Ertan, and A. Erarslan. Stabilization of Escherichia coli Penicillin G Acylase agains thermal Inactivation by cross-linking with dextran dialdehyde polymers. Applied. Microbiol Biotechnol,1997; 48: p [13] Vieille, C. and J. G. Zeikus. Thermozymes: Identifying molecular determinant of protein structural and functional stability, Tibtech. 1996; 14 (6), [14] Stahl, S. Thermophilic microorganisms: The biological background for thermophily and thermoresistance of enzymes in Thermostability of Enzymes (Gupta, M.N. editor), Springer Verlag, New Delhi. 1999;