KULTUR PROTOPLAS. Yushi Mardiana, SP, Msi Retno Dwi Andayani, SP, MP

Transkripsi

1 KULTUR PROTOPLAS Yushi Mardiana, SP, Msi Retno Dwi Andayani, SP, MP

2 Protoplas adalah sel yang telah dihilangkan dinding selnya. Sehingga sangat rentan pada perubahan lingkungan Pendahuluan

3 Protoplas adalah sel yang telah dihilangkan dinding selnya. Sehingga sangat rentan pada perubahan lingkungan Studi tentang protoplas banyak digunakan sebagai model untuk mempelajari sifat tanaman dan bakteri pada tingkat seluler Pendahuluan

4 Isolasi Protoplas Protoplas dapat diisolasi dari berbagai bagian tanaman, seperti:

5 Isolasi Protoplas Protoplas dapat diisolasi dari berbagai bagian tanaman, seperti: Akar

6 Isolasi Protoplas Protoplas dapat diisolasi dari berbagai bagian tanaman, seperti: Akar Daun

7 Isolasi Protoplas Protoplas dapat diisolasi dari berbagai bagian tanaman, seperti: Akar Daun Koleoptil

8 Isolasi Protoplas Protoplas dapat diisolasi dari berbagai bagian tanaman, seperti: Akar Daun Koleoptil Jaringan buah

9 Isolasi Protoplas Protoplas dapat diisolasi dari berbagai bagian tanaman, seperti: Akar Daun Koleoptil Jaringan buah Kalus

10 Isolasi Protoplas secara Enzimatik

11 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Pada umumnya, proses isolasi protoplas dilakukan secara enzimatik.

12 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Pada umumnya, proses isolasi protoplas dilakukan secara enzimatik. Yaitu memanfaatkan kerja enzim untuk mendegradasi dinding sel.

13 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Pada umumnya, proses isolasi protoplas dilakukan secara enzimatik. Yaitu memanfaatkan kerja enzim untuk mendegradasi dinding sel. Dinding sel tanaman terbuat dari pektin, hemiselulosa, dan selulosa.

14 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Pada umumnya, proses isolasi protoplas dilakukan secara enzimatik. Yaitu memanfaatkan kerja enzim untuk mendegradasi dinding sel. Dinding sel tanaman terbuat dari pektin, hemiselulosa, dan selulosa. Setidaknya ada 15 jenis enzim yang dapat digunakan untuk mendegradasi dinding sel.

15 Enzim 15 Enzim yang digunakan untuk mendegradasi dinding sel adalah: Pectin glycosidase Cellulase R10 Macerozyme Rohament P Driselase Pectolyase Y23 Cellulosyn Rhozyme pectinase xylanase meicelase cellulase onozuka RS cellulase hemicellulase Macerase

16 Enzim Organisme Produsen Selulase driselase Basidiomycetes Kyowa Hakko Kogyo Co. Japan onozuka RS Trichoderma viride Yakult Honsha Co. Japan cellulysin T. viride Calbiochem, USA cellulase Aspergillus niger Sigma Chemical Co meicelase CESB T. viride Meiji Seika Kaisha, Ltd. Japan Hemicelulase rhozyme HP-150 Aspergillus niger Rohm and Hass Co. USA hemicellulase A. niger Sigma Chemical Co. Pectinase macerozyne R-10 Rhizopus spp Yakult Honsha Co. Japan macerase Rhizopus spp Calbiochem, USA pectolyase Y-23 Aspergillus japonicus Seishim Pharmaceutical Co. pectinol AC A. niger Corning glass, USA pectinase A. niger Sigma Chemical Co. PATE (pectic acid acetil transfer) Hoescht, Germany

17 Isolasi Protoplas dari Daun

18 Isolasi Protoplas dari Daun Sterilisasi daun

19 Isolasi Protoplas dari Daun Sterilisasi daun Penghilangan epidermis

20 Isolasi Protoplas dari Daun Sterilisasi daun Penghilangan epidermis Perlakuan enzimatik

21 Isolasi Protoplas dari Daun Sterilisasi daun Penghilangan epidermis Perlakuan enzimatik Isolasi dan pemurnian protoplas

22 Tahap Isolasi Protoplas pada Daun daun yang telah tumbuh sempurna pada fase vegetatif direndam pada alkohol 70% selama 1 menit

23 Tahap Isolasi Protoplas pada Daun daun yang telah tumbuh sempurna pada fase vegetatif direndam pada alkohol 70% selama 1 menit kemudian direndam sodium hypoclorite 2% selama 2-3 menit

24 Tahap Isolasi Protoplas pada Daun daun yang telah tumbuh sempurna pada fase vegetatif direndam pada alkohol 70% selama 1 menit kemudian direndam sodium hypoclorite 2% selama 2-3 menit dibilas 3 kali dengan aquades steril. Pembilasan dilakukan untuk menghasilkan protoplas yang murni

25 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Cara pertama, metode langsung:

26 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Cara pertama, metode langsung: Cacahan daun direndam pada larutan enzim steril (0,5 macerozym +2% onozuka celulase dalam 13% sorbitol atau manitol pada ph 5,4)

27 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Cara pertama, metode langsung: Cacahan daun direndam pada larutan enzim steril (0,5 macerozym +2% onozuka celulase dalam 13% sorbitol atau manitol pada ph 5,4) Kemudian diinkubasi selama jam.

28 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Cara pertama, metode langsung: Cacahan daun direndam pada larutan enzim steril (0,5 macerozym +2% onozuka celulase dalam 13% sorbitol atau manitol pada ph 5,4) Kemudian diinkubasi selama jam. Setelah diinkubasi, potongan daun digoyang-goyangkan untuk melepaskan protoplasma

29 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Cara pertama, metode langsung: Cacahan daun direndam pada larutan enzim steril (0,5 macerozym +2% onozuka celulase dalam 13% sorbitol atau manitol pada ph 5,4) Kemudian diinkubasi selama jam. Setelah diinkubasi, potongan daun digoyang-goyangkan untuk melepaskan protoplasma Kemudian disaring untuk membuang debris

30 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Cara pertama, metode langsung: Cacahan daun direndam pada larutan enzim steril (0,5 macerozym +2% onozuka celulase dalam 13% sorbitol atau manitol pada ph 5,4) Kemudian diinkubasi selama jam. Setelah diinkubasi, potongan daun digoyang-goyangkan untuk melepaskan protoplasma Kemudian disaring untuk membuang debris Tambahkan 100 g supernatan, diambkan selama 1 menit

31 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Cara pertama, metode langsung: Cacahan daun direndam pada larutan enzim steril (0,5 macerozym +2% onozuka celulase dalam 13% sorbitol atau manitol pada ph 5,4) Kemudian diinkubasi selama jam. Setelah diinkubasi, potongan daun digoyang-goyangkan untuk melepaskan protoplasma Kemudian disaring untuk membuang debris Tambahkan 100 g supernatan, diambkan selama 1 menit Murnikan dengan pencucian menggunakan 13% sorbitol, yang diulang sebanyak 3 kali

32 Isolasi Protoplas secara Enzimatik Cara pertama, metode langsung: Cacahan daun direndam pada larutan enzim steril (0,5 macerozym +2% onozuka celulase dalam 13% sorbitol atau manitol pada ph 5,4) Kemudian diinkubasi selama jam. Setelah diinkubasi, potongan daun digoyang-goyangkan untuk melepaskan protoplasma Kemudian disaring untuk membuang debris Tambahkan 100 g supernatan, diambkan selama 1 menit Murnikan dengan pencucian menggunakan 13% sorbitol, yang diulang sebanyak 3 kali Protoplas diambil dengan cara dipipet secara hati-hati

33 Protoplas yang diisolasi dari daun berwarna merah dan daun berwarna hijau

34 Kultur dan Regenerasi Protoplas Protoplas yang sudah ditanam di media kultur akan meregenarasi dinding sel di sekelilingnya untuk membentuk sel yang sempurna sehingga dapat membelah dan memperbanyak diri membentuk mikro kalus

35 Kultur dan Regenerasi Protoplas Protoplas yang sudah ditanam di media kultur akan meregenarasi dinding sel di sekelilingnya untuk membentuk sel yang sempurna sehingga dapat membelah dan memperbanyak diri membentuk mikro kalus Dengan manipulasi media dan lingkungan kultur yang tepat, kalus dari protoplasma akan terinduksi menjadi embrio dan berkembang menjadi tanaman.

36 Regenerasi tanaman dengan metode kultur protoplas merupakan metode yang paling sulit.

37 Regenerasi tanaman dengan metode kultur protoplas merupakan metode yang paling sulit. Setiap tanaman membutuhkan modifikasi media dan penambahan ZPT tertentu untuk meningkatkan peluang keberhasilan kultur ini

38 Regenerasi tanaman dengan metode kultur protoplas merupakan metode yang paling sulit. Setiap tanaman membutuhkan modifikasi media dan penambahan ZPT tertentu untuk meningkatkan peluang keberhasilan kultur ini Protoplas biasanya diinkubasi pada ruangan gelap selama beberapa hari sebelum dipindahkan pada ruang inkubasi bercahaya

39 Tahap perkembangan protoplas yang sudah diisolasi

40 Metode Kultur Protoplas Metode kultur pada media agar Metode ini dilakukan dengan cara memekatkan konsentrasi protoplas menjadi dua kali kerapatan media Kemudian ditambahkan 1.2 % larutan agar pada temperatur 40 oc, dan dituangkan pada petridish Protoplas berada dalam larutan agar

41 Metode kultur tetes Metode ini dilakukan dengan mencampur protoplas pada media, dengan meningkatkan kerapatan protoplas menjadi dua kali kerapatan medium Kemudian diteteskan pada medium padat tipis sebanyak µl

42

43 Metode Kultur Cair Metode ini paling sederhana dan banyak dilakukan pada kultur protoplas Solanaceae Protoplas segar hasil isolasi ditetapkan pada konsentrasi final Protoplas dipipet dan dikulturkan pada media cair yang sesuai.