2014/9/29. Metode Analisis Tumbuhan. Polaritas serta faktor dilusi dan konsentrasi. Latihan. Kepolaran pelarut

Transkripsi

1 HO O 2014/9/29 Metode Analisis Tumbuhan S1-Kimia Institut Pertanian Bogor Metode Analisis Tumbuhan: Ekstraksi dan Pemisahan Komponen Fitokimia Konsep penting dalam ekstraksi komponen kimia tumbuhan Metode ekstraksi dan sample clean up Prosedur fraksionasi Analisis ekstrak kasar, fraksionasi, dan senyawa yang diisolasi Konsep Penting dalam Ekstraksi Komponen Kimia Tumbuhan Penting untuk mengetahui konsep umum untuk memilih, melakukan, dan memodifikasi prosedur sehingga molekul yang diharapkan dapat diidentifikasi. Polaritas serta faktor dilusi dan konsentrasi Deteriosasi, dekomposisi, dan Variasi biologi Autentikasi material tumbuhan Dereplikasi Polaritas serta faktor dilusi dan konsentrasi Polaritas: Definisi: Distribusi muatan dalam molekul Biasanya berhubungan dengan jumlah elektron dan pasangan elektron bebas dalam molekul Keberadaan cincin aromatik, ikatan ganda C=C, dan gugus karbonil bentuk umum kelompok pertama Pasangan elektron bebas yang berikatan dengan atom elektronegatif spt N, O, Cl dan halogen lain Ukuran molekul pada senyawa yang kurang polar Kepolaran pelarut Latihan Pelarut Kepolaran Pelarut Kepolaran heksana toluena diklorometan a kloroform Sangat non polartidak ada ikatan rangkap atau atom elektronegatif Sangat sedikit kepolarannya karena memiliki cincin aromatik dengan elektron Beberapa keelektronegatifan karena atom Cl Lebih polar dari diklorometana karena 3 atom Cl Etil asetat Lebih polar karena elektron dan pasangan elektron bebas pada atom O Butan-1-ol Polar karena bebas air Asam asetat Polar: molekul kecil Lebih polar dari air karena terionisasi dan berubah menjadi muatan negatif pada O Tentukan urutan kepolaran dari yang paling non polar hingga paling polar dari senyawa berikut: Dietil eter * Butanol Butanon * Air Metanol *Asam atau basa dalam larutan Etanol * Aseton Etil asetat * Kloroform Diklorometana * Benzena Toluena * Heksana 1

2 Polaritas serta faktor dilusi dan konsentrasi Dilusi dan Faktor Konsentrasi Uji bioesai memerlukan konsentrasi yang diketahui dengan pasti efek dosis Dosis rendah tdk ditemukan efek toksik Pilih dosis dari rendah hingga tinggi Hubungkan dengan penggunaan secara etnofarmakologi lalu dihubungkan dengan jumlah material dan ekstrak Ekstrak kasar dari suatu organisme umumnya hanya mengandung <1%w/v senyawa aktif konsentrasi ekstrak 100 atau 1000x lebih besar dari senyawa murninya or kontrol positif Polaritas serta faktor dilusi dan konsentrasi Dilusi dan Faktor Konsentrasi Dengan difraksionasi konsentrasi senyawa aktif akan meningkat konsentrasi uji harus dikurangi Penurunan konsentrasi bergantung rendemen dalam proses jangan lupa tentukan rendemen Konsentrasi penting untuk tujuan penggunaan dan komersial Dosis yang diperlukan untuk treatmen yang efektif ekstrapolasi hasil dari uji pada hewan atau sistem in vitro sebagai justifikasi saintifik atau validasi pada manusia Misal: efektif dosis senyawa 1mg/kg pada manusia, jumlah produk yang didapat hanya 5mg? SINERGI Sinergi Sinergi muncul ketika efek 2 atau lebih komponen yang diberikan bersama pada sistem biologi lebih dari penjumlahan efeknya masing-masing ketika digunakan sendiri. Kemungkinan karena tiap senyawa bekerja dengan jalur yang berbeda Alasan utk masalah sebelumnya dan mengapa suatu fraksi kurang aktif dari pada ekstraknya Aktivitas suatu ekstrak dapat berubah sejalan dengan waktu atau setelah difraksionasi karena perubahan lingkungan atau senyawa kimia yang ada di dalamnya senyawa ini berubah menjadi senyawa lain, aktivitas keseluruhan akan berubah Beberapa kasus malah meningkatkan aktivitas (vanilin menjadi wangi setelah fermentasi) perhatikan penggunaan secara tradisional Perubahan terjadi karena mahluk hidup, senyawa kimia, atau proses enzimatik dalam campuran Penurunan kadar terjadi paling sering pada bahan biologis yang harus dianalisis sebelum diekstraksi atau diperlakukan dengan cara lain karena mikrobiologi atau insek saat menganalisis tumbuhan Sampel dalam kultur mikroba dapat terkontaminasi oleh mikroorganisme lain Mikroba menyebabkan oksidasi, hidrolisis atau polimerisasi. Mikroba juga memproduksi metabolitnya yang menyebabkan aktivitas biologis membingungkan data aktivitas Perhatikan kontaminan secara kasat mata, sterilisasi atau ekstrak cepat dengan pelarut yang toksik untuk mikroorganisme Simpan dalam freezer bahan sebelum digunakan Pengeringan bahan oven atay freeze-drying Pembuatan menjadi serbuk Dekomposisi dapat terjadi pada tiap tahap fraksionasi karena oksidasi, hidrolisis, isomerisasi dan polimerisasi. Terkena cahaya, adanya oksigen, suhu dapat meningkatkan dekomposisi Pada ekstrak kasar mungkin ada senyawa yang menjaga agar tak terjadi dekomposisi seperti flavonoid sebagai antioksidan akan mencegah oksidasi, jika senyawa ini hilang mungkin terjadi dekomposisi menghasilkan artefak Penggunaan larutan asam atau basa dalam air dapat menyebabkan hidrolisis ester atau pembentukan ester yang akhirnya akan menyebabkan terbentuknya alkohol jika terdapat asam dalam ekstrak Penggunaan larutan amonia hrs dihindari jika menganalisis alkoloid karena N dalam amonia sering bergabung dengan senyawa membentuk senyawa alkaloid-like yang tdk ditemukan di alam 2

3 Deteriosasi, dekomposisi, dan Dekomposisi dapat dengan cepat saat TLC karena senyawa disebar di TLC dengan permukaan yang luas dan terkena oksigen. Penting untuk mengambil pita yang sudah terpisah secepatnya menggunakan eluen Perubahan senyawa dapa terlihat dari perubahan warna. Oksidasi spt oksidasi fenolik pada TLC biasanya menyebabkan munculnya zona berwarna kuning yang semakin pekat Deteriorasi sering muncul ketika kadar senyawanya sangat kecil, kurangi dengan bekerja pada suhu rendah, menjaga dari cahaya dengan menutup alat dengan aluminium foil, mengalirkan N2 dan mempercepat proses fraksionasi Fraksi harus disimpan dalam keadaan tertutup, dlm refrigerator atau pada suhu -40oC. Kaca merupakan bahan penyimpan yang baik walau mudah pecah. Plastik kadang menyerap ekstrak. Plastik dapat digunakan untuk menutup kaca tapi hindari menutup permukaaan dengan foil Deteriosasi, dekomposisi, dan Variasi biologi 2 alasan utama mengapa variasi biologi menjadi penting: Variasi jumlah dan identitas senyawa kimia yang ada: Variasi profil kimia Sistem biologi yang hidup organisme atau jaringan secara individu dapat berbeda responnya pada konsentrasi dan kondisi yang sama. Variasi dalam respon sistem uji Variasi dalam profil kimia Variasi Biologi Perbedaan profil kimia akan menyebabkan perbedaan aktivitas Penting: Bagian organisme yang digunakan harus identik Pengambilan sebaiknya dalam waktu yang sama saat pengambilan sebelumnya Penyebab perbedaan: Keadaan fenotip dari tiap spesies Keadaan eksternal spt iklim, ketinggian, tipe tanah yang menyebabkan kemotipe yang dihasilkan berbeda Penting untuk melakukan standardisasi, cek profil kimianya melalui TLC or HPLC 3

4 Variasi Biologi Variasi Biologi UV B ( ) Flavonoid Luas daun Ketebalan daun Fotosintesis Variasi dalam respon sistem test Autentikasi material tumbuhan Pengaruh akibat faktor genetik, ukuran, metode analitik dll Penting untuk cek kinerja alat Material biologi yang digunakan harus seuniform mungkin Perlu menggunakan positif dan negatif kontrol Penting untuk mengidentifikasi senyawa material alami dan meng-autentikasinya Sumber pengambilan sampel yang pasti perlu dicatat terutama tanaman karena hewan dapat berpindah Buat herbariumnya voucher specimen Dereplikasi Metode Analisis Tumbuhan Masalah umum dalam skrining dalam skala besar ialah dilakukan pada saat yang sama, struktur yang mirip, senyawa aktif yang terdapat dalam ekstrak Penting melakukan pada waktu yang sama dan melakukan fraksionasi dengan waktu yang singkat Data senyawa aktif yang sudah ada akan membuat kita memisahan senyawa baru (novel) Selalu simpan data sumber organisme, metode ekstraksi, karakteristik kromatografi, dan karakteristik spektra. Konsep penting dalam ekstraksi komponen kimia tumbuhan Metode ekstraksi dan sample clean up Prosedur fraksionasi Analisis ekstrak kasar, fraksionasi, dan senyawa yang diisolasi 4

5 Metode ekstraksi dan sample clean up a. Faktor yang harus dipertimbangkan dalam memilih metode ekstraksi b. Metode ekstraksi yang umum c. Metode ekstraksi untuk grup fitokimia spesifik d. Teknik clean up untuk menghilangkan substansi tak diinginkan Faktor yang harus dipertimbangkan Tujuan ekstraksi: Senyawa yang ingin diekstraksi Golongan senyawa yang ingin diekstraksi Organisme yang digunakan secara tradisional Sifat senyawa yang akan diisolasi belum diketahui dengan pasti Skala Sifat senyawa yang ingin diisolasi Polaritas Efek pada ph berbeda Kestabilan thd panas Sifat pelarut yang akan digunakan Volatilitas, flamabilitas dan titik didih Toksisitas Reaktivitas biaya Memilih metode ekstraksi Penggunaan ekstrak Penggunaan pelarut berulang Metode Ekstraksi yang umum Sifat Cara maserasi Pendggodogan tanpa refluks Penggodogan dengan refluks Soskletasi Suhu Suhu ruang T>T ruang T>Truang T>Truang komponen Tahan panas & tidak tahan panas Tahan panas Tahan panas Tahan panas Kemungkinan rusaknya komponen Penggunaan pelarut Kepekatan ekstrak kasar Sangat kecil Mungkin ada Mungkin ada Mungkin ada Boros (3 ulangan = 3v) encer Lebih boros dari maserasi(>>3v) Lebih pekat dari hasil maserasi Sama dengan maserasi (3v) Lebih pekat dari hasil maserasi Paling hemat (12 ulangan, v) Paling pekat (ulangan banyak, pelarut sedikit) Rendemen sedikit >maserasi > maserasi >>> maserasi Pemekatan Ekstrak Perlu dihindari rusaknya komponen Perbandingan penggunaan rotavapor dan penguap biasa? Kapan digunakan freeze drier? Metode ekstraksi untuk grup fitokimia Minyak, lemak dan lilin M Aldi & Rizky A Minyak essential Desi Sopianti Karotenoid Tati Elisa & Hanhan Alkaloid Arum Vitasari & Palupi Glikosida Vany & Annisa Senyawa fenolik Afiyatina & Yuris Protein Qisthia & Widia Polisakarida Yuni & Eka 5

6 Teknik clean up untuk menghilangkan substansi tak diinginkan Menghilangkan klorofil Rini A & Rinna Polifenol Norma & Dian Protein Nurul & Mieke Minyak dan lemak Khoirotul & Aprilia Polisakarida larut air Riesta & Afifia Gula Bayu & Ratna 6