ISOLASI BERTAHAP BAKTERI PENDEGRADASI MINYAK BUMI DARI SUMUR BANGKO

Transkripsi

1 PROCEEDING SIMPOSIUM NASIONAL IATMI 21 Yogyakarta, 3-5 Oktober 21 ISOLASI BERTAHAP BAKTERI PENDEGRADASI MINYAK BUMI DARI SUMUR BANGKO Pingkan Aditiawati 1, Megga R Pikoli 2, dan Dea Indriani A 1 1 Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi ITB 2 Alumni S2 Biologi Institut Teknologi Bandung Kata kunci : bakteri; degradasi; isolasi; minyak bumi. ABSTRAK Telah dilakukan isolasi bakteri termofilik pendegradasi minyak bumi dari Sumur Bangko dengan cara bertahap karena prosedur isolasi biasa belum tentu dapat mengisolasi bakteri pendegradasi secara lengkap. Isolasi tahap I dilakukan langsung dari crude oil di dalam medium basal Stone Mineral Salt Solution ditambah ekstrak ragi (SMSSe). Isolasi tahap II dan III dilakukan dari sumber isolat, medium basal dan kondisi kultur yang sama tetapi medium pengisolasi diperkaya dengan minyak sisa degradasi (MSD) isolat campuran tahap sebelumnya. Pada tahap I diperoleh 4 isolat, yaitu Bacillus polymyxa, B. licheniformis, Bacillus sp.1 dan Pseudomonas aeruginosa; pada tahap II diperoleh 3 isolat, yaitu Bacillus sp.2, B. stearothermophllus dan B. brevis; sedangkan pada tahap III hanya diperoleh 1 isolat, yaitu B. coagulans. Kemampuan setiap isolat dalam mendegradasi minyak bumi kemudian diuji dengan menggunakan kultur tunggal dan kultur campur. Isolat-isolat tersebut memiliki pertumbuhan yang paling baik pada minyak pengisolasinya masing-masing, yaitu isolat-isolat tahap I memiliki pertumbuhan paling baik ketika mendegradasi crude oil, isolatisolat tahap II tumbuh lebih baik pada saat mendegradasi MSD I daripada saat mendegradasi crude oil, demikian pula dengan isolat tahap III yang tumbuh paling baik pada MSD II. Hal ini menunjukkan adanya degradasi spesifik yang terjadi pada masing-masing tahap. Persentase degradasi yang berbeda pada setiap tahap juga teramati pada data yang diperoleh dari metode gravimetri. Degradasi total sebesar 12,5%; 37,3% dan 55,54% berturut-turut terjadi pada isolat tahap I, II dan III. Dengan demikian isolat-isolat bakteri yang diperoleh secara bertahap harus diterapkan secara bertahap pula untuk memperoleh hasil degradasi yang lebih besar. 1. PENDAHULUAN Penggunaan mikroba baik dalam MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) maupun bioremediasi minyak bumi, melibatkan pengetahuan yang mendasar tentang perubahan minyak bumi yang diperankan oleh mikroba. Mikroba yang telah dikenal kemampuan yang tinggi dalam mendegradasi minyak bumi adalah dari jenis bakteri. Bakteri pendegradasi minyak bumi diisolasi dari lingkungan yang telah lama terdedah minyak bumi, misalnya tanah dan laut yang tercemar minyak atau dari minyak bumi itu sendiri bahkan diarahkan pada bakteri-bakteri endogen yang terkandung di dalam minyak bumi dalam sumur minyak yang bertemperatur tinggi. Bakteri hidrokarbonoklastik tidak selalu mampu mendegradasi fraksi aromatik dalam minyak bumi. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan bakteri mendegradasi fraksi-fraksi hidrokarbon tergantung pada enzim yang dimilikinya (Fedorak et al., 1983, Harayama et al., 1995). Sifat-sifat tersebut memungkinkan isolasi bakteri pendegradasi minyak bumi diarahkan melalui substratnya, yaitu dengan memperkaya medium pengisolasi dengan fraksi tertentu di dalam minyak bumi. Prosedur isolasi bakteri yang lazim dilakukan biasanya hanya dapat mengisolasi bakteri pendegradasi minyak bumi yang mendominasi kultur, yaitu bakteri yang pertama mendegradasi minyak bumi dan mampu mencapai konsentrasi sel tinggi dengan cepat. Bakteri yang mula-mula bekerja biasanya merupakan pengoksidasi alkana normal karena fraksi ini mendominasi kebanyakan minyak bumi, lebih mudah larut dalam air dan terdifusi ke dalam membran sel bakteri (Walker and Colwell, 1974, Horowitz et al., 1975, Sigiura et al., 1997). Bakteri pendegradasi fraksi minyak yang lebih sulit didegradasi tumbuh lebih lambat dan jumlahnya lebih sedikit karena kalah bersaing dengan bakteri pendegradasi substrat alkana yang merupakan fraksi dalam jumlah yang lebih besar, sehingga bakteri ini sulit terisolasi. Peran bakteri ini sebenarnya penting dalam melaksanakan degradasi fraksi minyak lain yang sulit didegradasi (Horowitz et al., 1975). Bakteri pendegradasi fraksi minyak yang sulit didegradasi ini dapat diperoleh dengan memanfaatkan fraksi minyak bumi yang masih ada setelah pertumbuhan yang lengkap bakteri pendegradasi awal (Harayama et al., 1995). Oleh karena itu degradasi minyak bumi yang lengkap dapat dicapai dengan memanfaatkan bakteri-bakteri yang diisolasi secara bertahap. Biodegradasi minyak bumi lebih sering diperkirakan oleh kerja kultur tunggal, jarang ditentukan dengan menggunakan kultur campuran. Pada beberapa kasus degradasi minyak bumi ditentukan dengan mengukur metabolisme salah satu hidrokarbon tunggal, biasanya senyawa yang cepat dimetabolisme seperti alkana. Komunitas mikroba pendegradasi minyak bumi di alam terdapat bersama dengan suatu cmpuran hidrokarbon yang kompleks, yang beberapa diantaranya mempengaruhi metabolisme hidrokarbon lainnya. Sebagian hidrokarbon tertentu akan dioksidasi ketika mikroba itu menggunakan fraksi lain (Atlas, 1981). Kemampuan degradasi suatu jenis mikroba terbatas hanya pada kisaran senyawa hidrokarbon tertentu, namun beberapa jenis mikroba akan bekerja secara bersamaan dalam mendegradasi minyak bumi sesuai dengan spesifisitas substrat yang dimiliki (Harayama et al., 1995). Pada penelitian ini akan dilakukan isolasi secara bertahap dan membuktikan terjadinya degradasi bertahap pada minyak bumi oleh isolat-isolat yang diperoleh, untuk selanjutnya menggunakan isolat-isolat tersebut pada penelitian bioremediasi dasar dan terapan.

2 2. METODOLOGI Isolasi dilakukan 3 tahap, dengan menggunakan sampel minyak bumi ( crude oil ) dari sumur Bangko, Sumatera sebagai sumber isolat. Medium basal yang digunakan adalah Stone Mineral Salt Solution (SMSS) yang terdiri dari 5 g CaCO 3 ; 2,5 g NH 4 NO 3 ; 1 g Na 2 HPO 4.7H 2 O;,5 g KH 2 PO 4 ;,5 g MgSO 4.7H 2 O dan,2 g MnCl 2.7H 2 O yang dilarutkan di dalam 1 liter akuades (Sharpley, 1966). Ekstrak ragi sebanyak,1% (b/v) ditambahkan ke dalam medium SMSS sebagai sumber nitrogen tambahan. Medium SMSS yang mengandung ekstrak ragi ini selanjutnya disebut SMSSe untuk mempermudah penyebutannya. Medium tersebut ditambahkan minyak bumi sebanyak 2% (b/v) sebagai sumber karbon. PH medium ini adalah 6,8-7. Isolasi tahap I didahului dengan pengocokan 2% (b/v) crude oil di dalam medium SMSSe selama 7 hari dengan kecepatan 12 rpm. Untuk keperluan isolasi, pengambilan contoh diambil setiap hari, kemudian isolasi dilakukan dengan metode pengenceran. Contoh diambil sebanyak 1 ml untuk dibiakkan di atas lempeng agar SMSSe yang mengandung crude oil dengan metode cawan tuang. Setiap koloni yang berbeda dimurnikan kembali pada medium padat yang serupa. Isolasi tahap II dan III dilakukan dengan prosedur dan kondisi yang sama, tetapi medium pengisolasinya (SMSSe) diperkaya dengan minyak sisa degradasi (MSD) tahap sebelumnya. Isolasi tahap II menggunakan MSD I, sedangkan isolasi tahap III menggunakan MSD II. Prosedur isolasi bakteri secara bertahap dari minyak bumi secara garis besar diperlihatkan pada Gambar-1. Dan prosedur pemurnian bakteri tahap I, II, dan III dapat dilihat pada Gambar-2. Isolat bakteri yang diperoleh kemudian diidentifikasi melalui pengamatan morfologi koloni, sel dan uji-uji biokimia (Capuccino, 1987). Uji kemampuan degradasi minyak bumi oleh isolat bakteri hasil isolasi tahap I, II dan III dilakukan setelah isolat diaktivasi dalam medium SMSSe yang telah ditambah crude oil dan minyak sisa degradasi seperti pada Gambar-3 dan ditentukan laju pertumbuhannya. Hasil degradasi dianalisis dengan cara menghitung berat minyak sisa degradasi (gravimetri). 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolat bakteri yang diperoleh secara bertahap dari minyak bumi Bangko di dalam medium SMSSe dengan kecepatan pengocokan 12 rpm berjumlah 8 isolat, yaitu 4 isolat dari tahap I, 3 isolat dari tahap II dan 1 isolat dari tahap III. Isolat yang diperoleh pada tahap I adalah Bacillus polymyxa (isolat I-1), B. licheniformis (isolat I-2), Bacillus sp.1 (isolat I-3) dan Pseudomonas aeruginosa (isolat I-4); pada tahap II Bacillus sp.2 (isolat II-1), B. stearothermophllus (isolat II-2) dan B. brevis (isolat II-3); sedangkan pada tahap III hanya diperoleh 1 isolat, yaitu B. coagulans (isolat III). Karakteristik koloni sel dan hasil uji biokimia dapat dilihat pada Tabel-1, 2 dan 3. Kurva pertumbuhan isolat-isolat tunggal tahap I dalam crude oil memperlihatkan bahwa pada umumnya isolat tahap I menunjukkan pola pertumbuhan yang relatif baik pada kultur tunggal di dalam medium SMSSe yang mengandung crude oil pada temperatur 5 o C dan kecepatan pengocokkan 12 rpm (Gambar-4). Isolat I-4 (Pseudomonas aeruginosa) memiliki pertumbuhan yang paling baik dengan menggunakan crude oil sebagai sumber karbon, dibandingkan dengan tiga isolat tahap I lainnya. Pertumbuhan isolat I-4 langsung mengalami fase eksponensial mulai dari jam ke- hingga jumlah sel maksimumnya tercapai pada jam ke-36. Genus Pseudomonas telah dikenal luas sebagai salah satu kelompok mikroba yang memiliki kemampuan yang tinggi dalam mendegradasi minyak bumi. Bakteri ini memiliki kemampuan mendegradasi fraksi alifatik, aromatik dan resin (Harayama et al., 1995). Pertumbuhan P. aeruginosa pada temperatur tinggi ini disebabkan bakteri ini memiliki kisaran toleransi temperatur yang luas. Selain itu, pertumbuhan P. aeruginosa yang baik pada minyak bumi dalam lingkungan bertemperatur tinggi menunjukkan bahwa bakteri ini telah sangat lama teradaptasi dalam lingkungan tersebut. Hal ini juga membuktikan bahwa P. aeruginosa yang biasanya tumbuh pada temperatur sedang benar-benar terisolasi dari crude oil. Ketiga isolat tahap I lain tampaknya tidak langsung mengalami fase eksponensial, melainkan didahului oleh fase adaptasi. Isolat I-1 (Bacillus polymyxa) baru mengalami fase eksponensial pada jam ke-12 dan peningkatan jumlah selnya tidak terlalu tajam. Demikian pula dengan isolat I-3 (Bacillus sp.1), baru tampak mengalami fase eksponensial yang nyata mulai jam ke-12. Isolat ini paling dahulu mencapai jumlah sel maksimum, yaitu pada jam ke-24, lebih cepat daripada kultur tunggal lainnya. Pada pola pertumbuhan isolat I-2 (Bacillus licheniformis) fase adaptasi tampaknya masih terjadi sampai jam ke-24, meskipun kemudian mampu mencapai jumlah sel maksimum yang lebih tinggi daripada isolat I-3 dan I-1. Isolat I-2 juga memiliki fase stasioner yang lebih lama daripada isolat lainnya. Isolat I-1 memiliki pola pertumbuhan yang paling pendek dibandingkan dengan ketiga isolat lainnya. Berbagai spesies Bacillus telah diketahui dapat tumbuh dengan baik pada temperatur termofilik. Di dalam crude oil diduga pertumbuhannya terhambat karena tidak terpenuhinya sumber nutrisi yang lain, seperti nitrogen dan fosfor (Leahy and Colwell, 199). Jumlah kedua unsur ini sangat sedikit di dalam crude oil (Neumann et al., 1981). Oleh karena itu, setelah crude oil dikocok di dalam medium SMSSe yang mengandung senyawa nitrogen dan fosfor Bacillus sp. yang terdapat di dalam crude oil menjadi aktif. Bacillus sp. yang menggunakan fraksi terbanyak dalam crude oil mencapai jumlah yang mendominasi kultur, sehingga dapat dengan mudah diisolasi. Hal inilah yang menyebabkan Bacillus sp.1, B. polymyxa, dan B. licheniformis, mudah diisolasi pada tahap I dan memiliki pertumbuhan yang relatif baik dengan menggunakan crude oil sebagai sumber karbon. Biodegradasi minyak bumi di alam sebenarnya melibatkan konsorsium dari berbagai kultur campur mikroba. Interaksi diantara populasi bakteri yang diisolasi pada tahap I dapat diketahui melalui kultur campur isolat-isolat tahap I. Pola pertumbuhan kultur campur tahap I dapat dilihat pada Gambar-5. Pertumbuhan isolat I-4 (Pseudomonas aeruginosa) masih mengungguli isolat lainnya (Gambar-5). Bahkan jumlah sel maksimumnya dicapai pada jam ke-12, lebih cepat dibandingkan dengan kultur tunggalnya (pada jam ke-36). Demikian pula dengan isolat I-1 (Bacillus polymyxa) dan I-2 (Bacillus licheniformis), jumlah sel maksimum dicapai lebih cepat dalam kultur campur, yaitu pada jam ke-24, daripada

3 dalam kultur tunggal (pada jam ke-48). Pada saat isolat I-4 telah mencapai fase stasioner menuju fase kematian, isolat I-1 dan I-2 sedang mengalami fase eksponensial yang pesat dan keduanya mencapai maksimum pada jam ke-24. Isolat I-1 dan I-2 tampaknya berinteraksi secara simbiosis mutualistik. Kedua isolat dapat mencapai jumlah sel maksimum secara hampir bersamaan dan pola pertumbuhan keduanya dalam kultur campur lebih baik daripada dalam kultur tunggal masing-masing. Interaksi antara isolat I-4 dengan I-2 dan I-1 tampaknya merupakan interaksi sinergisme, karena jika dibandingkan dengan pertumbuhan ketiga isolat pada masing-masing kultur tunggalnya, pertumbuhan dalam kultur campur ini lebih baik. Pada interaksi sinergisme kecepatan degradasi suatu senyawa berlangsung lambat oleh masing-masing populasi, tetapi apabila populasi-populasi yang berbeda dicampur, kecepatan degradasi menjadi meningkat. Hal ini disebabkan karena mikroba berinteraksi membutuhkan senyawa produk yang sama untuk pertumbuhannya (Bushell and Slater, 1981). Isolat I-3 (Bacillus sp.1) tumbuh tidak begitu baik di dalam kultur campur bersama dengan isolat tahap I lainnya. Pertumbuhannya tidak sebaik pada kultur tunggal yang mampu dengan cepat mencapai jumlah sel maksimum, yaitu pada jam ke-24. Pada kultur campur ini isolat I-3 mengalami penurunan jumlah sel tidak lama setelah inokulasi, dan baru mencapai jumlah sel maksimum pada jam ke-48 dengan kenaikan jumlah sel yang tidak terlalu besar. Pertumbuhan isolat I-3 cenderung lambat ketika isolat lainya sedang mencapai maksimum. Isolat I-3 mencapai pertumbuhan yang lebih baik dengan jumlah sel maksimum dicapai ketika ketiga isolat lainnya telah menuju fase kematian. Hal ini menunjukkan adanya interaksi negatif antara isolat I-3 dengan ketiga isolat lainnya dalam mendegradasi crude oil. Interaksi negatif dapat disebabkan oleh adanya senyawa toksik yang dihasilkan oleh anggota campuran populasi. Pada kultur campur berkepadatan tinggi, metabolit toksik dapat terakumulasi sehingga membatasi pertumbuhan (Atlas, 1981). Dalam hal ini senyawa toksik bagi isolat I-3 mungkin dihasilkan dari metabolisme oleh salah satu dari isolat I-1, I-2, dan I-4 atau interaksi di antara isolat-isolat tersebut. Perbedaan pertumbuhan antara isolat-isolat tahap I dalam kultur tunggal dan kultur campur dalam mendegradasi crude oil terlihat lebih jelas dari data jumlah sel maksimum isolatisolat tersebut (Gambar-6). Laju pertumbuhan spesifik isolatisolat tahap I tersebut dapat dilihat pada Gambar-7. Pada isolat I-4 dan I-2 laju pertumbuhan spesifik dalam kultur campur lebih tinggi 7 kali dibandingkan dalam kultur murninya masing-masing. Bahkan pada Isolat I-1 perbedaannya mencapai 12 kali. Perbedaan laju pertumbuhan spesifik pada isolat I-3 yang ditumbuhkan dalam kultur campur dan kultur murni tidak terlalu besar jika dibandingkan dengan perbedaan pada isolat lainya. Seperti halnya pada jumlah sel maksimum, isolat I-4 meiliki laju pertumbuhan spesifik yang paling tinggi, baik dalam kultur tunggal maupun dalam kultur campur, kemudian diikuti dengan isolat I-2, I-1, dan I-3. Bila dilihat dari pola pertumbuhannya, terutama pada jumlah sel maksimum dan laju pertumbuhan spesifik, dapat disimpulkan bahwa isolat I-4 (P. aeruginosa) merupakan isolat yang paling unggul di antara isolat tahap I lainnya. Berdasarkan hal tersebut P. aeruginosa merupakan bakteri yang dominan dalam konsorsium bakteri pengguna hidrokarbon pada tahap I, yang ditumbuhkan pada temperatur 5 o C. Isolasi pada tahap I bertujuan untuk memperoleh pendegradasi fraksi paling mudah didegradasi dalam crude oil. Fraksi yang paling mudah didegradasi adalah fraksi alifatik, terutama alkana normal (Atlas, 1981). Oleh krena itu P. aeruginosa yang diisolasi pada tahap I ini diduga kuat merupakan pengguna alkana sebagai substratnya. Pola pertumbuhan Isolat tahap II dan III baik dalam kultur tunggal maupun kultur campur relatif sama dengan pola pertumbuhan Isolat tahap I. Namun ada perbedaan jumlah sel maksimum dan laju pertumbuhan spesifik isolat-isolat tahap II dan III dalam kultur tunggal dan kultur campur, baik dalam mendegradasi crude oil maupun MSD I (Tabel-4). Pembahasan tentang pola pertumbuhan isolat tahap II dan III tidak akan diterangkan dengan rinci, tetapi dari pola pertumbuhan tersebut diketahui bahwa secara umum pertumbuhan ketiga isolat tahap II yaitu, isolat II-1 (Bacillus sp.2), II-2 (B. stearothermophilus) dan II-3 (B. brevis) lebih baik menggunkan MSD I daripada crude oil. Hal ini disebabkan isolat-isolat tahap II diisolasi dengan menggunakan MSD I. Hal ini berarti isolat-isolat pada tahap II ini telah menemukan substrat yang spesifik bagi enzimenzim yang dimilikinya (Sigiura et al., 1997). MSD I yang digunakan sebagai substrat adalah fraksi-fraksi minyak (crude oil) yang tidak didegradasi oleh isolat-isolat tahap I dan fraksi-fraksi minyak yang terbentuk sebagai hasil dari degradasi minyak (crude oil ). Substrat ini kemudian digunakan sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Jadi dapat disimpulkan bahwa ketiga isolat tahap II ini benarbenar merupakan isolat pengguna MSD I di dalam medium SMSSe karena secara umum pertumbuhannya paling baik menggunakan MSD I. Demikian pula dengan isolat tahap III (Bacillus coagulans) yang diisolasi dengan menggunakan MSD II, dapat tumbuh lebih baik pada MSD II daripada crude oil dan MSD I (Gambar-8). Pertumbuhan isolat III pada ketiga macam minyak tersebut menunjukkan urutan tahap degradasi, yaitu mulai dari crude oil, MSD I dan MSD II. MSD II merupakan minyak yang telah didegradasi secara berurutan, yaitu mulai dari crude oil yang didegradasi oleh isolat-isolat tahap I menjadi MSD I, dan didegradasi lagi oleh isolat-isolat tahap II menjadi MSD II. Hal ini berarti isolat tahap III menggunakan fraksi minyak sisa yang tidak didegradasi oleh isolat tahap I dan II atau senyawa-senyawa hidrokarbon yang terbentuk sebagai hasil degradasi isolat tahap I dan II. Degradasi minyak bumi secara bertahap dengan menggunakan beberapa kultur campur bakteri dapat menghasilkan degradasi yang lebih besar dibandingkan dengan degradasi dengan inokulasi secara bersamaan. Hal ini disebabkan karena senyawa-senyawa hidrokarbon yang lebih ringan dan lebih sederhana dapat didegradasi dahulu pada tahap awal oleh suatu kultur campur mikroba, kemudian senyawa yang tidak didegradasi pada tahap awal didegradasi oleh kultur campur kedua dan seterusnya (Horowitz et al., 1975). Setiap jenis bakteri pendegradasi minyak hanya mendegradasi substrat hidrokarbon dalam kisaran yang terbatas. Oleh karena itu, setelah diketahui kemampuan degradasi setiap mikroba melalui evaluasi kultur tunggalnya, suatu kultur campur pendegradasi minyak bumi secara

4 bertahap dapat menghasilkan degradasi yang lebih lengkap dan efisien, dibandingkan dengan penggunaan kultur campur (Harayama et al., 1995). Biodegradasi minyak bumi selain dapat diketahui melalui pertumbuhan mikroba yang mendegradasinya, dapat pula diketahui cara menghitung berat minyak sisa degradasi (gravimetri). Histogram pada Gambar-9 menunjukkan bahwa secara gravimetri persentase degradasi crude oil yang paling besar dilakukan oleh kultur tunggal isolat I-4 (Pseudomonas aeruginosa), yaitu lebih dari 25,58%. Degradasi crude oil yang cukup besar ini disebabkan oleh isolat I-4 diisolasi dari crude oil, sehingga merupakan isolat yang terspesialisasi menggunakan crude oil yang belum didegradasi sebelumnya. P. aeruginosa telah diketahui tidak saja memiliki kemampuan yang tinggi dalam mendegradasi fraksi alifatik, tetapi juga dapat mendegradasi PAHs, yaitu senyawa aromatik yang tahan terhadap degradasi, di samping menghasilkan biosurfaktan rhamnolipid (Deziel et al., 1996). Persentase degradasi crude oil oleh kultur campur tahap I secara gravimetri tidak sebesar yang dilakukan oleh kultur tunggal isolat I-4. Hal ini mungkin disebabkan oleh perbedaan pola pertumbuhan isolat I-4 di dalam kultur tunggal dengan pertumbuhannnya di dalam kultur campur. Isolat I-4 di dalam kultur campur bertahan tidak lama (fase eksponensialnya hanya sampai jam ke-12), sedangkan pada kultur tunggal fase eksponensial sampai jam ke-36. Menurut Horowitz et al. (1975) bahan pengemulsi dihasilkan selama fase eksponensial atau fase stasioner pada sebagian bakteri yang menggunakan crude oil sebagai substrat pertumbuhannya. Biosurfaktan yang dihasilkan pada kultur campur isolat tahap I diduga tidak sebanyak pada kultur tunggal isolat I-4, minyak bumi tidak teremulsi lebih banyak dan hasil kerja biosurfaktan tidak dapat dimanfaatkan secara optimal oleh isolat lain dalam kultur campur isolat tahap I. Pada Gambar-9 juga dapat dilihat bahwa semua isolat tahap I, baik dalam kultur tunggal maupun kultur campur menghasilkan persentase degradasi yang lebih besar dibandingkan dengan crude oil steril (kontrol) dan isolat tahap lain, kecuali isolat I-3. Hal ini membuktikan kesesuaian antara pertumbuhan bakteri dengan besarnya degradasi minyak yang dihasilkan. Menurut Jobson et al. (1972) penggunaan crude oil ditunjukkan oleh peningkatan jumlah sel mikroba yang menggunakannya. Persentase degradasi crude oil yang dilakukan oleh kultur tunggal isolat II-1, II-2, III dan kultur campur tahap II lebih kecil bila dibandingkan dengan kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa isolat-isolat tersebut tidak dapat mendegradasi crude oil dengan optimal karena untuk pertumbuhannya lebih dibutuhkan substrat berupa MSD I. Persentase degradasi MSD I oleh bakteri selalu lebih tinggi daripada kontrol, baik kontrol berupa MSD I maupun crude oil (Gambar-). Hal ini menunjukkan adanya peran yang besar dari bakteri dalam mendegradasi MSD I yang sebelumnya telah terdegradasi sendiri. Persentase degradasi yang dibandingkan terhadap kontrol crude oil juga selalu lebih tinggi daripada bila dibandingkan terhadap kontrol MSD I. Hal ini menunjukkan bahwa isolat-isolat tahap II dan III berhasil melanjutkan kerja isolat tahap I dalam mendegradasi crude oil. Hasil penelitian Harayama et al. (1995) juga menyimpulkan bahwa suatu konsorsium bakteri pendegradasi minyak bumi yang disusun secara buatan efektif mendegradasi crude oil. Crude oil merupakan campuran kompleks dari senyawa-senyawa hidrokarbon, sedangkan tiap bakteri hanya memiliki kemampuan yang terbatas dalam mendegradasinya. Pengukuran secara gravimetri dilakukan pula pada MSD II untuk mengetahui persentase degradasi MSD II oleh isolat tahap III (Bacillus coagulans). Persentase ini dibandingkan dengan tiga kontrol yaitu, crude oil, MSD I dan MSD II steril (Gambar-11). Histogram pada Gambar-11 memperlihatkan urutan persentase kontrol dari yang paling kecil ke yang paling besar yaitu, kontrol MSD II, kontrol MSD I dan kontrol crude oil. Persentase degradasi yang yang terjadi pada ketiga kontrol lebih rendah daripada yang dilakukan oleh isolat III. Persentase degradasi MSD II oleh isolat tahap III memiliki nilai yang berurutan sesuai dengan urutan kontrol, yaitu paling tinggi jika dihitung terhadap kontrol crude oil, yaitu sebesar 55,54%, kemudian 43,4% jika dihitung terhadap kontrol MSD I, dan paling rendah jika dihitung terhadap kontrol MSD II, yaitu 18,52%. Hal ini membuktikan bahwa isolat III yang diisolasi dengan menggunakan MSD II dapat meneruskan degradasi fraksi di dalam crude oil yang tidak didegradasi oleh isolat-isolat tahap sebelumnya. Senyawa tersebut diduga merupakan senyawa yang tahan terhadap degradasi, seperti senyawa yang memilki percabangan dan struktur cincin, seperti sikloalkana dan aromatik. Hanya sedikit mikroba yang dapat mendegradasi hidrokarbon yang memilki percanagan atau strukltur cincin. Hal ini disebabkan oleh senyawa hidrokarbon yang memiliki struktur seperti itu sukar untuk masuk ke dalam sel (Atlas, 1981). Urutan persentase degradasi crude oil secara bertahap dirangkum pada histogram Gambar-12. Persentase degradasi crude oil memiliki urutan dari yang paling kecil ke yang paling besar, sesuai dengan tahapan isolasi bakteri, mulai dari kontrol crude oil yang tidak didegradasi oleh bakteri, isolat tahap I, isolat tahap II, dan isolat tahap III. Urutan tersebut menunjukkan bahwa degradasi yang dilakukan secara bertahap menghasilkan hasil akhir degradasi yang lebih besar dibandingkan dengan jika degradasi itu dilakukan oleh isolat tahap I saja, yang diperoleh melalui prosedur isolasi biasa (Harayama, 1997). 4. KESIMPULAN Isolat bakteri yang diperoleh dari minyak sumur Bangko secara bertahap dengan menggunakan medium SMSSe (Stone Mineral Salt Sollution yang mengandung,1% ekstrak ragi) pada temperatur 5 o C adalah Bacillus polymyxa, B. licheniformis, Bacillus sp.1 dan Pseudomonas aeruginosa dari tahap I; Bacillus sp.2, B. stearothermophllus dan B. brevis dari tahap II; dan B. coagulans dari tahap III. Isolat bakteri yang diperoleh secara bertahap dapat mendegradasi crude oil secara bertahap pula sesuai dengan urutan tahap isolasinya, dilihat dari pertumbuhan isolat-isolat bakteri dan persentase degradasi secara gravimetri. Hasil degradasi oleh kultur campur tahap I, II, dan III secara berturut-turut yaitu sebesar 12,5%, 37,3% dan 55,54%.

5 UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada URGE dan Center Grant Departemen Biologi ITB 1997/1998 atas bantuan biaya penelitian DAFTAR PUSTAKA 1. Atlas, R.M. (1981) Microbial degradation of petroleum hydrocarbons : an environmental perspective, Microbiological Reviews, 45(1), Buchanan, R.E. & Gibbons, N.E. (1974) Bergey s Manual of Determinative Bacteriology, The William and Wilkins Co., Baltimore, page Bushell, M.E. and Slater, J.H. (1981) Mixed Culture Fermentation, Academic Press, Capuccino, J.G. and Sherman N. (1987) Microbiology: A Laboratory Manual, The Benjamin/ Cummings Publishing Co.,Inc., California, page Fedorak, P.M., Foght, J.M., and Westlake, D.W.S. (1983) Comparative studies on microbial degradation of aromatics and saturates in crude oil dalam Zajic et al. (eds), Microbial Enhanced Oil Recovery. PenWell Publishing Co., Oklahoma, Harayama, S., Sigiura K., Asaumi M., Shimauchi T., Goto M., Sasaki S. and Ishihara M. (1995) Biodegradation of Crude Oil, dalam Program and Abstratcs in the First Asia-Pasific Marine Biotechnology Conference, Shimizu, Shizuoka, Japan, page Horowitz, A., Gutnick D. and Rosenberg E. (1975) Sequential Growth of Bacteria on Crude Oil, Applied Microbiology 3(1), Jobson, A., Cook, F.D., Westlake, D.W.S. (1972) Microbial utilization of crude oil, Appl. Microbiol., 23(6), Leahy, J.G. and Colwell, R.R. (199) Microbial degradation of hydrocarbons in the environment, Microbiological Reviews, 54(3), Neumann, H.J., Paczynska-Lahme, B., dan Severin, D. (1981) Composition and Properties of Petroleum. Halsted Press. New York. 1-, Sharpley, J.M. (1966) Elementary Petroleum Microbiology, Gulf Publishing Company, Texas, page 65-95, Sigiura, K., Ishihara M., Shimauchi T. and Harayama S. (1997) Physicochemical Properties and Biodegradability of Crude Oil, Environ. Sci. Technol 31, Walker, J.D. and R.R. Colwell (1974) Microbial Petroleum Degradation: Use of Mixed Hydrocarbon Substrates, Appl. Microbiol 27(6), Tabel-1 Karakteristik Koloni Isolat Bakteri Isolat Bentuk Tepi Elevasi Warna Permukaan I-1 Irregular Lobate Raised Kuning Kasar I-2 Irregular Lobate Raised Kuning Kasar I-3 Circular Entire Pulvinate Bening Mengkilap I-4 Circular Serrate Flat Hijau Kasar II-1 Circular Undulate Raised Putih Mengkilap II-2 Circular Undulate Convex Putih Mengkilap II-3 Irregular Lobate Raised Krem Kasar III Circular Entire Convex Coklat muda Mengkilap Keterangan : Koloni yang diamati adalah koloni yang ditumbuhkan pada agar nutrisi pada temperatur 4 C selama 24 jam.. Tabel-2 Karakteristik Sel Isolat Bakteri Isola Panjang Letak Bentuk Bentuk Gram t (µm) endospora endospora I-1 Batang Positif Terminal Elips I-2 Batang 1,5 2,3 Positif Sentral Elips I-3 Batang 3 Negatif Terminal Elips I-4 Batang pendek,5 1 Negatif Tidak ada II-1 Batang 2 2,5 Positif Sentral Elips-bulat II-2 Batang 3 Positif Terminal Elips II-3 Batang 1,5 2,3 Positif Subterminal Elips-bulat III Batang 2 2,5 Positif Terminal Elips Keterangan : Sel yang diwarnai berumur 24 jam; terminal = di ujung sel; subterminal = di antara ujung dan tengah sel; sentral = di tengah sel; elips = bulat telur. Tabel-4 Jumlah sel maksimum dan laju pertumbuhan spesifik isolatisolat tahap II dalam kultur tunggal dan kultur campur pada medium SMSSe yang mengandung crude oil atau MSD I Kultur Isolat medium Jumlah sel maks (sel/ml) Tunggal Campur II-1 II-2 II-3 II-1 II-2 II-3 Laju (/jam) c.oil 2,94 x 8,69 MSD I 2,73 x,122 c.oil 2,4 x 7,47 MSD I 2,56 x 8,73 c.oil 1,6 x 9,135 MSD I 1,28 x,174 c.oil 2,86 x 6,43 MSD I 2,37 x 7,49 c.oil 2,55 x 9,211 MSD I 9,5 x 8,183 c.oil 4,17 x 7,97 MSD I 1,19 x 8,96

6 Tabel-3 Hasil uji-uji biokimia pada isolat bakteri Uji Biokimia Isolat-isolat bakteri hasil isolasi pada temperatur 5 C I-1 I-2 I-3 I-4 II-1 II-2 II-3 III Glukosa _ + Laktosa _ + Dekstrosa Pati _ + + _ + Lemak + + _ + + _ Kasein + + _ + + _ Gelatin _ + _ TSIA Asam Asam Asam Alkali Alkali Asam Alkali Asam Indol MR _ + VP + _ S. Citrate _ + H 2 S Motilitas + + _ + + _ Nitrat + + _ + + _ Reaksi Litmus Asam Reduksi litmus Asam, gas, reduksi dan curd Proteolisis Asam Tidak berubah Reduksi litmus Asam, gas, reduksi dan curd Keterangan : Temperatur pengujian 4 C selama jam; + = hasil reaksi positif; - = hasil reaksi negatif sesuai dengan prosedur uji biokimia secara mikrobiologis (2). Curd = dadih yang terbentuk karena presipitasi kasein di dalam susu. Crude oil ISOLASI TAHAP I Isolat Tahap I Degradasi crude oil oleh Isolat Tahap I Crude oil Minyak Sisa Degradasi Tahap I (MSD I) ISOLASI TAHAP II Isolat Tahap II Degradasi MSD I oleh Isolat Tahap II Crude oil Minyak Sisa Degradasi Tahap II (MSD II) ISOLASI TAHAP III Isolat Tahap III Gambar-1. Bagan prosedur isolasi bakteri secara bertahap dari minyak bumi Gambar-2 Prosedur isolasi dan pemurnian bakteri tahap I, II, dan III

7 Aktivasi I Agar SMSSe & c.oil/msd 5 ml SMSSe & c.oil/msd inkubasi 3 hr Aktivasi II 1 ose 5 ml (semua) 5 ml SMSSe & c.oil/msd kocok 24 jam Aktivasi III ml (semua) 4 ml SMSSe & c.oil/msd kocok 24 jam Laju pertumbuhan (/jam) 1,6 1,4 1,2,8 1,6,4,2 I-1 I-2 I-3 I-4 Isolat k.tunggal k.campur Gambar-3 Prosedur aktivasi isolat bakteri Gambar-7 Laju pertumbuhan spesifik isolat-isolat tahap I dalam crude oil log jumlah sel/ml Waktu (jam) I-1 I-2 I-3 I-4 log jumlah sel/ml c.o MSD I MSD II Minyak bumi Gambar-4 Kurva pertumbuhan isolat-isolat tunggal tahap I dalam crude oil Gambar -8 Jumlah sel maksimum isolat tahap III log jumlah sel/ml Waktu (jam) I-1 I-2 I-3 I-4 % degradasi "crude oil" ,42 13,95 9,75,63 25,58 9,67 5,67 16,17 4,92 12,5 6,67 K I-1 I-2 I-3 I-4 II-1 II-2 II-3 III C-I C-II Kultur dalam "crude oil" Gambar-5 Kurva pertumbuhan kultur campur tahap I dalam crude oil Gambar-9 Persentase degradasi crude oil yang diukur secara gravimetri log jumlah sel/ml I-1 I-2 I-3 I-4 Isolat k.tunggal k.campur % degradasi MSD I ,25 37,3 32,4 28,62 3,75 24,52 19,92 21,87 16,12 9,75 5,25 9,37 K II-1 II-2 II-3 C III Kultur dalam "crude oil" Terhadap kontrol MSD I Terhadap kontrol c.o Gambar-6 Jumlah sel maksimum isolat-isolat tahap I dalam crude oil Gambar- Persentase degradasi MSD I yang diukur secara gravimetri

8 % degradasi MSD II ,54 43,4 18,52 9,75 5,25,85 MSD II MSD I c.o MSD III terhadap berbagai kontrol Kontrol III % degradasi "crude oil" ,54 37,3 9,75 12,5 K (c.o) Tahap I Tahap II Tahap III Gambar -11 Persentase degradasi MSD II oleh isolat tahap III yang diukur secara gravimetri Gambar-12 Persentase degradasi crude oil secara bertahap yang diukur secara gravimetri