PRODUKSI BIOETANOL MELALUI DETOKSIFIKASI SUBSTRAT HIDROLISAT AMPAS TEBU DAN ADAPTASI SEL Candida tropicalis SITI NUR AENI

Transkripsi

1 PRODUKSI BIOETANOL MELALUI DETOKSIFIKASI SUBSTRAT HIDROLISAT AMPAS TEBU DAN ADAPTASI SEL Candida tropicalis SITI NUR AENI DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

2

3 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Produksi Bioetanol Melalui Detoksifikasi Substrat Hidrolisat Ampas Tebu dan Adaptasi Sel Candida tropicalis adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Juni 2014 Siti Nur aeni NIM G

4 ABSTRAK SITI NUR AENI. Produksi Bioetanol Melalui Detoksifikasi Substrat Hidrolisat Ampas Tebu dan Adaptasi Sel Candida tropicalis. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan SURYANI. Ampas tebu merupakan limbah pertanian yang kaya akan lignoselulosa. Limbah tersebut dapat dikonversi oleh khamir menjadi bioetanol. Penelitian ini bertujuan memproduksi bioetanol melalui detoksifikasi substrat hidrolisat ampas tebu dan adaptasi sel Candida tropicalis. Perlakuan pada penelitian ini meliputi adaptasi-detoksifikasi, adaptasi-non detoksifikasi, dan non adaptasi-detoksifikasi. Parameter yang diukur meliputi optical density (OD), kadar gula pereduksi, dan kadar bioetanol. Produksi bioetanol terbaik diperoleh dari perlakuan adaptasi dan detoksifikasi pada jam ke-72 tanpa penambahan ko-substrat dengan kadar bioetanol sebesar 0.427%, rendemen bioetanol sebesar 2.509%, dan rendemen teoritis sebesar 4.921%. Penambahan 3% glukosa sebagai ko-substrat tidak meningkatkan produksi bioetanol, tetapi berperan untuk meningkatkan biomassa sel. Kata kunci: detoksifikasi substrat hidrolisat ampas tebu, adaptasi sel Candida tropicalis, bioetanol, ko-substrat ABSTRACT SITI NUR AENI. Bioethanol Production Without Detoxification Substrate of Sugarcane Bagasse Hydrolysate and Adaptation Cell Candida tropicalis. Supervised by LAKSMI AMBARSARI and SURYANI. Sugarcane baggase is the agricultural waste that contains abundant amount of lignocelluloses. This waste could be converted to produce bioethanol. The aim of this research is to produce bioethanol without detoxification substrate of sugarcane bagasse and adaptation cell Candida tropicalis. The treatment of this research were detoxification-adaptation, detoxification-non adaptation, and non detoxification-adaptation. Parameter of this research were optical density (OD), reduction sugar concentration, and bioethanol concentration. The good bioethanol production was gated from detoxification and adaptation treatment at incubation time 72 hours not addited co-substrate with bioethanol concentration be 0.427%, bioethanol yield 2.509%, and theoretical yield 4.921%. The adding of 3% glucose as co-substrate could not increase bioethanol production, but it has role to increase the cell biomass. Keywords: detoxification substrate of sugarcane bagasse hydrolysate, adaptation cell Candida tropicalis, bioethanol, co-substrate

5 PRODUKSI BIOETANOL MELALUI DETOKSIFIKASI SUBSTRAT HIDROLISAT AMPAS TEBU DAN ADAPTASI SEL Candida tropicalis SITI NUR AENI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

6

7 Judul Skripsi : Produksi Bioetanol Melalui Detoksifikasi Substrat Hidrolisat Ampas Tebu dan Adaptasi Sel Candida tropicalis Nama : Siti Nur aeni NIM : G Disetujui oleh Dr Laksmi Ambarsari, MS Pembimbing I Dr Suryani, SP M.Sc Pembimbing II Diketahui oleh Dr Ir I Made Artika, M. App. Sc Ketua Departemen Tanggal Lulus:

8 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta ala atas segala karunia-nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari hingga Mei 2014 ini ialah bioetanol, dengan judul Produksi Bioetanol Melalui Detoksifikasi Substrat Hidrolisat Ampas Tebu dan Adaptasi Sel Candida tropicalis. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Laksmi Ambarsari MS dan Dr Suryani, S.P, MSc selaku pembimbing, serta Puspa Julistia Puspita, MSc yang telah banyak memberi saran selama pelaksanaan penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala do a dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Juni 2014 Siti Nur aeni

9 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL viii DAFTAR GAMBAR viii DAFTAR LAMPIRAN viii PENDAHULUAN 1 METODE 2 Bahan dan Alat 2 Prosedur Analisis Data 2 HASIL DAN PEMBAHASAN 5 Hasil 5 Pembahasan 10 SIMPULAN DAN SARAN 18 Simpulan 18 Saran 18 DAFTAR PUSTAKA 18 LAMPIRAN 22 RIWAYAT HIDUP 29

10 DAFTAR TABEL 1 Rendemen bioetanol perlakuan adaptasi dan detoksifikasi, adaptasi dan non detoksifikasi, serta non adaptasi dan detoksifikasi 9 2 Rendemen bioetanol dengan penambahan ko-substrat perlakuan adaptasi dan detoksifikasi 10 DAFTAR GAMBAR 1 C. tropicalis untuk stok (a) dan (b) C. tropicalis siap digunakan 5 2 Hidrolisat ampas tebu sebelum perlakuan dengan nilai ph 0.7 (a), hidrolisat ampas tebu setelah penambahan Ca(OH) 2 dengan nilai ph 2 (b), hidrolisat ampas tebu setelah penambahan Ca(OH) 2, 2% arang aktif, dan NaOH dengan nilai ph 5 (c), dan (d) hidrolisat ampas tebu setelah penambahan NaOH dengan nilai ph Hasil adaptasi C. tropicalis perlakuan adaptasi dan detoksifikasi (a) dan adaptasi dan non detoksifikasi (b) 7 4 Hasil kurva pertumbuhan, produksi bioetanol, dan gula pereduksi perlakuan adaptasi dan detoksifikasi (a), adaptasi dan non detoksifikasi (b), serta (c) non adaptasi dan detoksifikasi 9 5 Hasil produksi bioetanol dengan penambahan ko-substrat 10 6 Reaksi-reaksi detoksifikasi dengan penambahan Ca(OH) Reaksi-reaksi pengendapan senyawa-senyawa toksik oleh NaOH 12 8 Tahap akhir fermentasi etanol 13 9 Reaksi fermentasi etanol oleh mikroba Reaksi gula pereduksi dengan DNS Reaksi pembentukan biomassa sel Metabolisme pentosa dan heksosa menjadi etanol 17 DAFTAR LAMPIRAN 1 Diagram alir penelitian 22 2 Kurva pertumbuhan Candida tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu 23 3 Kurva pertumbuhan Candida tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu +3% glukosa 23 4 Hasil produksi bioetanol oleh C. tropicalis 23 5 Hasil produksi bioetanol oleh C. tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu +3% glukosa 23 6 Rendemen bioetanol perlakuan adaptasi dan detoksifikasi, adaptasi dan non detoksifikasi, serta non adaptasi dan detoksifikasi 24 7 Rendemen bioetanol pada media +3% glukosa 24 8 Absorbansi dan gula reduksi pada media adaptasi 24 9 Kurva standar etanol Kurva standar glukosa 25

11 11 Kurva standar glukosa analisis gula pereduksi Dokumentasi analisis gula pereduksi Peak HPLC 26

12

13 PENDAHULUAN Indonesia merupakan negara agraris yang mempunyai hasil pertanian melimpah. Salah satu hasil pertanian tersebut adalah tanaman tebu. Luas areal tanam tebu di Indonesia mencapai 344 ribu ha dengan kontribusi utama adalah di Jawa Timur (43.29%), Jawa Tengah (10.07%), Jawa Barat (5.87%), dan Lampung (25.71%). Ampas tebu dihasilkan dari berat tebu giling sebesar 32%, namun hanya 60% ampas tebu yang baru termanfaatkan (Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian 2007). Ampas tebu mengandung selulosa sebesar 50%, hemiselulosa sebesar 25%, dan lignin sebesar 25% (Pandey et al. 2000). Menurut (Samsuri et al. 2007) kandungan lignoselulosa ampas tebu sekitar 52.7% selulosa, 20% hemiselulosa, dan 24.2% lignin. Pemanfaatan lignoselulosa sebagai substrat dilakukan dengan perlakuan awal berupa pemecahan lignoselulosa menjadi gula yang lebih sederhana. Perlakuan awal secara mekanik dan kimiawi menggunakan suhu 80 0 C selama 1 jam dan NaOH 4%(b/v) menghasilkan kadar selulosa tertinggi 71.29%, lignin terendah 8.36%, dan gula pereduksi g/l (Yuwono et al. 2012). Perlakuan awal secara kimiawi menghasilkan senyawa-senyawa hasil samping berupa asam asetat 3 g/l, furfural <0.25 g/l, hidroksi metil furfural (HMF) 0.25 g/l, hidroksi benzaldehida (HBA) 0.25 g/l, dan senyawa fenolik <0.1 g/l (Klinke et al. 2002). Hasil samping tersebut merupakan senyawa inhibitor yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Penurunan konsentrasi senyawa hasil samping tersebut dapat dilakukan dengan pemberian arang aktif (Pandey et al. 2000), overliming dan pemberian Ca(OH) 2 (Dien et al. 2000), penggunaan resin penukar ion (Mancilha dan Karim 2003), perlakuan variasi galur khamir (Martin dan Jonsson 2003), dan perlakuan adaptasi terhadap mikroba (Rivas et al. 2003). Menurut Rao et al dan Huang et al. (2009) penurunan konsentrasi senyawa inhibitor dapat dilakukan dengan proses adaptasi dan detoksifikasi. Hidrolisat ampas tebu dengan konsentrasi senyawa inhibitor yang rendah dapat digunakan sebagai substrat untuk dikonversi menjadi bioetanol. Produksi bioetanol dapat dilakukan oleh khamir. Beberapa khamir yang telah digunakan untuk menghasilkan bioetanol adalah Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Zymomonas mobilis, dan Pichia stipitis. Produksi bioetanol menggunakan C. tropicalis telah dilakukan oleh Ambarsari et al. (2013) dengan menggunakan substrat 3% glukosa menghasilkan bioetanol sebesar 2.19% dengan rendemen 73% dan substrat 3% xilosa sebesar 0.60% dengan rendemen 20%. Produksi bioetanol sebesar 0.05% dan 0.07% dihasilkan dari pati jagung oleh Saccharomyces cerevisiae dan Candida tropicalis (Jamai et al. 2001). Zymomonas mobilis digunakan untuk mengkonversi molases kacang kedelai menjadi bioetanol sebesar 2.42% dengan rendemen 78.30% (Letti et al. 2012). Selain itu, bioetanol dapat diproduksi dari proses fermentasi hidrolisat jerami padi dengan perlakuan detoksifikasi dan adaptasi oleh Pichia stipitis. Bioetanol yang dihasilkan sebesar 0.04% dengan rendemen 87% (Huang et al. 2009). Penelitian ini bertujuan memproduksi bioetanol melalui detoksifikasi substrat hidrolisat ampas tebu dan adaptasi sel Candida tropicalis. Parameter yang diukur meliputi optical density (OD), kadar gula pereduksi, dan kadar bioetanol. Hipotesis penelitian ini adalah peningkatan produksi bioetanol dapat dicapai pada

14 2 substrat hidrolisat ampas tebu yang sudah didetoksifikasi dan sel Candida tropicalis yang sudah diadaptasi. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai produksi bioetanol pada substrat hidrolisat ampas tebu oleh Candida tropicalis serta menjadi acuan bagi penelitian lanjutan yang menggunakan hidrolisat dari sumber lain untuk produksi bioetanol. METODE Bahan dan Alat Mikroba yang digunakan untuk produksi bioetanol ialah isolat Candida tropicalis yang berasal dari koleksi kultur LIPI Cibinong. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan media YMA adalah glukosa, ekstrak khamir, ekstrak malt, pepton, agar dan aquades steril. Bahan-bahan yang digunakan untuk media inokulum adalah glukosa, ekstrak khamir, pepton, KH 2 PO 4, K 2 HPO 4, MgSO 4.7H 2 O, (NH 4 ) 2 SO 4 dan aquades steril. Bahan-bahan yang digunakan untuk media adaptasi adalah hidrolisat ampas tebu, KH 2 PO 4, K 2 HPO 4, MgSO 4.7H 2 O, dan aquades steril. Bahan-bahan yang digunakan untuk media fermentasi (produksi bioetanol) sama dengan bahan-bahan yang digunakan untuk media adaptasi hanya ditambahkan (NH 4 ) 2 SO 4. Bahan-bahan yang digunakan untuk detoksifikasi hidrolisat ampas tebu adalah Ca(OH) 2, arang aktif, dan NaOH. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengukuran gula pereduksi adalah asam 3,5- dinitrosalisilat, NaOH 2N, dan Na-K-tartarat. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengukuran bioetanol adalah sampel, H 2 SO 4, etanol dan glukosa serta bahanbahan yang lain seperti kain kasa, spirtus, dan alkohol teknis. Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, jarum ose, labu Erlenmeyer, cawan Petri, gelas ukur, gelas piala, pipet mikro, pipet tetes, sudip, kertas aluminium foil, plastik wrap, magnetic stirer, autoklaf, dan laminar air flow. Sterilisasi hidrolisat ampas tebu menggunakan seperangkat alat vacuum, membran milipore, pinset, dan kertas saring. Pengukuran kadar bioetanol menggunakan high performance liquid chromatography (HPLC) serta alat-alat lain seperti kamera, inkubator, lemari pendingin, neraca analitik, dan wisebath dengan pengaturan suhu 30 0 C dan kecepatannya 120 rpm. Prosedur Analisis Data Kultivasi C. tropicalis pada media Yeast Malt Agar (YMA) dan media inokulum (Metode Rao et al. 2006) Peremajaan Kultur Candida tropicalis. Candida tropicalis dibiakkan dalam media agar miring YMA yang telah disterilisasi pada suhu C, dan tekanan 1 atm selama 15 menit, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0 C. Selanjutnya ditumbuhkan dalam media YMA telah disterilisasi dan dimasukkan ke dalam cawan Petri, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0 C. Komposisi media YMA, yaitu 3 g/l ekstrak khamir, 4 g/l ekstrak malt, 5 g/l pepton, 20 g/l glukosa, dan 20 g/l agar, kemudian diremajakan setiap 4 minggu.

15 Pembuatan Kultur Stok C. tropicalis. Candida tropicalis dalam cawan Petri diambil 1 ose dan dipindahkan ke dalam labu Erlenmeyer 50 ml yang berisi 12.5 ml media inokulum dengan komposisi (g/l): glukosa 30, ekstrak khamir 10, pepton 20, KH 2 PO 4 0.5, K 2 HPO 4 0.5, MgSO 4.7H 2 O 0.5, dan ammonium sulfat 2 dengan ph 5. Kultur diinkubasi bergoyang selama 24 jam dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 30 0 C. 3 Pembuatan Media (Modifikasi Metode Rao et al. 2006) Media yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: media inokulum, media adaptasi, dan media fermentasi. Media inokulum dibuat sebanyak 12.5 ml dalam 50 ml labu Erlenmeyer dengan komposisi (g/l): glukosa 20, ekstrak khamir 10, pepton 20, KH 2 PO 4 0.5, K 2 HPO 4 0.5, MgSO 4.7H 2 O 0.5, dan ammonium sulfat 5 dengan ph 5 dilarutkan dalam 12.5 ml aquades. Media adaptasi dibuat sebanyak 25 ml dalam 100 ml labu Erlenmeyer dengan komposisi (g/l): KH 2 PO 4 0.5, K 2 HPO 4 0.5, dan MgSO 4.7H 2 O 0.5 dengan ph 5 dilarutkan dalam 25 ml hidrolisat ampas tebu. Media fermentasi dibagi menjadi dua yaitu media fermentasi tanpa penambahan 3% glukosa dan media fermentasi dengan penambahan 3% glukosa. Media fermentasi dibuat sebanyak 100 ml dalam 125 ml labu Erlenmeyer dengan komposisi (g/l): KH 2 PO 4 0.5, K 2 HPO 4 0.5, ammonium sulfat 5, dan MgSO 4.7H 2 O 0.5 dengan ph 5 dilarutkan dalam 100 ml hidrolisat ampas tebu. Media inokulum disterilisasi pada suhu C, dan tekanan 1 atm selama 15 menit, sedangkan media adaptasi dan fermentasi disterilisasi menggunakan membran milipore. Detoksifikasi dan Adaptasi untuk Produksi Bioetanol (Modifikasi Metode Rao et al. 2006) Produksi bioetanol menggunakan media hidrolisat ampas tebu dengan perlakuan detoksifikasi dan adaptasi. Detoksifikasi dilakukan dengan menyiapkan 300 ml hidrolisat ampas tebu ditambahkan Ca(OH) 2 4M lalu didiamkan selama 1 jam. Selanjutnya, ditambahkan 2% arang aktif dan diaduk selama 30 menit, kemudian ditambahkan NaOH 10M hingga mencapai ph 5. Campuran disaring kemudian filtrat disterilisasi menggunakan membran milipore untuk selanjutnya digunakan sebagai media adaptasi dan media produksi. Adaptasi dilakukan dengan menumbuhkan sel C. tropicalis pada media adaptasi selama 20 siklus (960 jam) pada kondisi ph 5 suhu 30 0 C dengan kecepatan 120 rpm. Setiap 5 siklus (240 jam) dianalisis OD panjang gelombang (λ) 600 nm dan kadar gula pereduksi λ 550 nm. Pembuatan Kurva Pertumbuhan dan Kurva Produksi Bioetanol (Modifikasi Metode Rao et al. 2006) Sel Candida tropicalis yang ditumbuhkan pada media adaptasi 12.5 ml selama 5 siklus kemudian sel-selnya diperoleh dengan sentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 20 menit. Pelet dimasukkan ke dalam media produksi 100 ml kemudian diinkubasi bergoyang selama 96 jam dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 30 o C. Setiap 24 jam diambil sebanyak 1 ml sampel sel untuk diukur optical

16 4 density (OD) λ 600 nm hingga diperoleh kurva pertumbuhan. Kurva produksi diperoleh dengan cara pengukuran kadar bioetanol yang terbentuk pada supernatan sampel yang diambil pada jam ke-0 sampai jam ke-72. Setiap 24 jam diambil sebanyak 1 ml sampel diukur kadar bioetanol menggunakan HPLC hingga diperoleh kurva produksi. Penentuan Kadar Bioetanol dan Glukosa dengan HPLC (Modifikasi Metode Ambarsari et al. 2013) Kadar bioetanol dan glukosa dianalisis menggunakan HPLC. Prinsip kerja HPLC adalah memisahkan suatu senyawa dengan struktur yang sama atau berbeda sedikit, dengan cara adsorpsi secara selektif pada absorban yang berbeda. Spesifikasi HPLC yang digunakan yaitu kolom SHODEX SH1011, detektor RID, fase gerak 50 Mm H 2 SO 4, laju alir 0.6 µl/menit, suhu 60 0 C, waktu retensi bioetanol pada menit ke-25 dan glukosa pada menit ke-14, dan HPLC yang digunakan merek Shimadzu. Kadar bioetanol dan glukosa dianalisis dengan diinjeksikannya supernatan sebanyak 20 µl dan dianalisis waktu retensinya yang divisualisasikan dengan peak yang terbentuk. Standar bioetanol dan glukosa dianalisis untuk mengetahui kadar bioetanol dan glukosa pada sampel. Kadar bioetanol yang diperoleh, selanjutnya dianalisis rendemennya. Rendemen bioetanol dianalisis setiap 24 jam, baik rendemen bioetanol hasil penelitian maupun rendemen bioetanol teoritisnya. Rendemen bioetanol dihitung dengan rumus sebagai berikut: Rendemen bioetanol = Rendemen bioetanol teoritis = Faktor konversi glukosa menjadi etanol = 0.51 Penentuan Kadar Gula Pereduksi Menggunakan Metode DNS (Modifikasi Metode Miller 1959) Penentuan gula pereduksi dilakukan berdasarkan metode DNS. Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi asam 3,5- dinitrosalisilat (DNS) membentuk senyawa yang akan diukur absorbannya pada panjang gelombang 550 nm. Beberapa sampel tertentu perlu diencerkan untuk mempermudah pengukuran dengan metode DNS. Pereaksi DNS dibuat dengan melarutkan 5 g asam 3,5-dinitrosalisilat dan 5 g NaOH ke dalam 100 ml aquades. Setelah itu, ditambahkan 150 g Na-K-Tatrat dilarutkan dalam 200 ml aquades. Larutan ini diaduk rata dengan magnetic stirer dan ditera dengan aquades sampai 500 ml lalu didiamkan semalam. Larutan ini digunakan untuk pengukuran gula pereduksi pada sampel. Kurva standar dibuat dengan mengukur nilai gula pereduksi pada glukosa (ppm): 0, 200, 400, 800, dan Nilai gula pereduksi diukur dengan metode DNS. Hasil yang didapatkan diplotkan dalam grafik secara linear. Pengujian gula pereduksi menggunakan kurva standar DNS adalah sebagai berikut: sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 3 ml pereaksi DNS larutan tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 5 menit

17 dan didinginkan pada suhu ruang. Larutan tersebut diencerkan sebanyak 500 kali. Selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm. 5 HASIL DAN PEMBAHASAN Candida tropicalis setelah peremajaan Hasil C. tropicalis yang berasal dari kultur stok diremajakan pada media YMA pada suhu 37 0 C, ph 5, dan diinkubasi selama 48 jam. C. tropicalis yang diperoleh selanjutnya disimpan pada suhu 4 0 C. Kultur stok dan hasil peremajaan C. tropicalis yang dilakukan setiap 4 minggu pada media YMA ditunjukkan pada Gambar 1. Peremajaan ini bertujuan untuk mempertahankan kondisi optimum fisiologis mikroba. Hasil peremajaan digunakan untuk tahapan selanjutnya yaitu kultivasi pada media inokulum sebelum dikultivasi pada media adaptasi dan media fermentasi (media produksi bioetanol) oleh C. tropicalis. (a) (b) Gambar 1 C. tropicalis untuk stok (a) dan (b) C.tropicalis siap digunakan Hidrolisat ampas tebu setelah perlakuan detoksifikasi Hidrolisat ampas tebu yang digunakan pada penelitian ini mengandung senyawa inhibitor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan sel-sel C. tropicalis sehingga diberi perlakuan detoksifikasi sebelum siap digunakan sebagai substrat untuk produksi bioetanol dengan berbagai perlakuan. Detoksifikasi bertujuan untuk menurunkan konsentrasi senyawa inhibitor dalam hidrolisat ampas tebu. Hidrolisat ampas tebu didetoksifikasi menggunakan Ca(OH) 2, arang aktif, dan NaOH. Hidrolisat ampas tebu mengalami perubahan warna setelah didetoksifikasi. Hidrolisat ampas tebu sebelum perlakuan detoksifikasi berwarna coklat dengan nilai ph 0.7. Setelah penambahan Ca(OH) 2 4M, hidrolisat ampas tebu mengalami perubahan warna dari coklat menjadi kuning dengan nilai ph 2. Hidrolisat ampas tebu mengalami perubahan warna dari kuning menjadi abu-abu dengan nilai ph 5 setelah ditambahkan 2% arang aktif dan NaOH 10M, sedangkan hidrolisat ampas tebu dengan penambahan NaOH 10M mengalami perubahan warna dari coklat

18 6 menjadi hitam dengan nilai ph 5. Perubahan warna dan ph disebabkan oleh reaksi kimia yang terjadi antara hidrolisat ampas tebu dengan Ca(OH) 2, arang aktif, dan NaOH. Hidrolisat ampas tebu setelah perlakuan detoksifikasi ditunjukkan pada Gambar 2. Hidrolisat ampas tebu yang sudah didetoksifikasi digunakan untuk tahapan selanjutnya yaitu sebagai substrat pada media adaptasi dan media fermentasi (produksi bioetanol). (a) (b) (c) (d) Gambar 2 Hidrolisat ampas tebu sebelum perlakuan dengan nilai ph 0.7 (a), Hidrolisat ampas tebu setelah penambahan Ca(OH) 2 dengan nilai ph 2.0 (b), Hidrolisat ampas tebu setelah penambahan Ca(OH) 2, 2% arang aktif, dan NaOH dengan nilai ph 5 (c), dan (d) Hidrolisat ampas tebu setelah penambahan NaOH dengan nilai ph 5 Adaptasi C. tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu Sel-sel C. tropicalis ditumbuhkan pada media adaptasi dengan substrat hidrolisat ampas tebu perlakuan detoksifikasi maupun tanpa detoksifikasi. Adaptasi bertujuan untuk meningkatkan pertumbuhan C. tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu. Adaptasi dilakukan selama 20 siklus (960 jam), setiap 5 siklus (240 jam) dilakukan analisis OD dan gula pereduksi. Hasil adaptasi C. tropicalis pada media adaptasi dengan substrat hidrolisat ampas tebu ditunjukkan pada Gambar 3. Berdasarkan hasil yang diperoleh, nilai OD dan kadar gula pereduksi dengan substrat hidrolisat ampas tebu setelah detoksifikasi pada siklus ke-0, ke-1, ke-5, ke-10, ke-15, dan ke-20 berturut-turut sebesar dan 8.232%,

19 4.500 dan 5.897%, dan 2.611%, dan 2.060%, dan 2.064%, serta dan 2.132%. Ada pun nilai OD dan kadar gula pereduksi dengan substrat hidrolisat ampas tebu sebelum detoksifikasi pada siklus ke-1, ke-5, ke-10, ke-15, dan ke-20 berturut-turut sebesar dan 9.307%, dan 2.569%, dan 3.208%, dan 2.507%, serta dan 2.634%. Nilai OD yang diperoleh menunjukkan banyaknya sel C. tropicalis di dalam media adaptasi. Hal ini berarti C. tropicalis sudah beradaptasi dengan baik pada hidrolisat ampas tebu di siklus ke-5. C. tropicalis hasil adaptasi dan detoksifikasi digunakan untuk tahapan selanjutnya yaitu produksi bioetanol pada media hidrolisat ampas tebu OD gula pereduksi (%) waktu (jam) (a) OD gula pereduksi (%) waktu (jam) (b) Gambar 3 Hasil adaptasi C. tropicalis perlakuan adaptasi dan detoksifikasi (a) dan adaptasi dan non detoksifikasi (b). OD, gula pereduksi (%).

20 8 Produksi bioetanol Hasil adaptasi sel-sel C. tropicalis pada substrat hidrolisat ampas tebu dengan detoksifikasi dan non detoksifikasi digunakan untuk produksi bioetanol. Hasil produksi bioetanol perlakuan adaptasi-detoksifikasi, adaptasi-non detoksifikasi, dan non adaptasi-detoksifikasi ditunjukkan pada Gambar 4. Nilai OD, kadar gula pereduksi, dan kadar bioetanol ketiga perlakuan ditunjukkan pada (Lampiran 2 dan 4). Berdasarkan hasil yang diperoleh, maka dipilih perlakuan terbaik yaitu adaptasi dan detoksifikasi. Hal tersebut ditunjukkan dengan nilai OD, kadar gula pereduksi, dan kadar bioetanol pada jam ke-72 sebesar 8.730, %, dan 0.427% dengan rendemen bioetanol sebesar 2.509% dan rendemen teoritisnya 4.921% (Tabel 1). Produksi bioetanol dengan perlakuan adaptasi dan detoksifikasi digunakan untuk tahap selanjutnya yaitu untuk melihat pengaruh penambahan 3% glukosa pada media produksinya. 8,6 20 0,5 8,4 18 0,4 OD 8,2 8, gula pereduksi (%) 0,3 0,2 bioetanol (%) 7,8 12 0,1 7, ,0 waktu (jam) (a) , ,4 OD gula pereduksi (%) 0,3 0,2 0,1 bioetanol (%) , waktu (jam) (b)

21 , ,3 OD gula pereduksi (%) 0,2 0,1 bioetanol (%) , waktu (jam) (c) Gambar 4 Hasil kurva pertumbuhan, produksi bioetanol, dan gula pereduksi perlakuan adaptasi dan detoksifikasi (a), adaptasi dan non detoksifikasi (b), serta (c) non adaptasi dan detoksifikasi. OD, gula pereduksi (%), bioetanol (%). Tabel 1 Rendemen bioetanol perlakuan adaptasi dan detoksifikasi, adaptasi dan non detoksifikasi, serta non adaptasi dan detoksifikasi Perlakuan Waktu (jam) Rendemen bioetanol (%) Rendemen bioetanol teoritis (%) Adaptasi dan detoksifikasi Adaptasi dan non detoksifikasi Non daptasi dan detoksifikasi Produksi bioetanol dengan penambahan ko-substrat Hasil produksi bioetanol pada media dengan penambahan ko-substrat ditunjukkan pada Gambar 5. Berdasarkan hasil yang diperoleh diketahui bahwa penambahan ko-substrat tidak berpengaruh terhadap peningkatan produksi bioetanol melainkan untuk peningkatan biomassa sel C. tropicalis (Lampiran 3 dan 5). Hal tersebut ditunjukkan oleh nilai OD, gula pereduksi, dan kadar bioetanol yang dihasilkan pada jam ke-72 berturut-turut sebesar , %, dan 0.063%. Rendemen bioetanol yang dihasilkan sebesar 0.196% dan rendemen

22 10 teoritisnya sebesar 0.386% (Tabel 2). Produksi bioetanol tertinggi pada media produksi dengan penambahan ko-substrat ditunjukkan pada jam ke-24 sebesar 0.146% dan gula pereduksi terendah sebesar % , ,30 OD gula pereduksi (%) 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 bioetanol (%) 0 0 0, ,05 waktu (jam) Gambar 5 Hasil produksi bioetanol dengan penambahan ko-substrat. OD, gula pereduksi (%), bioetanol (%). Tabel 2 Rendemen bioetanol dengan penambahan ko-substrat perlakuan adaptasi dan detoksifikasi Waktu (jam) Rendemen bioetanol (%) Rendemen bioetanol teoritis (%) Candida tropicalis setelah peremajaan Pembahasan Sel khamir C. tropicalis diremajakan pada media YM. Peremajaan bertujuan untuk mempertahankan kondisi optimum fisiologis mikroba. Media YM yang digunakan untuk peremajaan C. tropicalis merupakan salah satu media yang spesifik untuk pertumbuhan khamir. Media ini mengandung glukosa yang berfungsi sebagai sumber karbon. Selain itu, media YM mengandung ekstrak khamir, ekstrak malt, dan pepton yang berfungsi sebagai sumber nitrogen. Pepton mampu menyediakan nutrien esensial untuk metabolisme bakteri (Fathir 2009). Media YMA dibuat dalam dua tempat yaitu tabung reaksi dan cawan Petri. YMA dalam tabung reaksi digunakan untuk peremajaan C. tropicalis dan

23 berfungsi juga sebagai kultur stok. Sel khamir C. tropicalis pada YMA dalam tabung reaksi menggunakan teknik menggores zig-zag. Teknik ini bertujuan untuk menumbuhkan mikroba secara merata. Sedangkan YMA pada cawan Petri menggunakan teknik gores kuadran untuk memperoleh koloni tunggal. Sel khamir C. tropicalis yang diremajakan pada YMA diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 48 jam. Sel khamir C. tropicalis yang sudah tumbuh pada media YMA kemudian disimpan pada suhu 4 0 C untuk memperlambat pertumbuhannya. Hasil permajaan C. tropicalis pada media YMA disajikan pada (Gambar 1). Faktor pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh faktor intraseluler yang terdiri dari struktur, mekanisme, metabolisme, dan genetika serta faktor ekstraseluler seperti ph, suhu, dan tekanan (Hidayat 2006). Setelah dari media YMA, C. tropicalis dipindahkan ke dalam media inokulum. Media inokulum berfungsi untuk mengaktivasi sel-sel C. tropicalis. Media ini terdiri dari ekstrak khamir, pepton, dan amonium sulfat yang berfungsi sebagai sumber nitrogen. Selain itu, terdapat pula glukosa sebagai sumber karbon. Sedangkan sumber mineral dari media inokulum diperoleh dari MgSO 4.7H 2 O, KH 2 PO 4, dan K 2 HPO 4. Kondisi fisiologis dan konsentrasi inokulum berpengaruh terhadap lamanya fase lag (Saarela et al. 2003). Hidrolisat ampas tebu setelah perlakuan detoksifikasi Hidrolisat ampas tebu yang digunakan pada penelitian ini memiliki kadar zat terlarut sebesar 32% dan gula reduksi 6.92%. Teknik hidrolisis yang dilakukan pada penelitian sebelumnya adalah dengan penambahan H 2 SO 4 1%. Hasil samping hidrolisis asam adalah terbentuknya asam asetat, furfural, dan senyawa turunan lignin, dimana ketiga senyawa ini merupakan inhibitor saat proses fermentasi (Martin et al. 2010). Menurut Nigam (2001) konsentrasi furfural diatas 1.5 g/l dalam media fermentasi mampu menurunkan produktifitas etanol selama fermentasi. Oleh karena itu, detoksifikasi perlu dilakukan pada hidrolisat ampas tebu. Metode detoksifikasi bertujuan meningkatkan kemampuan fermentasi dengan mengkonversi derivatif furan menjadi senyawa lain dan mengurangi senyawa-senyawa bersifat toksik (Purwadi 2006). Detoksifikasi yang dilakukan pada penelitian ini terdiri dari proses overliming, adsorpsi, dan netralisasi. Penelitian ini menggunakan Ca(OH) 2 untuk overliming, arang aktif untuk adsorpsi, dan NaOH untuk netralisasi. Hidrolisat ampas tebu sebelum diberi perlakuan detoksifikasi berwarna coklat dengan nilai ph 0.7 (Gambar 2a). Hal ini disebabkan oleh proses hidrolisis menggunakan H 2 SO 4 1% pada suhu C selama 15 menit. Ciri-ciri reaksi browning non enzimatis ditandai dengan terlihatnya efek pencoklatan pada warna sampel karena proses pemanasan pada suhu konstan (Lievonen et al. 2002). Tahap awal detoksifikasi hidrolisat ampas tebu adalah penambahan Ca(OH) 2 atau overliming. Overliming bertujuan untuk menurunkan konsentrasi senyawa inhibitor seperti HMF, furfural, dan asam organik. Hidrolisat ampas tebu mengalami perubahan warna dari coklat dengan ph 0.7 menjadi kuning dengan ph 2 setelah penambahan Ca(OH) 2 (Gambar 2b). Reaksi yang terjadi pada proses penambahan Ca(OH) 2 adalah pembentukan garam-garam dari reaksi asam basa antara H 2 SO 4 dengan Ca(OH) 2 yang ditambahkan. Selain itu, sebagian ion-ion Ca 2+ bereaksi dengan gula-gula, HMF, dan furfural menjadi senyawa yang 11

24 12 mempunyai ikatan irreversibel (Purwadi 2006). Reaksi-reaksi pada proses penambahan Ca(OH) 2 ditunjukkan pada Gambar 6. H 2 SO 4 + Ca(OH) 2 CaSO 4 + 2H 2 O C 6 H 12 O 6 + Ca 2+ [C 6 H 12 O 6 Ca] + C 6 H 6 O 3 + Ca 2+ [C 6 H 6 O 3 Ca] + C 5 H 4 O 2 + Ca 2+ [C 5 H 4 O 2 Ca] + Gambar 6 Reaksi detoksifikasi dengan penambahan Ca(OH) 2 (Purwadi 2006) Tahap detoksifikasi selanjutnya adalah penambahan 2% arang aktif ke setelah mengalami penggerusan dalam media hidrolisat ampas tebu. Penggerusan arang aktif bertujuan untuk memaksimalkan penjerapan senyawa inhibitor. Menurut Sembiring (2003) menyatakan bahwa arang aktif perlu kesetimbangan untuk bersinggungan dengan sampel, penggerusan dan pengadukan mempercepat persinggungan arang aktif dengan sampel. Mekanisme penjerapan arang aktif yakni molekul adsorbat berdifusi melalui suatu lapisan batas ke permukaan luar, sebagian berdifusi lanjut di dalam pori-pori adsorben, atau dikenal dengan difusi internal. Proses adsorpsi arang aktif terjadi melalui tiga tahap dasar, yaitu zat terjerap pada bagian luar, zat bergerak menuju pori-pori arang aktif dan zat terjerap ke bagian dinding dalam dari arang aktif (Juara 2011). Tahap detoksifikasi setelah penambahan arang aktif adalah penambahan NaOH. Penelitian ini menggunakan NaOH untuk memperoleh ph optimum bagi pertumbuhan C. tropicalis. Kinerja C. tropicalis dipengaruhi oleh ph awal media. Selain itu, ph optimum berperan penting terhadap aktifitas membran plasma mengangkut protein, kinerja enzim, proses pertumbuhan, dan metabolisme (Narendranath et al. 2001). ph optimum mikroba tergantung pada suhu, ketersediaan oksigen, dan galur (Neelakantam 2005). ph optimum C. tropicalis adalah ph 5 (Samsuri et al. 2007). Setelah penambahan NaOH 10M, hidrolisat ampas tebu mengalamai perubahan warna dari kuning dengan ph 2 menjadi abuabu dengan ph 5 (Gambar 2c). Selain itu, dibuat pula hidrolisat ampas tebu dengan penambahan NaOH 10M yang menunjukkan perubahan warna hidrolisat ampas tebu dari coklat menjadi hitam dengan ph 5 (Gambar 2d). Hal tersebut disebabkan oleh pengendapan senyawa-senyawa toksik oleh NaOH. Reaksi-reaksi pengendapan senyawa-senyawa toksik oleh NaOH ditunjukkan pada Gambar 7. 1 CH 3 COOH + NaOH CH 3 COONa + H 2 O 2 C 5 H 4 O 2 + O 2 C 5 H 4 OCOOH 2 C 5 H 4 OCOOH + NaOH C 5 H 4 COONa +H 2 O 1 H 2 SO 4 + 2NaOH Na 2 SO 4 + 2H 2 O Gambar 7 Reaksi-reaksi pengendapan senyawa-senyawa toksik oleh NaOH ( 1 Sitorus et al dan 2 Sugiarta et al. 2009) Adaptasi Candida tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu Hidrolisat ampas tebu setelah detoksifikasi digunakan sebagai substrat pada media adaptasi bagi C. tropicalis. Adaptasi bertujuan untuk meningkatkan

25 pertumbuhan C. tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu. Adaptasi dilakukan selama 20 siklus (960 jam). Penentuan siklus adaptasi mengacu pada penelitian sebelumnya (Rao et al. 2006). Hasil adaptasi C. tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu disajikan pada (Gambar 3). Hidrolisat ampas tebu yang digunakan pada penelitian ini adalah hidrolisat ampas tebu detoksifikasi dan non detoksifikasi. Berdasarkan hasil yang diperoleh, adaptasi optimum C. tropicalis pada siklus ke-5. Hal ini ditunjukkan dengan meningkatnya nilai OD dari siklus ke-0 sampai siklus ke-5 dan melambat pada siklus berikutnya baik pada hidrolisat ampas tebu detoksifikasi ataupun non detoksifikasi. Nilai OD yang diperoleh menunjukkan banyaknya sel C. tropicalis di dalam media adaptasi. Hal ini berarti C. tropicalis sudah beradaptasi dengan baik pada hidrolisat ampas tebu di siklus ke-5. Peneliti sebelumnya menyatakan bahwa adaptasi mampu mempercepat fase lag dan meningkatkan kinerja mikroba untuk memproduksi metabolit primer dan metabolit sekunder (Huang et al. 2009). Penentuan gula pereduksi bertujuan untuk mengetahui konsentrasi gula pereduksi yang dikonsumsi oleh C. tropicalis pada media adaptasi. Berdasarkan hasil yang diperoleh, penurunan drastis gula pereduksi pada hidrolisat ampas tebu detoksifikasi terjadi pada siklus ke-0 sampai ke-5 dan melambat pada siklus berikutnya. Adapun media adaptasi dengan hidrolisat ampas tebu non detoksifikasi menunjukkan penurunan gula pereduksi pada siklu ke-1 sampai siklus ke-5 dan melambat pada siklus berikutnya. Penurunan gula pereduksi menunjukkan adanya aktivitas C. tropicalis dalam mengkonsumsi gula pada media adaptasi untuk pertumbuhan biomassa selnya. Adaptasi C. tropicalis selama 20 siklus pada media hidrolisat ampas tebu dan tongkol jagung mampu meningkatkan biomassa sel dan produksi xilitol (Rao et al. 2006). Produksi bioetanol Proses produksi bioetanol adalah tahap akhir dari penelitian. Tahap akhir dari fermentasi atau produksi bioetanol adalah konversi piruvat ke produk fermentasi akhir. Menurut (Maharani 2011) menyatakan bahwa tahap ini tidak menghasilkan energi melainkan NAD + yang penting bagi sel anaerobik dalam proses glikolisis. Reaksi yang terjadi ditunjukkan pada Gambar 8. Secara singkat, reaksi fermentasi etanol merupakan proses konversi gula sederhana menjadi etanol. Menurut (Saarela et al. 2003) menyatakan bahwa reaksi fermentasi glukosa menjadi etanol oleh mikroba ditunjukkan pada Gambar 9. glikolisis 1.) Glukosa asam piruvat + ATP 2.) Dekarboksilasi asam piruvat Piruvat dekarboksilase Asam piruvat asetaldehid + CO 2 3.) Asetaldehid oleh alkohol dehidrogenase menjadi etanol alkoholdehidrogenase Asetaldehid + 2 NADH 2 2 etanol + 2 NAD Gambar 8 Tahap akhir fermentasi etanol (Maharani 2011) 13

26 14 C 6 H 12 O 6 + mikroba 2 C 2 H 5 OH + 2CO ATP + 5 KKal Gambar 9 Reaksi fermentasi etanol oleh mikroba (Saarela et al. 2003) Penelitian ini menggunakan hidrolisat ampas tebu sebagai sumber karbon. Hasil adaptasi sel-sel C. tropicalis pada substrat hidrolisat ampas tebu detoksifikasi dan non detoksifikasi digunakan untuk produksi bioetanol. Hasil produksi bioetanol dengan tiga perlakuan ditunjukkan pada Gambar 4. Berdasarkan hasil yang diperoleh, pola pertumbuhan, produksi bioetanol, dan gula pereduksi pada ketiga perlakuan mempunyai pola yang mirip satu sama lain. Pola pertumbuhan menunjukkan banyaknya sel-sel C. tropicalis di dalam media hidrolisat ampas tebu. Pola pertumbuhan mikroba terdiri atas empat fase yaitu fase lag (adaptasi), fase log (eksponensial), fase stasioner, dan fase kematian. Fase lag merupakan fase saat mikroba menyesuaikan diri dengan lingkungan dan medium baru. Fase log merupakan fase perkembanganbiakkan yang sangat cepat karena mikroba sudah dapat menggunakan nutrisi pada medium. Fase stasioner menunjukkan laju pertumbuhan tetap dimana jumlah mikroba yang mati semakin meningkat karena nutrisi berkurang dan terbentuknya senyawa toksik. Fase kematian menunjukkan berhentinya pertumbuhan karena meningkatnya jumlah mikroba yang mati (Tortora et al. 2006). Pola pertumbuhan C. tropicalis menunjukkan fase lag di jam ke-0 sampai jam ke-24 pada perlakuan non adaptasi dan detoksifikasi, sedangkan pada dua perlakuan lainnya tidak terdapat fase lag. C. tropicalis telah diadaptasi terlebih dahulu selama 5 siklus pada kedua perlakuan tersebut. Fase log ditunjukkan pada jam ke-0 sampai jam ke-72 pada perlakuan adaptasi dan detoksifikasi serta perlakuan adaptasi dan non detoksifikasi, sedangkan pada perlakuan non adaptasi dan detoksifikasi terjadi pada jam ke-24 sampai jam ke-72. Fase lag menunjukkan pertumbuhan biomassa sel C. tropicalis yang sangat cepat karena sudah mampu mengkonsumsi nutrisi dalam medium. Fase stasioner ditunjukkan pada jam ke-72 sampai jam ke-96 pada ketiga perlakuan. Fase stasioner menunjukkan pertumbuhan biomassa sel C. tropicalis yang tetap karena nutrisi di dalam medium mulai berkurang. Fase kematian tidak ditunjukkan pada pola pertumbuhan C. tropicalis untuk ketiga perlakuan karena anlisis hanya dilakukan hingga jam ke-96. Pola pertumbuhan C. tropicalis dapat dijadikan pembanding bagi pola produksi bioetanolnya. C. tropicalis mempunyai pola produksi bioetanol yang sama untuk ketiga perlakuan. Produksi bioetanol meningkat tajam pada jam ke-0 sampai jam ke-24 dan mulai melambat pada jam ke-24 sampai jam ke-72. Hal ini berarti C. tropicalis sudah mampu mengkonversi gula pada media hidrolisat ampas tebu menjadi bioetanol selama 24 jam atau pada fase log untuk perlakuan adaptasi dan detoksifikasi serta perlakuan adaptasi dan non detoksifikasi dan fase lag pada perlakuan non adaptasi dan detoksifikasi. Gula yang terkandung dalam hidrolisat ampas tebu terdiri atas 56% xilosa, 15% glukosa, dan 24% arabinosa (Rao et al. 2006). Konversi gula tersebut menjadi bioetanol melalui lintasan pentosa fosfat, lintasan heksosa monofosfat, reaksi non oksidatif, glikolisis, dan fermentasi anaerob. Xilosa dan arabinosa pada lintasan pentosa fosfat akan dikonversi menjadi xilulosa-5-p dan ribosa-5-p untuk masuk ke dalam lintasan heksosa monofosfat. Lintasan heksosa monofosfat non oksidatif akan mengkonversi

27 xilulosa-5-p dan ribosa-5-p menjadi gliseraldehid-3-p dan fruktosa-6-p untuk masuk ke glikolisis. Glikolisis akan mengkonversi gliseraldehid-3-p dan fruktosa- 6-P menjadi piruvat. Piruvat akan dikonversi menjadi etanol dan CO 2 pada kondisi anaerobik, sedangkan pada kondisi aerobik akan masuk ke rantai respirasi (Parajo et al. 1998). Produksi bioetanol dapat dihubungkan dengan penurunan gula pereduksi. Gula pereduksi merupakan gula yang mempunyai gugus aldosa atau ketosa bebas sehingga dapat dioksidasi menjadi gugus karboksil oleh asam3,5-dinitrosalisilat pada suasana basa dengan suhu C. Reaksi gula pereduksi dengan asam 3,5-dinitrosalisilat ditunjukkan pada Gambar O O - O N + O HO OH HO HO OH HO - O N + O - O N + OH OH O HO O + HO OH O HO OH + H 2 N OH 3,5-as. dinitrosalisilat glukosa as. glukonat 3-amino, 5-as. nitrosalisilat Gambar 10 Reaksi gula pereduksi dengan DNS Pola penurunan gula pereduksi yang diperoleh dari ketiga perlakuan berbeda-beda. Konsentrasi gula pereduksi mengalami penurunan selama waktu inkubasi dan menunjukkan pola yang fluktuatif. Penurunan yang terjadi disebabkan oleh aktivitas C. tropicalis yang mengkonsumsi gula tersebut di dalam media hidrolisat ampas tebu. Gula tersebut digunakan untuk pertumbuhan biomassa sel C. tropicalis dan produksi bioetanol. Hal tersebut menunjukkan bahwa proses metabolisme yang terjadi pada C. tropicalis adalah metabolisme primer dan metabolisme sekunder (Voet and Voet 2009). Produksi bioetanol tertinggi diperoleh pada perlakuan adaptasi dan non detoksifikasi, namun rendemen terbesar diperoleh dari perlakuan adaptasi dan detoksifikasi, sedangkan perlakuan non adaptasi dan detoksifikasi menghasilkan bioetanol dan rendemen terendah. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa adaptasi mampu meningkatkan produksi bioetanol. Adapun media terbaik untuk produksi bioetanol adalah perlakuan adaptasi dan detoksifikasi. Menurut (Gayang 2013) menyatakan bahwa proses detoksifikasi hidrolisat tandan kosong kelapa sawit dengan arang aktif 5% selama 30 menit menurunkan konsentrasi gula pereduksi sebesar 25.95%. Selain itu, menurut (Maharani 2011) menyatakan bahwa produksi bioetanol dari hidrolisat asam ubi kayu oleh S. cerevisiae perlakuan adaptasi lebih tinggi dari pada non adaptasi dengan perbedaan rendemen sebesar 30.78%. Rendemen bioetanol meningkat 0.44 g/g atau 87% dengan perlakuan adaptasi, overliming, dan netralisasi (Huang et al. 2009). Produksi bioetanol dengan penambahan ko-substrat Rendemen tertinggi yang diperoleh dari perlakuan adaptasi dan detoksifikasi dipilih untuk tahapan selanjutnya yaitu penambahan ko-substrat OH

28 16 berupa glukosa pada media produksi bioetanol. Produksi dan rendemen bioetanol dengan penambahan ko-substrat ditunjukkan pada Gambar 5 dan Tabel 2. Kurva pertumbuhan C. tropicalis perlakuan adaptasi dan detoksifikasi dengan penambahan 3% glukosa (Gambar 5) mempunyai pola pertumbuhan yang berbeda dengan pola pertumbuhan mikroba pada umumnya. Kurva pertumbuhan tidak menunjukan adanya fase adaptasi. Hal ini dikarenakan C. tropicalis sudah diadaptasi terlebih dahulu selama 5 siklus di media adaptasi. Fase eksponensial ditunjukan dari jam ke-0 sampai jam ke-48, melambat pada jam ke-48 sampai jam ke-72 dan meningkat kembali pada jam ke-72 sampai jam ke-120. Hal ini dikarenakan pada media terdapat sumber karbon tambahan berupa glukosa sehingga terdapat pola eksponensial dua kali. Fase stasioner tidak ditunjukan pada pola pertumbuhan ini. Hal ini dikarenakan C. tropicalis masih aktif membelah dengan adanya dua sumber karbon di dalam media produksi. Pola pertumbuhan ini berbeda dengan pola produksi bioetanol dan pola penurunan gula pereduksi. Pola pertumbuhan menunjukkan jumlah biomassa sel C. tropicalis lebih besar dari pada biomassa sel yang diperoleh pada media tanpa penambahan 3% glukosa, produksi bioetanol yang diperoleh lebih rendah, dan konsentrasi gula pereduksi yang diperoleh cenderung stabil. Hal ini dikarenakan gula berkarbon 5 (lima) dan berkarbon 6 (enam) pada hidrolisat ampas tebu dan ko-substrat glukosa 3% digunakan untuk pembentukan biomassa selnya melalui lintasan heksosa mono fosfat dan regenerasi NADPH hasil dari siklus oksidatif (Parajo et al. 1998). Hal ini diindikasikan bahwa saat kondisi aerobik oksigen digunakan sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik untuk penambahan biomassa sel (Maharani 2011). Reaksi pembentukan biomassa sel ditunjukkan pada Gambar 11. Biomassa sel + C 6 H 12 O 6 CO 2 + H 2 O + Biomassa sel Gambar 11 Reaksi pembentukan biomassa sel (Maharani 2011) Berdasarkan hasil yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa penambahan 3% glukosa sebagai ko-substrat tidak berpengaruh terhadap produksi bioetanol oleh C. tropicalis. Hal ini dikarenakan terjadinya mekanisme pengaturan represi katabolik. Represi katabolik adalah kemampuan intermediet di dalam rangkaian reaksi katabolik yang dikatalisis enzim untuk merepresi sintesis enzim katabolik (Murray et al. 2004). Konsentrasi glukosa pada hidrolisat sebesar 0.543% dan kosubstrat glukosa 3% diduga menjadi represor katabolik bagi sintesis enzim yang berhubungan dengan penguraian sumber karbon pada hidrolisat ampas tebu untuk pembentukan bioetanol. Menurut (Parajo et al. 1998) menyatakan bahwa glukosa mampu menghasilkan NADPH melalui enzim glukosa-6-fosfat dehidrogenase dan 6-fosfoglukonat dehidrogenase dalam lintasan pentosa fosfat serta melalui isositrat dehidrogenase dalam siklus asam sitrat untuk menghasilkan energi bagi pertumbuhan sel khamir dan memproduksi etanol. Peneliti lain menyatakan bahwa penambahan ko-substrat berupa glukosa optimum pada konsentrasi 12 g/l menghasilkan xilitol sebesar 4.81 g/l, sedangkan xilitol sebesar 7.49 g/l diperoleh pada media tanpa penambahan ko-substrat (Puspita 2010). Penambahan konsentrasi glukosa sebesar 0.01%-0.02% tidak berpengaruh terhadap proses degradasi fenol, sedangkan penambahan konsentrasi glukosa sebesar 0.05%-0.1% menurunkan proses degradasi fenol. Penurunan degradasi fenol diduga akibat

29 NADH NAD + H 2 O O 2 adanya represi katabolit oleh glukosa terhadap pembentukan enzim yang diperlukan dalam proses degradasi fenol (Nursaadah et al. 2000). Menurut (Sanhez et al. 2004) penambahan ko-substrat pada konsentrasi tertentu dapat berperan sebagai inhibitor bagi pembentukan etanol. Mekanisme konversi pentosa dan heksosa menjadi bioetanol oleh khamir ditunjukkan pada (Gambar 12). 17 Xilosa xilitol NAD[P]H NAD[P] + NAD + NADH Xilulosa ATP ADP Glukosa ATP ADP Glukosa-6P Xilulosa-5P Lintasan heksosa monofosfat Non-oksidatif (konversi pentosa fosfat menjadi triosa dan heksosa fosfat) Oksidatif (regenerasi NADPH) Gliseraldehida-3P Fruktosa-6P Biomassa Glikolisis Etanol + CO 2 Piruvat Rantai respirasi Gambar 12 Metabolisme pentosa dan heksosa menjadi etanol (Parajo et al.1998)

30 18 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Produksi bioetanol terbaik diperoleh pada perlakuan adaptasi dan detoksifikasi pada jam ke-72 tanpa penambahan ko-substrat dengan kadar bioetanol sebesar 0.427%, rendemen bioetanol sebesar 2.509%, dan rendemen teoritis sebesar 4.921%. Penambahan 3% glukosa sebagai ko-substrat tidak meningkatkan produksi bioetanol, tetapi berperan untuk meningkatkan biomassa sel. Saran Penelitian lanjutan dengan cara variasi konsentrasi ko-substrat perlu dilakukan untuk mengetahui produksi bioetanol optimum. Selain itu, penelitian dengan teknik amobilisasi sel C. tropicalis perlu dilakukan untuk mengetahui produksi bioetanol dengan sel bebas dan sel amobil C. tropicalis. DAFTAR PUSTAKA Ambarsari et al Pengembangan biolistrik dan bioetanol dari bahan baku ampas tebu [Laporan penelitian]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Prospek dan Arah Pengembangan Agribisnis Tebu Edisi 2. Indonesia. Departemen Pertanian. Dien BS. Nicholas NN PJ, Bothast, dan RJ Deveopment of new ethanologenic Eschericia coli strains for fermentation of lignocellulosic biomass [Jurnal]. Appl. Biochem. Biotechnol. 84: Fathir Fuad Media pertumbuhan mikroba. [terhubung berkala]. [10 Juni 2014]. Gayang, Faisal Konversi lignoselulosa tandan kosong kelapa sawit menjadi gula pereduksi menggunakan enzim xilanase dan selulase komersial [Skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Hidayat N, Padga MC, Suhartini S Mikrobiologi Industri. Yogyakarta: Penerbit ANDI. Huang CF, Lin TH, Guo GL, and Hwang WS Enhanced ethanol production by fermentation of rice straw hydrolysate without detoxification using a newly adapted strain of Pichia stipitis [Jurnal]. Bioresource Technology. 100: Jamai L, Sendi K, Ettayebi K, Errachidi F, Alami OH, Jouti MAT, Dermoti TM, and Ettayebi M Physiological difference during ethanol fermentation

31 between calcium alginate-immobilized Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae [Jurnal]. FEMS Microbiology Letters. 204: Juara, Saud Richy Detoksifikasi hidrolisat asam dari ubi kayu dengan metode arang aktif untuk produksi bioetanol [Tesis]. Bogor. Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Klinke et al Characterization of degradation products from alkaline wet oxidation of wheat straw [Jurnal]. Bioresource technology. 82(1): Letti LAJ, Karp SG, Woiciechowski AL, and Soccol CR Ethanol production from soybean molasses by Zymomonas mobilis [Jurnal]. Biomass and bioenergy. 44: Liovenen SM, Laoksonen TJ, Ross YH Non enzymatic browning in the vicinity of glass transition: Effects of fructose, glucose, and xylose are reducing sugar [Jurnal]. Agriculture and Food Chemistry. 50: Maharani, Dessy Maulidya Adaptasi Saccharomyces cerevisiae terhadap hidrolisat asam ubi kayu untuk produksi bioetanol [Tesis]. Bogor. Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Mancilha IM and Karim MN Evaluation of ion exchange resins for removal of inhibitory compound from corn stover hydrolysate for xylitol fermentatio [Jurnal]. Biotechnol Prog. 19: Martin C and Jonsson LJ Comparison of the resisteance of industrial and laboratory strains of Saccharomyces and Zygosaccharomyces to lignocellulosic-derived fermentation inhibitors [Jurnal]. Enzyme Microbial Technol. 32: Martin, JFG, M. Cueves, V. Bravo, and S. Sanchez Ethanol production from olive prunings by autohydrolusis and fermentation with Candida tropicalis [Jurnal]. Renewable Energy, vol. 35. P Miller, GL Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar [Jurnal]. Anal Chem 31 (3): Murray RK, Daryl KG, Peter AM, and Victor WR Biokimia Harper. Edisi ke-25. Hartono A, penerjemah. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Harper s Biochemistry. Narendranath NV, Thomas KC, and Ingledev WM Effects of acetic acid and lactic acid on the growth of Saccharomyces cerevisiae in a minimal medium [Jurnal]. Industrial Microbiology and Biotechnology. 26: Neelakantam V, Narendranath, and Ronan Power Relationship between ph and medium dissolved solids in terms of growth and metabolism of Lactobacilli and Saccharomyces cerevisiae during ethanol production [Jurnal]. Appl. Environ. Microbiol. 71: Nigam JN Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis [Jurnal]. J Biotechnol. 87:

32 20 Nursaadah, Santosa DA, dan Suhartono MT Karakterisasi bakteri pendegradasi fenol asal Danau Buntal Kalimantan Tengah [Jurnal]. Ilmu Tanah dan Lingkungan. Vol 3. No. 2: Pandey A, Soccol CR, Nigam P, and Soccol VT Biotecnological potential of agro-industrial residues sugarcane bagasse [Jurna]. Bioresour and Technol. 74: Parajo JC, Dominguez H, and Dominguez JM Biotechnological production of xylitol. Part 3: Operation in culture media fom lignocelluloses hydrolisates [Jurnal]. Biosourc Technol, 66: Purwadi R Continue ethanol production from diluted-acid hidrolizates, detoxification and fermentation strategy [Thesis of Doctoral]. Goteborg; Chemical and Biological Engineering. Chamers University of Technology. Puspita, Puspa Julistia Optimasi konsentrasi xilosa dan glukosa untuk produksi xilitol oleh Candida tropicalis [Skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Rao RS, Jyothi ChP, Praksham RS, Sarma PN, and Rao LV Xylitol production from corn fiber and sugarcane bagasse hydrolysates by Candida tropicalis [Jurnal]. Bioresources Technology, 97: Rivas B, Torre P, Domfinguez JM, Perego P, Converti A, and Parajo PC Carbon material and bioenergestic balances for xylitol production from corncob by Debaryomyces hansenii [Jurnal]. Biotechnol Prog. 19: Saarela U, Leiviska K, and Juso E Modelling of fed batch fermentation process. Oulu: University of Oulu. Samsuri M, Gozan M, Mardias R, Baiquni M, Hermansyah H, Wijanarko, Prasetyo B, dan Nasikin M Pemanfaatan selulosa bagas untuk produksi ethanol melalui sakarifikasi dan fermentasi serentak dengan enzim xylanase [Jurnal]. Makara.Vol 11. No 1: Sanchez S, V Bravo, AJ Moya, E Castro, and F Camacho Influence of temperature on fermentation of D-xylose by Pachysolen tannophilus to produce ethanol and xylitol [Jurnal]. Process Biochemistry. 39: Sembiring MT dan Sinaga TS Arang aktif (pengenalan dan proses pembuatannya). Sumatra Utara: Fakultas Teknik, Universitas Sumatra Utara. Sitorus, DA, Eko AA, Dewi AI, dan Diah TA Kajian awal pemanfaatan hidrolisat gula hasil hidrolisis furfural dari bagas untuk produksi etanol dengan Escherichia coli dan Klebsiella oxytoca. Prosiding Seminar Nasional Teknik Kimia ISBN :19. Sugiarta, DK Perancangan pabrik furfural dari sekam padi dengan proses quakert outs kapasitas ton per tahun [Skripsi]. Surakarta: Fakultas Teknik Universitas Muhammadiyah Surakarta. Tortora GJ, Funke BR, and Case CL Microbiology: an Introduction 9 th ed. San Fransisco: Pearson Education.

33 Voet Ester van der, Lou L, Huppes G, and Hean HA Allocation issue in LCA methodology: a case study of corn stover-based fuel ethanol [Jurnal] Life Cycle Assessment. 14: Yuwono, Trimoteus et al Fermentasi hidrolisat enzimatik bagasse tebu menjadi hidrogen. [Jurnal]. Teknik promits. Vol 1. No 1:

34 22 Lampiran 1 Diagram alir penelitian Peremajaan kultur pada media YMA Penumbuhan Candida tropicalis pada media inokulum Variasi media adaptasi dan detoksifikasi Analisis OD λ 600 nm dan kadar gula pereduksi λ 550 nm Media detoksifikasi dan non adaptasi Media non detoksifikasi dan adaptasi Media detoksifikasi dan adaptasi Media adaptasi dan detoksifikasi terbaik Media produksi ditambah sumber N Pengukuran kadar bioetanol dan glukosa dengan HPLC, serta gula pereduksi dengan metode DNS

35 Lampiran 2 Kurva pertumbuhan Candida tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu Perlakuan Absorbansi (jam ke-) Absorbansi riil (jam ke-) Adaptasi & detoksifikasi Adaptasi & nondetoksifikasi Nonadaptasi & detoksifikasi Lampiran 3 Kurva pertumbuhan C. tropicalis pada media hidrolisat ampas tebu +3% glukosa Waktu Absorbansi Absorbansi riil Rerata St dev (jam) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 1 Ulangan Lampiran 4 Hasil produksi bioetanol oleh C. tropicalis Perlakuan Waktu (jam) Etanol (%) Glukosa (%) Gula reduksi (%) Adaptasi dan detoksifikasi Adaptasi dan nondetoksifikasi Nonadaptasi dan detoksifikasi Lampiran 5 Hasil produksi bioetanol oleh C. tropicalis pada media +3% glukosa Waktu (jam) Etanol (%) Total gula reduksi (%) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 1 Ulangan

36 24 Lampiran 6 Rendemen bioetanol perlakuan adaptasi dan detoksifikasi, adaptasi dan non detoksifikasi, serta non adaptasi dan detoksifikasi Perlakuan Waktu (jam) Etanol (%) Gula reduksi (%) Adaptasi dan detoksifikasi Adaptasi dan nondetoksifikasi Nonadaptasi dan detoksifikasi Rendemen (%) Rendemen teoritis (%) Lampiran 7 Rendemen bioetanol pada media +3% glukosa Komponen ulangan Waktu (jam ke-) Etanol (%) Gula reduksi (%) Rendemen (%) Rendemen teoritis (%) Lampiran 8 Absorbansi dan gula reduksi pada media adaptasi Siklus Absorbansi Absorbansi riil Gula reduksi (%) detoks Non detoks detoks Non detoks detoks Non detoks

37 absorbansi [gula] [etanol] 25 Lampiran 9 Kurva standar etanol 1,2 1 0,8 y = 2E-06x - 0,0005 R² = 0,9997 0,6 0,4 0, area Lampiran 10 Kurva standar glukosa y = 7E-07x - 0,0022 R² = 0, area Lampiran 11 Kurva standar glukosa analsis gula pereduksi y = 15,337x - 0,5031 R² = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 [glukosa] (g/ml)

38 Etanol/14.010/ Etanol/14.007/ Lampiran 12 Dokumentasi analisis gula reduksi Lampiran 13 peak HPLC Standar etanol 1% mv Detector A min Standar etanol 0.8% mv Detector A min