AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI NONPOLAR, SEMIPOLAR, DAN POLAR EKSTRAK ETANOL DAUN BUNI

Transkripsi

1 AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI NONPOLAR, SEMIPOLAR, DAN POLAR EKSTRAK ETANOL DAUN BUNI (Antidesma bunius (L.) Spreng) TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus DAN Bacillus subtilis SERTA BIOAUTOGRAFINYA NASKAH PUBLIKASI Oleh : Oleh : ASITA K FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA SURAKARTA

2 1

3 AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI NONPOLAR, SEMIPOLAR, DAN POLAR EKSTRAK ETANOL DAUN BUNI (Antidesma bunius (L.) Spreng) TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus DAN Bacillus subtilis SERTA BIOAUTOGRAFINYA ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF FRACTIONS OF NONPOLAR, SEMIPOLAR AND POLAR ETHANOL EXTRACT BUNI OF LEAVES (ANTIDESMA BUNIUS (L). SPRENG) AGAINST Staphylococcus aureus AND Bacillus subtilis BACTERIA AND BIOAUTOGRAPHY Asita*, Haryoto, Andi Suhendi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Jl. Ahmad Yani, Tromol Pos I, Pabelan Kartasura Surakarta * ABSTRAK Daun buni (Antidesma bunius (L). Spreng) menurut masyarakat terbukti mampu mengobati sifilis. Infeksi terbesar disebabkan oleh bakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni (Antidesma bunius (L). Spreng) terhadap bakteri Staphyloccus aureus dan Bacillus subtilis. Ekstrak difraksinasi menggunakan metode kromatografi cair vakum dengan fase diam silika G 60 dan fase gerak gradien menggunakan gradien kepolaran bertingkat perbandingan kloform:heksan (6:4, 7:3, 8:2, 9:1), kloroform:etil asetat (8:2) dan metanol. Hasil fraksinasi yaitu fraksi nonpolar, semipolar, dan polar kemudian diuji antibakteri dengan metode difusi sumuran. Fraksi-fraksi ekstrak dilarutkan dalam DMSO yang dibuat 5 seri konsentrasi 1; 2; 3; 4; dan 5mg/sumuran, volume sampel uji yang digunakan yaitu 20 µl dimasukkan ke dalam sumuran dengan kontrol negatif DMSO 2,5% dan kontrol positif Streptomisin 0,25%. Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni terhadap bakteri Staphyloccus aureus dan Bacillus subtilis tidak poten karena tidak ditemukan zona hambat disekitar sumuran. Kata kunci : Fraksi nonpolar, semipolar, polar, Antidesma bunius, Antibakteri ABSTRACT Buni leaves (Antidesma bunius ( L ).Spreng ) according to the community proved to treat syphilis. Biggest infection caused by bacteria. This study was aimed to determine the antibacterial activity of fractions of nonpolar, semipolar and polar ethanol extract of Buni leaves (Antidesma bunius (L).Spreng) against Staphylococcus aureus bacteria and Bacillus subtilis. The extract was fractionated using vacuum liquid chromatography method with G 60 silica stationary phase and mobile phase gradient using a polarity gradient multilevel comparison chloroform:hexane (6:4, 7:3, 8:2, 9:1), chloroform:etil acetic (8:2) - methanol. The results of fractionation is the fraction of nonpolar, semipolar, and 1

4 polar tested the antibacterial with well diffusion method. Fractions of the extract dissolved in DMSO concentration made 5 series 1, 2, 3, 4, and 5mg/well, volume of test sample used is 20 ml inserted into the wells with 2.5 % DMSO negative control and positive control Streptomycin 0,25 %. The results of antibacterial activity test nonpolar fraction, semipolar and polar ethanol leaf extract against the bacteria Staphylococcus aureus buni and Bacillus subtilis is not potent because it was not found inhibition zones around the wells. Keywords: Fraction nonpolar, semipolar, polar, Antidesma bunius, antibacterial. PENDAHULUAN Mikroorganisme sangat erat hubungannya dengan kesehatan manusia, beberapa diantaranya ada bermanfaat dan yang lain merugikan. Banyak penyakit manusia, hewan, dan, tumbuhan disebabkan oleh mikroba patogen seperti : jamur, bakteri, dan ganggang (Haryoto, 2013). Di Indonesia, penyakit infeksi masih merupakan masalah utama dibidang kesehatan. Bakteri merupakan suatu mikrooganisme yang dapat mudah tersebar dari satu inang yang terinfeksi kepada inang yang lainnya (Irianto, 2012). Beberapa diantara bakteri penyebab infeksi ialah Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis (Entjang, 2003). Pengobatan penyakit infeksi dibutuhkan suatu antibakteri untuk menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri tersebut (Pratiwi, 2008). Pemanfaatan bahan alam sebagai zat aktif pembunuh bakteri merupakan salah satu alternatif untuk menghambat atau membunuh bakteri dengan harga terjangkau (Widjajanti, 1999). Tanaman buni (Antidesma bunius (L.) Spreng) merupakan salah satu tanaman yang dimanfaat sebagai obat. Tanaman ini memiliki banyak peluang jika dilakukan penelitian dibidang kesehatan khususnya. Pada awalnya tanaman buni dianggap tidak bermanfaat sehingga kurang dibudidayakan dan dimanfaatkan, padahal tanaman ini memiliki beberapa aktifitas farmakologis. Terbukti dengan berbagai penelitian yang telah dilakukan terhadap tanaman buni sebagai anti ophidian (Binorkar et al., 2012), antidiabetes (Elya et al., 2012), antikanker (Micor et al., 2005), sitotoksik (Puspitasari et al., 2009), antikanker pada ekstrak etanol daun (Subarnas et al., 2012), buah sebagai antiradikal (Butkhup et al., 2011), pewarna makanan alami (Amelia et al., 2012). 2

5 Di masyarakat digunakan sebagai pengobatan tradisional seperti darah tinggi, jantung berdebar, dan sifilis (Wijayakusuma et al., 2002). Penelitian Habib et al., (2011) menunjukkan bahwa pada ekstrak metanol tanaman Antidesma ghaesembilla memiliki potensi pada beberapa bakteri seperti Salmonella typhi, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, dan Shigella dysenteriae menghasilkan zona hambat (0 sampai 17 mm) pada konsentrasi 400µg/disk sampai 1200µg/disk yang dibandingkan dengan kanamisin sebagai standar. Penelitian lain menunjukkan ekstrak akar Antidesma venosum mempunyai aktivtas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dengan Konsentrasi Hambat Minimal (KHM)) sebesar 0,0781 mg/ml dan terhadap Bacillus subtilis mempunyai KHM sebesar 0,1562 mg/ml (Mwangomo, 2012). Berdasarkan uraian tersebut daun Antidesma bunius berasal dari genus yang sama dengan Antidesma ghaesembilla dan Antidesma venosum yaitu Antidesma, yang membedakan yaitu speciesnya. Sehingga sangat memungkinkan kandungan dari fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun Antidesma bunius yang mirip dengan Antidesma ghaesembilla dan Antidesma venosum yang juga memiliki aktivitas antibakteri. Penelitian ini dimaksudkan untuk menguji aktivitas antibakteri fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni terhadap Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis serta bioautografinya. METODOLOGI PENELITIAN Alat dan Bahan 1. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat gelas, alat timbang, penangas air, corong Buchner (Stuart), batang pengaduk, autoklaf (China), oven (Memmert), Laminar Air Flow (Astari Niagara Internasional), lampu spritus (Bunsen), ose steril, mikropipet, yellow tips, blue tips, inkubator (Memmert), mikroskop, KCV, dan Evaporator 2. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak daun buni, bakteri Staphylococcus aureus diperoleh dari Fakultas Kedokteran UGM, bakteri 3

6 Bacillus subtilis diperoleh dari Fakultas Farmasi UGM, disk antibiotik (Oxoid), etanol 96%, akuades, Media Mueller Hinton (MH), Brain Heart Infusion (BHI), Manitol Salt Agar (MSA), cat Gram A, cat Gram B, cat Gram C, dan cat Gram D, DMSO, silika gel GF 254, Silika gel 60, n-heksan:etil asetat, dan peraksi semprot. Jalannya Penelitian 1. Fraksinasi dengan KCV Eluen terbaik yaitu kloroform-heksan-metanol. Perbandingan campuran pelarut disesuaikan dengan tingkat kepolaran senyawa seperti pada tabel 1. Tabel 1. Hasil Orientasi Pemilihan Eluen untuk proses KCV Pelarut Perbandingan Pelarut Banyaknya Elusi Kloroform:Heksan 6:4 2 kali Kloroform:Heksan 7:3 4 kali Kloroform:Heksan 8:2 3 kali Kloroform:Heksan 9:1 3 kali Kloroform:Etil asetat 8:2 2 kali Metanol 1 2 kali Pemasukan sampel ke dalam kolom KCV dilakukan tidak dalam bentuk larutan tetapi dalam bentuk teradsorpsi ke dalam silika gel 60. Untuk satu kali elusi dibutuhkan 200 ml dan hasil KCV ditampung dalam botol. Setelah penampungan selesai hasilnya diuji KLT. Dari pengamatan hasil uji KLT dapat dikelompokkan menjadi beberapa fraksi menurut pola kromatogram yang didapat. 2. Identifikasi Bakteri Identifikasi bakteri dilakukan pengecetan Gram A, B, C, dan D pada bakteri dan uji biokimiawi media MSA untuk Staphyloccus aureus dan media Simmon sitrat untuk Bacillus subtilis. 3. Uji Sensitivitas Sensitivitas dilakukan dengan menanam disk antibiotik ampisilin, eritromisin, vankomisin, dan kloramfenikol pada media yang telah diberi suspensi bakteri 4. Uji aktivitas antibakteri dengan metode Difusi sumuran Media MH sebanyak 20 ml dipadatkan pada cawan petri, kemudian dimasukkan 200 µl suspensi bakteri 1,5x10 8 CFU/mL dan diratakan menggunkan spreader glass. Pembuatan sumuran menggunakan cockborner yang sudah steril dengan diameter 7 mm. Masing-masing media terdapat 7 sumuran yang dimasukkan pada masing-masing lubang sebanyak 20 µl dengan seri konsentrasi 4

7 yaitu 1; 2; 3; 4; dan 5mg/sumuran, kontrol positif antibiotik yaitu streptomisin 0,25%, dan kontrol negatif pelarut DMSO 2,5%. Media yang telah mengalami perlakuan kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama jam dan diukur diameter zona hambatnya. 5. Uji Kromatografi Lapis Tipis Sampel yang berupa fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni ditotolkan pada lempeng plat KLT dan dibiarkan mengering. Setelah kering plat dimasukkan pada bejana kromatografi yang telah jenuh dengan fase gerak. Setelah elusi selesai, plat diambil dan dikeringkan sampai fase gerak yang ada pada plat menguap dan mengering. Plat KLT diambil dan diamati hasilnya pada UV 254 nm dan 366 nm kemudian bercak dideteksi dengan pereaksi semprot FeCl 3, sitroborat, Liebermann-Burchard, dan anisaldehid-asam sulfat. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Fraksinasi Fraksinasi dilakukan dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Vakum (KCV). Pada proses KCV menggunakan fase diam silika G 60 dan fase gerak gradien menggunakan gradien kepolaran bertingkat perbandingan kloform dengan heksan. Agar diperoleh hasil fraksinasi yang baik dilakukan optimasi fase gerak. Volume satu kali elusi adalah jumlah pelarut yang dipakai untuk mengisi volume kolom yang digunakan. Profil KLT diamati, fraksi yang mempunyai profil KLT yang sama dijadikan satu fraksi sehingga diperoleh fraksi nonpolar, semipolar dan polar. Hasil fraksi yang didapatkan dari 20 gram ekstrak seperti pada tabel 2. Hasil fraksinasi hanya ±50%, hal ini dikarenakan masih banyak ekstrak yang tertinggal pada kolom KCV. Tabel 2. Hasil Fraksinasi Berat Ekstrak Rendemen hasil fraksinasi Volume Pelarut yang difraksinasi Fraksi Nonpolar Fraksi Semipolar Fraksi Polar (g) (g) (g) (g) 200 ml 20 2,16 2,02 5,37 B. Identifikasi bakteri S.aureus dengan bentuk bulat bergerombol dan berwarna ungu sedangkan B.subtilis berbentuk batang dan berwarna ungu (Irianto, 2012). Hasil ini membuktikan adanya kesesuaian dengan teori bahwa bakteri uji merupakan 5

8 golongan bakteri Gram positif dengan ciri berwarna ungu yang disebabkan karena pada dinding sel bakteri Gram positif mengandung lebih banyak peptidoglikan yang kokoh, sehingga tidak dapat tercuci oleh alkohol sebab terbentuk kompleks kristal violet-iodin(pratiwi, 2008). Uji biokimia merupakan uji aktivitas enzim dari sel bakteri dan digunakan untuk mengetahui sifat bakteri terhadap berbagai macam zat. Uji biokimia pada S. aureus dengan metode uji manitol yaitu menggunakan media MSA menunjukkan perubahan warna merah menjadi kuning, hal tersebut terjadi karena bakteri mampu fermentasi mannitol (Kateete et al, 2010). Uji biokimiawi pada bakteri Bacillus subtilis menggunakan media simmon sitrat. Hasil penelitian media berubah warna dari hijau menjadi biru karena indikator bromtimol blue yang bereaksi dengan enzim bakteri sebagai sumber karbon sehingga ph media menjadi naik yang menyebabkan perubahan warna media dari hijau menjadi biru (Walkel and Hughes, 2010). C. Uji Sensitivitas Bakteri Uji sensitivitas dilakukan dengan media Mueler Hinton yang ditanami disk antibiotik. Tujuan uji sensitivitas yaitu untuk mengetahui sensitivitas bakteri uji yaitu Staphyloccus aureus dan Bacillus sublitis. Antibiotik yang digunakan yaitu ampisilin, eritromisin, vankomisin, dan kloramfenikol. Disk Antibiotik Vankomisin Kloramfenikol Eritromisin Ampisilin Tabel 3. Hasil Uji Sensitivitas Bakteri Staphyloccus aureus Bacillus subtilis Zona hambat Keterangan Zona hambat Keterangan (mm) (mm) 18±0,2 Sensitif 23±0,1 Sensitif 15±0,1 Sensitif 23±0,2 Sensitif 23±0,1 Sensitif 21±0,2 Sensitif 32±0,2 Sensitif 19±0,1 Sensitif Sensitivitas bakteri terhadap ampicillin dan vankomisin disebabkan antibiotik menghambat sintesis dinding sel sedangkan sensitivitas terhadap kloramfenicol dan eritromisin dikarenakan antibiotik menghambat sintesis protein (Tenover, 2006). 6

9 D. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Pada uji aktivitas antibakteri ini digunakan 7 sumuran yang masingmasing berisi 1 sumuran untuk kontrol negatif DMSO 2,5%, 1 sumuran untuk kontrol positif antibiotik streptomisin 0,25%, dan 5 sumuran digunakan untuk 5 seri konsentrasi yaitu 1; 2; 3; 4; dan 5mg/sumuran. Hasil yang didapatkan sebagai parameter uji aktivitas antibakteri yang berpotensi sebagai antibakteri yaitu dilihat dan diukur zona hambat disekitar sumuran yang dihasilkan dari masing-masing fraksi ekstrak setelah diinkubasi pada suhu 37 0 C selama jam. Tabel 4. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni terhadap Staphyloccus aureus dan Bacillus subtilis Bahan uji K + Fraksi Nonpolar Fraksi Semipolar Fraksi Polar K - Seri Konsentrasi (mg/sumuran) K + K - Seri Konsentrasi (mg/sumuran) K + K - Seri Konsentrasi (mg/sumuran) S. aureus (mm) , B. subtilis (mm) , Ket : K + yaitu Streptomisin o,25% b/v dan K- yaitu pelarut DMSO 2,5% Berdasarkan hasil uji aktivitas dengan metode difusi sumuran tidak menunjukkan kemampuan aktivitas antibakteri dari fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni karena pada semua konsentrasi fraksi yang digunakan sebaga uji tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphyloccus aureus dan Bacillus subtilis. Hal ini tidak sesuai dengan Antidesma ghaesembilla sebagai pembanding bahan uji yang mempunyai suku yang sama dengan Antidesma bunius. Menurut penelitian (Habib et al,2011) yang menggunakan ekstrak metanol Antidesma ghaesembilla memiliki potensi pada beberapa bakteri seperti Salmonella typhi dengan konsentasi 400µg/disk sudah mempunyai zona hambat sebesar 7 mm dan Bacillus cereus pada konsentrasi 400µg/disk juga mempunyai zona hambat sebesar 8 mm. Hal ini memungkinkan kandungan metabolit sekunder yang berpotensi sebagai antibakteri pada bahan uji ini lebih sedikit atau masih terkandung banyak pada fraksi polar yang masih tersisa pada kolom fraksinasi sehingga tidak mampu berpotensi sebagai antibakteri dan beberapa faktor lingkungan yang 7

10 mempengaruhi stabilitas senyawa aktif yaitu suhu, radiasi cahaya, udara (terutama oksigen, karbondioksida dan uap air) dan kelembaban. Faktor-faktor lain yang dapat mempengaruhi stabilitas, yaitu : ph 7,0, sifat air dan kondisi biotik, dan keberadaan bahan kimia lain yang merupakan kontaminan atau dari pencampuran produk yang berbeda secara aktif dapat mempengaruhi stabilitas senyawa aktif (Akhila et al, 2007). Selain itu kondisi lingkungan yang buruk dapat mempengaruhi produksi metabolit sekunder atau dipengaruhi pula oleh organisme asosiasi, seperti ancaman predator, makro dan mikroorganisme patogen, kompetisi ruang dan makanan (Nurfadilah, 2013). E. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Analisis kualitatif merupakan suatu cara yang bertujuan untuk mengetahui senyawa yang terdapat di dalam fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni menggunakan KLT dengan fase gerak yang telah didapakan pada tahap fraksinasi yaitu n-heksan:etil asetat (7:3) v/v. Plat kromatogram yang telah ditotol dengan larutan uji, dielusi dengan fase gerak lalu diamati bercaknya pada UV 254 nm dan UV 366 nm. Selanjutnya bercak dideteksi dengan pereaksi semprot FeCl 3, sitroborat, Liebermann-Burchard, dan anisaldehid-asam sulfat. Tabel 5. Hasil KLT fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak daun buni dengan fase gerak n-heksan : etil asetat (7:3) v/v dengan jarak pengembangan 6 cm Bercak sebelum disemprot Deteksi Perkiraan Senyawa Bercak Rf UV 254 UV 366 (flouresensi) FeCl 3 (Vis) Sitroborat (UV 366 nm) Anisal-dehid- H 2 SO 4 (UV 366 nm) Liebarmann- Burchard (UV 366 nm) Fraksi Nonpolar 1 0,38 - Ungu ,42 - Kuning ,45 - Biru - Kuning Biru - Flavonoid, terpenoid 4 0,48 - Biru ,5 - Merah Hitam Fenol 6 0,67 Pemadaman Ungu Hitam - - Merah muda Flavonoid, terpenoid 7 0,74 Pemadaman Orange Hitam Fenol 8 0,82 Pemadaman ,93 Pemadaman Fraksi Semipolar 1 0,38 - Biru - - Biru - Terpenoid 2 0,42 - Merah ,48 - Merah ,5 - Orange ,63 Pemadaman Merah Hitam Fenol 6 0,72 Pemadaman Merah ,8 Pemadaman - Hitam Fenol 8

11 Lanjutan (Tabel 5) Bercak sebelum disemprot Bercak Rf UV 254 UV 366 (flouresensi) FeCl 3 (Vis) Sitroborat (UV 366 nm) Deteksi Anisal-dehid- H 2 SO 4 (UV 366 nm) Liebarmann- Burchard (UV 366 nm) Perkiraan Senyawa Fraksi Polar 1 0,17 Pemadaman Merah ,25 Pemadaman Kuning ,38 Pemadaman Biru Hitam Kuning Biru - Flavonoid. Terpenoid, dan fenol 4 0,42 Pemadaman Merah ,45 - Coklat ,48 Pemadaman Merah muda Hitam Kuning - - Fenol, flavonoid 7 0,5 Pemadaman Orange Hitam - - Merah muda Terpenoid, Fenol 8 0,67 Pemadaman Merah Hitam Fenol 9 0,74 Pemadaman Coklat Hitam Fenol KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan: Senyawa fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni (Antidesma bunius L.Spreng) yaitu flavonoid, fenol dan terpenoid tidak mempunyai aktivitas sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis Saran: Perlu dilakukan uji aktivitas antibakteri dengan metode dan kadar yang berbeda pada fraksi nonpolar,semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni (Antidesma bunius L.Spreng) terhadap Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis. DAFTAR ACUAN Akhila JS, Shyamjith, Deepa, Alwar MC Acute toxicity studies and determination of median lethal dose. Science 93(7): Binorkar,V, Sandeep., and Jani, K, Dilip., 2012, Profile Of Medicinal Plants With Anti Ophidian Property, Journal of Pharmaceutical and Scientific Innovation, 1(5), Butkhup L., Samappito S, 2011, Changes in physico-chemical properties, Polyphenol compounds and antiradical Activity during development and ripening Of maoluang (Antidesma bunius l. Spreng) fruits, Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 19(1), Elya, B., Malik, A., and Septi, M., Purwa, I., 2012, Antidiabetic Activity Test by Inhibition of α- Glucosidaseand Phytochemical Screening from the Most Active Fraction of Buni (Antidesma bunius L.) Stem Barks and 9

12 Leaves. International Journal of PharmTech Research, 4(4), Habib, Md, Razibulah., Md, Mominur, R., Kaiser, H., Md, Obayed, Raihan., Mohammed, Aktar, Sayeed, 2011, Advances in Natural and Applied Sciences, 5(2), Mwangomo, Denis, Thobias., Moshi, Mainen, Julius., & Magadula, Joseph, Jangu., Antimicrobial Activity and Phytochemical Screening Of Antidesma venosum Root and Steam Bark Ethanolic Extract, International Journal of Reseach in Phytochemistry and Pharmacology, 2(2), Micor JRL, Deocaris C & Mojica E, 2005, Biological Activity of Bignay (Antidesma bunius (L.) spreng) Crude Extract in Artemia salina, Journal Medical Scientist, 5 (3), Haryoto, 2013, Teknik Uji Hayati Untuk Pengembangan Obat (TUHPO), 18, Kartasura, Fairuz Media. Irianto, K., 2012, Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme, 76-77, Bandung, Yrama Wigya. Kateete, David.P., Kimani,Cyrus.N., Katabazi,Fred, A., Okeng,Alfred., Okee,Moses, S., Nanteza,Ann., Joloba,Moses.L.,dan Florence C Najjuka., 2010,Identification of Staphylococcus aureus: Dnase and Mannitol salt agarnimprove the efficiency of the tube coagulase test, Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 9(23), 1-7. Nurfadilah, 2013, Uji Bioaktifitas Antibakteri Ekstrak Dan Fraksi Lamun Dari Kepulauan Spermonde, Kota Makassar, Skripsi, Fakultas Ilmu Kelautan Dan Perikanan, Universitas Hasanuddin Makassar. Pratiwi, T. S., 2008, Mikrobiologi Farmasi, Jakarta, Erlangga. Puspitasari, E., dan Ulfa, E,U., 2009, Uji Sitotoksisita Ekstrak Metanol Buah Buni (Antidesma bunius (L) Spreng) terhadap Sel Hela, Jurnal Ilmu Dasar, 10(2), Subarnas, A., Diantini, A., Abdulah,R., Zuhrotum, A., Yamazaki,C., Nakazawa, Mintao., dan Koyama, Hiroshi., 2012, Antiproliferative activity of primates-consumed plants against MCF-7 human breast cancer cell lines, Journal of Medical Research, 1(4), Tenover, Fred, C., 2006, Mechanisms of Antimicrobial Resistance in Bacteria, The American Journal of Medicine,119 (6A),

13 Wagner, H., Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis:A Thin Layer Chromatography Atlas, Second Edition, 359, 362, 364, New York, Springer. Walker, G.M., and Hughes, P.S., Distilled Spirits, New Horizons: Energy, Enviroment, and Enligtenment, 197, Nottingham, Nottingham University Press. Wijayakusuma, MH., Dalimarta,S., & Wirian,AS, 2002, Tanaman Berkhasiat Obat di Indonesia Jilid IV, 56, Jakarta, Pustaka Kartini. 11